Remodelling of oxidative energy metabolism by galactose improves glucose handling and metabolic switching in human skeletal muscle cells

Cultured human myotubes have a low mitochondrial oxidative potential. This study aims to remodel energy metabolism in myotubes by replacing glucose with galactose during growth and differentiation to ultimately examine the consequences for fatty acid and glucose metabolism. Exposure to galactose showed an increased [14C]oleic acid oxidation, whereas cellular uptake of oleic acid uptake was unchanged. On the other hand, both cellular uptake and oxidation of [14C]glucose increased in myotubes exposed to galactose. In the presence of the mitochondrial uncoupler carbonylcyanide p-trifluormethoxy-phenylhydrazone (FCCP) the reserve capacity for glucose oxidation was increased in cells grown with galactose. Staining and live imaging of the cells showed that myotubes exposed to galactose had a significant increase in mitochondrial and neutral lipid content. Suppressibility of fatty acid oxidation by acute addition of glucose was increased compared to cells grown in presence of glucose. In summary, we show that cells grown in galactose were more oxidative, had increased oxidative capacity and higher mitochondrial content, and showed an increased glucose handling. Interestingly, cells exposed to galactose showed an increased suppressibility of fatty acid metabolism. Thus, galactose improved glucose metabolism and metabolic switching of myotubes, representing a cell model that may be valuable for metabolic studies related to insulin resistance and disorders involving mitochondrial impairments

Modifisering av energimetabolisme i humane myotuber ved hjelp av galaktose

Sammendrag Humane myotuber i kultur har et lavt mitokondrielt oksidativt potensial. Derfor var det ønskelig å forsøke å modifisere cellenes energimetabolisme. Det finnes mange måter å påvirke myotubers energimetabolisme på. En metode er å bytte ut myotubenes energi-substrat. Det var derfor ønskelig å bytte ut glukose i myotubenes dyrkningsmedium med et annet monosakkarid, galaktose, og derved omgå Warburg-effekten. Warburg-effekten er et fenomen, som først ble observert i cancerceller, hvor celler benytter seg av aerob glykolyse istedenfor mitokondriell oksidativ fosforylering (OXPHOS), selv om oksygen er til stede. Galaktose metaboliseres til pyruvat i glykolysen, men gir ingen eller lavere produksjon av adenosintrifosfat (ATP). Cellene blir dermed tvunget til å benytte OXPHOS istedenfor glykolysen til å produsere den energien de trenger for å overleve. I denne masteroppgaven ble galaktose benyttet i cellenes vekstmedium, istedenfor glukose, og vi undersøkte hvordan galaktose påvirket myotubenes energimetabolisme. Levende bildebehandling av celler dyrket i galaktose viste en signifikant økning i mitokondriell masse og mengde lipiddråper sammenlignet med celler dyrket i glukose. Antall cellekjerner var signifikant redusert hos celler dyrket i galaktose sammenlignet med celler dyrket i glukose. Det var også av interesse å undersøke om galaktosebehandling medførte endringer på gen-nivå. Real-time PCR viste en nedregulering av myosin tungkjede I (MHC I), myosin tungkjede II (MHC II) og acyl-koenzym A dehydrogenase (MCAD), samt en oppregulering av genene karnitin palmitoyltransferase-1 (CPT1) og cytokrom C (CYC1) for celler dyrket i galaktose sammenlignet med celler dyrket i glukose. Oljesyre– og glukosemetabolisme hos celler dyrket i galaktose ble også undersøkt ved hjelp av radiomerkede substrater. OA oksidasjonen økte hos celler dyrket i galaktose. Dette stemte overens med den økningen i mRNA-nivå av CPT1 som ble observert i denne oppgaven. Forbehandling av celler med OA under proliferering og differensiering ga ingen tilleggseffekt på oljesyremetabolismen i galaktosebehandlede celler. Oksidasjonen av [U-14C]glukose økte hos celler dyrket i galaktose sammenlignet med celler dyrket i glukose. Forbehandling med oljesyre hos celler dyrket i galaktose økte også glukoseoksidasjon sammenlignet med celler dyrket i glukose (basal). Suppressibilitet er et begrep som benyttes in vitro for å beskrive i hvilken grad nærvær av glukose undertrykker fettsyreoksidasjon. Celler dyrket i galaktose så ut til å ha en økt suppressibilitet sammenlignet med celler dyrket i glukose. Dette er trolig positivt ved at cellene er mer metabolsk fleksible. Celler dyrket i galaktose så ut til å benytte seg i større grad av glukoseoksidasjon enn fettsyreoksidasjon når totaloksidasjon ble beregnet. Forbehandling med GW501516 (GW), en PPARδ agonist, i 2 dager så ut til å øke OA oksidasjon for celler dyrket i glukose, men denne effekten ble ikke observert i galaktosebehandlede celler. Fraksjonell OA oksidasjon så ut til å øke i glukosebehandlede celler, men det så ut til å være en redusert oljesyreoksidasjonen hos celler dyrket i galaktose. Glukoseoksidasjonen så ut til å være redusert hos celler dyrket i glukose etter forbehandling med GW, men ingen reduksjon i oksidasjon hos celler dyrket i galaktose. Myotubenes maksimale oksidasjonskapasitet ble undersøkt ved hjelp av karbonylcyanide p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) som frikobler elektrontransporten fra ATP-syntesen. Beregning av forskjellen mellom oksidasjon med FCCP til stede og basal oksidasjon tilsvarer reservekapasiteten. Celler som ble dyrket i galaktose så ut til å ha en redusert reservekapasitet for oljesyreoksidasjon etter akutt behandling med FCCP. Celler dyrket i galaktose benyttet seg av omtrent 70 % av maksimal OXPHOS, mens celler dyrket i glukose benyttet omtrent 40 %. Cellenes reservekapasitet for glukoseoksidasjon økte for celler dyrket i galaktose, også der hvor cellene hadde blitt forbehandlet med oljesyre og GW, i forhold til kontroll. Celler dyrket i galaktose benytter seg av omtrent 60 % av reservekapasiteten for glukoseoksidasjon, og celler dyrket i glukose benytter omtrent 40 %. I denne oppgaven viser vi at celler dyrket i galaktose blir mer oksidative, har økt mitokondriell masse, og har en økning i mRNA-nivåene av CYC1 og CPT1 sammenlignet med celler dyrket i glukose

Effect of galactose treatment on oleic acid metabolism.

<p>Myotubes were either grown in DMEM-media with 5.5 mM glucose or 5.5 mM galactose during the whole seeding period, or with 5.5 mM glucose during proliferation and 5.5 mM galactose during differentiation (Galactose_d). Thereafter, the cells were exposed to [1-¹⁴C]oleic acid (1 µCi/ml, 100 µM) for 4 h as described in Materials and Methods. The figures show cellular uptake (n = 6) (<b>A</b>), oxidation (n = 6) (<b>B</b>), % oxidized (CO₂/CA+CO₂) (n = 6) (<b>C</b>) and suppressibility (n = 3) (<b>D</b>) of [1-¹⁴C]oleic acid. Suppressibility, defined as the ability of the cells to decrease oleic acid oxidation by acutely added glucose, was calculated as: [(1-(oxidation of oleic acid at 5 mM glucose/oxidation of oleic acid at no glucose added))×100%]. Values represent means ± SEM. *<i>P</i><0.05 vs. glucose.</p

Effect of galactose treatment on glucose metabolism.

<p>Myotubes were grown in DMEM-media with 5.5 mM glucose or 5.5 mM galactose. Thereafter, the cells were exposed to [U-¹⁴C]glucose (1 µCi/ml, 100 µM) for 4 h as described in Materials and Methods. The figures show cellular uptake (n = 5–6) (<b>A</b>), oxidation (n = 5–6) (<b>B</b>) and reserve capacity (oxidation with FCCP (1 µM) – basal oxidation) (n = 3) (<b>C</b>) of [U-¹⁴C]glucose. Values represent means ± SEM. *<i>P</i><0.05 vs. glucose.</p