Mechanismen der Pasteurella multocida Toxin vermittelten Modulation des Osteoimmunsystems

Das Pasteurella multocida Toxin (PMT) ist ein Virulenzfaktor, der von Pasteurella multocida Bakterien sezerniert wird um Zielzellen intrazellulär modifizieren zu können. PMT wirkt auf das Skelettsystem infizierter Tiere ein und ist besonders in der Schweinezucht als Auslöser der atrophischen Rhinitis gefürchtet. PMT verschiebt das Gleichgewicht des physiologischen Knochenumbaus auf die Seite einer Netto-Negativbilanz, indem es sowohl die Funktion von Osteoblasten hemmen, als auch die Funktion von Osteoklasten fördern kann. Über die detaillierten Mechanismen, wie genau PMT die Differenzierung von Osteoklasten stimuliert, ist noch nicht so viel bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass klassische Vorläufer wie Makrophagen unter PMT Stimulation zu Osteoklasten differenzieren können. Es zeigte sich, dass PMT die sechs bislang bekannten Haupt-Schlüsselsignalwege der Osteoklastogenese NFATc1, NF-kappa B, Akt, JNK, ERK und p38 aktivieren kann. Auf der Suche nach Gemeinsamkeiten und Unterschieden zwischen der klassischen M-CSF/RANKL- und der Toxin-stimulierten Osteoklastendifferenzierung, wurde das Proteom von Zellen, die auf den Toxin-vermittelten Differenzierungsweg festgelegt worden waren, mit dem von Zellen verglichen, die alternativ das klassische Osteoklasten-Differenzierungsprogramm mit M-CSF/RANKL eingeleitet hatten. Dabei konnten viele differentiell regulierte Proteine mit Bezug zum Prozess der Osteoklastendifferenzierung gefunden werden, die durch zukünftige Analysen weitere wertvolle Erkenntnisse zum Vorgang der PMT-stimulierten Osteoklastogenese liefern könnten. Die Proteom-Daten führten auch zu der Erkenntnis, dass die PMT-stimulierte Osteoklastendifferenzierung von der Aktivierung des mTOR-Signalweges abhängig ist. Als zugrundeliegender Mechanismus konnte eine mTOR-stimulierte Aktivierung der P70s6K1 gezeigt werden, die über die Inhibition eines Repressors der Osteoklastogenese, dem PDCD4, für die PMT-stimulierten Effekte verantwortlich sein könnte. Als Folge führt dies zu der mTOR-abhängigen Aktivierung von c-jun und somit zu einer AP-1 induzierten initialen Induktion von Osteoklasten-spezifischen Genen nach PMTStimulation. Der zweite Teil der Arbeit bezieht sich auf eine Publikation, in der zuvor gezeigt werden konnte, dass die PMT-stimulierte Osteoklastendifferenzierung B-Zell-abhängig ist. Es sollte untersucht werden, welche Rolle dabei den B-Zellen in der PMT-induzierten Osteoklastogenese zukommt. Dabei zeigte sich, dass mit dem Pan-B-Zellmarker CD45R aufgereinigte Zellen in vitro als direkte Vorläufer für eine PMT-stimulierte Differenzierung von Osteoklasten eingesetzt werden können. Darüber hinaus wiesen diese mit PMT terminal differenzierten Osteoklasten sowohl Merkmale von Plasmazellen, wie die Expression des Markers Syndecan-1 und die Sekretion von löslichem IgM, als auch spezifische Marker für Osteoklasten, wie die Expression des Enzymes TRAP und Multinuklearität auf. Letztlich konnte allerdings durch die Daten der vorliegenden Arbeit nicht zweifelsfrei final bewiesen werden, ob B-Zellen tatsächlich Vorläuferzellen für die PMT-stimulierte Differenzierung sind, da eine geringe Menge an kontaminierenden Zellen nicht komplett eliminiert werden konnte

Pasteurella multocida toxin- induced osteoclastogenesis requires mTOR activation

Background: Pasteurella multocida toxin (PMT) is a potent inducer of osteoclast formation. Pigs suffering from an infection with toxigenic Pasteurella multocida strains develop atrophic rhinitis characterised by a loss of turbinate bones and conchae. However, on the molecular level the process of bone loss remains largely uncharacterised. Results: Recently it was found that PMT activates the serine/threonine kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) in fibroblasts. Using RAW264.7 macrophages, we investigated the role of the mTOR complex 1 (mTORC1) in PMT-mediated osteoclast formation. PMT induces the differentiation of RAW264.7 macrophages into multinucleated, tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) positive osteoclasts that are capable to resorb bone. In the presence of the mTORC1 inhibitor rapamycin, PMT was significantly less able to induce the formation of TRAP-positive osteoclasts. Accordingly, the resulting resorption of bone was strongly reduced. A major target of mTOR is the 70 kDa ribosomal protein S6 kinase 1 (p70 S6K1). Activated p70 S6K1 decreases the expression of programmed cell death protein 4 (PDCD4), a negative transcriptional regulator of osteoclastogenesis, at the protein and gene level. Ultimately this results in the activation of c-Jun, a component of the activator protein 1 (AP-1) complex, which is a major transcription factor for the induction of osteoclast-specific genes. We now demonstrate that c-Jun and its downstream target, the osteoclast-specific bone degrading protease cathepsin K, are upregulated upon PMT treatment in an mTOR-dependent manner. Conclusions: Activation of mTOR signalling plays a central role in the formation of osteoclasts through the bacterial toxin PMT. On the molecular level, PMT-induced activation of mTOR leads to down regulation of PDCD4, a known repressor of AP-1 complex, culminating in the activation of c-Jun, an essential transcription factor for triggering osteoclastogenesis

Pasteurella multocida toxin- induced osteoclastogenesis requires mTOR activation

Background Pasteurella multocida toxin (PMT) is a potent inducer of osteoclast formation. Pigs suffering from an infection with toxigenic Pasteurella multocida strains develop atrophic rhinitis characterised by a loss of turbinate bones and conchae. However, on the molecular level the process of bone loss remains largely uncharacterised. Results Recently it was found that PMT activates the serine/threonine kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) in fibroblasts. Using RAW264.7 macrophages, we investigated the role of the mTOR complex 1 (mTORC1) in PMT-mediated osteoclast formation. PMT induces the differentiation of RAW264.7 macrophages into multinucleated, tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) positive osteoclasts that are capable to resorb bone. In the presence of the mTORC1 inhibitor rapamycin, PMT was significantly less able to induce the formation of TRAP-positive osteoclasts. Accordingly, the resulting resorption of bone was strongly reduced. A major target of mTOR is the 70 kDa ribosomal protein S6 kinase 1 (p70 S6K1). Activated p70 S6K1 decreases the expression of programmed cell death protein 4 (PDCD4), a negative transcriptional regulator of osteoclastogenesis, at the protein and gene level. Ultimately this results in the activation of c-Jun, a component of the activator protein 1 (AP-1) complex, which is a major transcription factor for the induction of osteoclast-specific genes. We now demonstrate that c-Jun and its downstream target, the osteoclast-specific bone degrading protease cathepsin K, are upregulated upon PMT treatment in an mTOR-dependent manner. Conclusions Activation of mTOR signalling plays a central role in the formation of osteoclasts through the bacterial toxin PMT. On the molecular level, PMT-induced activation of mTOR leads to down regulation of PDCD4, a known repressor of AP-1 complex, culminating in the activation of c-Jun, an essential transcription factor for triggering osteoclastogenesis

Signaling Cascades of Pasteurella multocida Toxin in Immune Evasion

toxin

Additional file 1: Figure S1. of Pasteurella multocida toxin- induced osteoclastogenesis requires mTOR activation

SiRNA-mediated knock-down of PDCD4. PDCD4 siRNA transfection was performed according to the manufacturer’s protocol. Transfected cells were lysed 48 h after transfection and β-actin was used as a loading control (n = 2). (JPEG 244 kb