Influencia de los ritmos biológicos en la inmunidad de la mucosa intestinal

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017En mamíferos los ritmos circadianos están regulados por relojes moleculares alojados en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo. Señales del medioambiente como la luz y la dieta, entrenan el reloj en ciclos de 24 hs que regulan ritmos en sistemas periféricos y cuya alteración se asocia a patologías. En el presente trabajo de tesis hemos caracterizado la influencia de los ritmos biológicos en el funcionamiento de la inmunidad en la mucosa intestinal a lo largo del día. Más específicamente, hemos descripto algunos mecanismos que gobiernan la localización temporal de distintas poblaciones leucocitarias en sitios inductivos de la respuesta inmune como ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) y placas de Peyer (PP) y su impacto en fenómenos claves de la homeostasis como la tolerancia hacia antígenos provenientes de la dieta. Encontramos oscilaciones en poblaciones linfocitarias y en distintas subpoblaciones de células presentadoras de antígenos (CPA) a lo largo de un período de 24 hs que estuvieron relacionadas con cambios en los niveles de la quimiocina CCL21 producida en GLM así como con una expresión diferencial de moléculas como CD69 y CD62L. En simultáneo con las oscilaciones en las poblaciones, encontramos diferencias significativas en la producción de citoquinas anti- y pro-inflamatorias entre los períodos diurnos y nocturnos. Estudiamos también la capacidad de CPA obtenidas de vasos linfáticos aferentes a distintos tiempos de inducir células T regulatorias Foxp3+ y receptores homing sobre linfocitos CD4+, y encontramos diferencias significativas entre las fases de actividad/descanso de los animales. A nivel de sitios efectores encontramos cambios en las túnicas que componen las paredes intestinales a lo largo del día en condiciones estándares de luz/oscuridad que se vieron exacerbadas luego de la disrupción lumínica Estas condiciones también provocaron cambios en las poblaciones linfocitarias en GLM y PP. Tanto los cambios en las poblaciones como la capacidad de las CPAs de inducir Foxp3 o receptores homing se encontraron alterados en animales deficientes para el gen Per2, lo que muestra que se esta capacidad de las CPA depende de la integridad del reloj molecular. El hecho de que el ingreso a GLM de linfocitos y CPA esté sincronizado en un determinado tiempo del día sugiere que habría momentos en los que la probabilidad de que se induzca una respuesta inmune antígeno específica en la mucosa intestinal es mayor. Esta ventana temporal coincidiría con la masiva entrada de antígenos, durante el período de actividad e ingesta de los animales. Nuestros datos también demuestran que tiempos tempranos en el proceso de activación linfocitaria, sería crucial en la generación y tipo de las respuesta inmunes adaptativas en intestino. Evaluando la respuesta adaptativa específica para ovoalbúmina (OVA) en modelos de tolerancia observamos que la ingesta del antígeno durante la fase oscura tardía induce menores índices de proliferación que cuando la ingesta del antígeno ocurre durante la fase lumínica tardía. Más aún, en ensayos de inducción de poblaciones efectoras y regulatorias, la administración diaria de OVA al final de la fase oscura (ZT23) resultó en una inducción significativamente mayor del factor de transcripción Foxp3 en células OVA específicas (CD4+ OT-II+) y la localización selectiva de estas células en la lámina propia. Nuestros resultados muestran que en un período de 24 hs, en el GLM existe una ventana temporal determinada en la que confluyen sincronizadamente una serie de condiciones que promueven el desarrollo de respuestas tolerogénicas que son esenciales para la homeostasis intestinal.Fil: Barrios, Bibiana E. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Fil: Correa, Silvia Graciela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.Fil: Correa, Silvia Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.Fil: Motran, Claudia Cristina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.Fil: Motran, Claudia Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.Fil: Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Fil: Contin, María Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.Fil: Lorenzo, Alfredo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina.Fil: Anzulovich Miranda, Ana Cecilia. Universidad Nacional de San Luis; Argentina.Fil: Anzulovich Miranda, Ana Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas de San Luis; Argentina

Vancomycin-induced gut microbial dysbiosis alters enteric neuron-macrophage interactions during a critical period of postnatal development

Vancomycin is a broad-spectrum antibiotic widely used in cases of suspected sepsis in premature neonates. While appropriate and potentially lifesaving in this setting, early-life antibiotic exposure alters the developing microbiome and is associated with an increased risk of deadly complications, including late-onset sepsis (LOS) and necrotizing enterocolitis (NEC). Recent studies show that neonatal vancomycin treatment disrupts postnatal enteric nervous system (ENS) development in mouse pups, which is in part dependent upon neuroimmune interactions. This suggests that early-life antibiotic exposure could disrupt these interactions in the neonatal gut. Notably, a subset of tissue-resident intestinal macrophages, muscularis macrophages, has been identified as important contributors to the development of postnatal ENS. We hypothesized that vancomycin-induced neonatal dysbiosis impacts postnatal ENS development through its effects on macrophages. Using a mouse model, we found that exposure to vancomycin in the first 10 days of life, but not in adult mice, resulted in an expansion of pro-inflammatory colonic macrophages by increasing the recruitment of bone-marrow-derived macrophages. Single-cell RNA sequencing of neonatal colonic macrophages revealed that early-life vancomycin exposure was associated with an increase in immature and inflammatory macrophages, consistent with an influx of circulating monocytes differentiating into macrophages. Lineage tracing confirmed that vancomycin significantly increased the non-yolk-sac-derived macrophage population. Consistent with these results, early-life vancomycin exposure did not expand the colonic macrophage population nor decrease enteric neuron density in CCR2-deficient mice. Collectively, these findings demonstrate that early-life vancomycin exposure alters macrophage number and phenotypes in distinct ways compared with vancomycin exposure in adult mice and results in altered ENS development

Immune neuroendocrine phenotypes in Coturnix coturnix: Do avian species show LEWIS/FISCHER-like profiles?

Immunoneuroendocrinology studies have identified conserved communicational paths in birds and mammals, e.g. the Hypothalamus-Pituitary-Adrenal axis with anti-inflammatory activity mediated by glucocorticoids. Immune neuroendocrine phenotypes (INPs) have been proposed for mammals implying the categorization of a population in subgroups underlying divergent immune-neuroendocrine interactions. These phenotypes were studied in the context of the LEWIS/FISCHER paradigm (rats expressing high or low pro-inflammatory profiles, respectively). Although avian species have some common immunological mechanisms with mammals, they have also evolved some distinct strategies and, until now, it has not been studied whether birds may also share with mammals similar INPs. Based on corticosterone levels we determined the existence of two divergent groups in Coturnix coturnix that also differed in other immune-neuroendocrine responses. Quail with lowest corticosterone showed higher lymphoproliferative and antibody responses, interferon-γ and interleukin-1β mRNA expression levels and lower frequencies of leukocyte subpopulations distribution and interleukin-13 levels, than their higher corticosterone counterparts. Results suggest the existence of INPs in birds, comparable to mammalian LEWIS/FISCHER profiles, where basal corticosterone also underlies responses of comparable variables associated to the phenotypes. Concluding, INP may not be a mammalian distinct feature, leading to discuss whether these profiles represent a parallel phenomenon evolved in birds and mammals, or a common feature inherited from a reptilian ancestor millions of years ago

Analysis of molecular mediators in divergent Low and High CORT groups.

<p>Effect of the aggrupation dependent on the basal levels of CORT on the expression of two pro-inflammatory (IFN-γ and IL-1β, panels A and B) and two anti-inflammatory mediators (IL-13 and 4, panels C and D). Data are adjusted means (number inside bars) ± SE. Number of birds per group = 10. Different letters indicate significant (<i>p</i> < 0.05) differences between groups. The relative expression of each target gene was calculated using the formula: Gene Level = 2^{-(Target Gene Ct – β-Actin Ct)}. The value obtained was then multiplied by 1x10⁸ in order to fit the scale of the graphs.</p

Exploration of data variability.

<p>Principal Component Analysis Bi-plot graph. Each dot represents an animal in the study and triangles represent the explanatory variables used in the analysis. Full white dots (○) and full black dots (●) represent extreme low and high CORT birds respectively. The eigenvalues of each PC are shown in brackets next to each component.</p

Immune effector analysis in divergent Low and High CORT groups.

<p>Correlation plots between CORT and lymphoproliferative response to PHA-P, antibody response against SRBC and FLD are presented in panels A, C and E. Effect of the aggrupation dependent on the basal levels of CORT on immune effectors is shown in panels B (lymphoproliferative response to PHA-P), D (antibody response against SRBC) and F (FLD). Data are means (number inside bars) ± SE. Number of birds per group = 10. Different letters indicate significant (<i>p</i> < 0.05) differences between groups. FLD number was calculated using the following formula: FLD = number of granulocytes/(number of lymphocytes + number of monocytes).</p

Spearman correlation analysis between CORT and molecular immuno-neuroendocrine mediators.

<p>*, r value significant at p < 0.01. The r values for every variable where obtained from 20 birds.</p><p>Spearman correlation analysis between CORT and molecular immuno-neuroendocrine mediators.</p

Pearson correlation analysis between CORT and immunity effectors.

<p>* and **, r value significant at p < 0.05 and 0.01 respectively. The r values for every variable where obtained from 60 birds.</p><p>Pearson correlation analysis between CORT and immunity effectors.</p

Determination of divergent basal CORT level groups.

<p>Low and High CORT animals grouped based on their CORT level. Birds belonging to the High CORT group have 2.7-fold higher CORT concentrations than their Low CORT counterparts. Data are means ± SE. Different letters indicate significant (<i>p</i> < 0.05) differences between groups. Number of birds in the study = 60, number of birds per group = 10.</p

Schematic conceptual representation of INPs in <i>Coturnix coturnix</i>.

<p>The variables set to determine the existence of avian INPs in the present study are represented around each bird. The size of the variable indicates if the animals show high or low response in each of the parameters in the INPs. LYMPH: lymphoproliferative response to PHA-P; Ab SRBC: antibody response against SRBC; FLD: frequency of leukocyte distribution; level of expression of mediators: IFN-γ and IL-1β (pro-inflammatory); and IL-4 and 13 (anti-inflammatory). "Fischer-like" quail with high CORT levels also manifest high FLD and IL-13, but low LYMPH, Ab SRBC, IFN-γ and IL-1β levels. "Lewis-like" counterparts have low CORT as well as low FLD and IL-13 responses, but high LYMPH, Ab SRBC, IFN-γ and IL-1β responses. These two extreme groups of birds do not differ in their IL-4 level.</p