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4Pi-konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit 1-Photonen-Anregung
Die 4Pi-konfokale Laserrastermikroskopie besitzt im Vergleich zu herkömmlichen konfokalen Mikroskopen eine 4- bis 7-fach höhere axiale Auflösung. Bisher war sie jedoch auf die problembehaftete 2-Photonen-Anregung (aufwĂ€ndig, erhöhtes Photobleichen) beschrĂ€nkt, da nur so eine lĂŒckenlose Abdeckung des Raumfre- quenzspektrums durch die optische Transferfunktion (OTF) realisierbar schien. In dieser Arbeit wird die Eignung der 1-Photonen-Anregung in der 4Pi-Mikroskopie theoretisch und experimentell untersucht. Es wird gezeigt, dass im 4Pi-Typ C- Modus, der sowohl die Interferenz des Anregungs- als auch des Detektionslichts von beiden Objektiven nutzt, bei gleichzeitiger Optimierung von Stokes-Shift, Loch- blendengröĂe und Objektiv-Ăffnungswinkel die OTF lĂŒckenlos abgedeckt werden kann. Ebenso werden Pupillenfilter untersucht und angegeben, die zur GlĂ€ttung der OTF fĂŒhren. Die artefaktfreien Bilder biologischer Strukturen, die mit ei- nem strahlrasternden 4Pi-Typ C-Mikroskop aufgenommen wurden, zeigen eine axiale Auflösung von 70 - 95 nm, was einer Steigerung von 30% gegenĂŒber ty- pischen 2-Photonen-Typ A-Aufnahmen entspricht. ZusĂ€tzlich ermöglicht dieses 4Pi-Mikroskop, die axiale Position einzelner Objekte genauer zu bestimmen. Eine Lokalisierungsgenauigkeit von ca. 2 nm wird zur Vermessung der AbstĂ€nde se- kretorischer Granula zur neuroendokrinen Plasmamembran genutzt und eröffnet neue AnsĂ€tze zur Erforschung des Fusionsprozesses intrazellulĂ€rer Membranen
Continuous-wave spontaneous lasing in mercury pumped by resonant two-photon absorption
The first continuous-wave two-photon absorption laser-induced stimulated
emission (CTALISE) is demonstrated. The 7^1S-6^1P transition in mercury at
1014nm wavelength is used and selective lasing of different isotopes is
observed.Comment: 3 pages, 5 figure
In vivo Mechanismen des axonalen Kalziumeinstroms im Tiermodell der Multiplen Sklerose
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine entzĂŒndliche Erkrankung des zentralen Nervensystems, die in Deutschland eine PrĂ€valenz von knapp 300 pro 100.000 Einwohner aufweist und am hĂ€ufigsten Frauen im Alter von 20-40 Jahren betrifft. Lange Zeit wurde die Demyelinisierung als wichtigster Faktor der Pathophysiologie der MS erachtet. Allerdings haben Forschungsarbeiten in den vergangenen Jahren immer deutlicher gezeigt, dass die irreversible SchĂ€digung von Axonen von entscheidender Bedeutung fĂŒr das AusmaĂ der dauerhaften Behinderung von MS-Patienten ist. Trotz intensiver BemĂŒhungen sind die Prozesse, die zum Verlust von Axonen fĂŒhren, bislang nur unzureichend verstanden. Besonders in der chronisch progredienten Phase der Erkrankung, die sich bei der Mehrheit der Patienten im Krankheitsverlauf entwickelt, stehen die neurodegenerativen Aspekte im Vordergrund. WĂ€hrend in den vergangenen Jahren mehrere, in erster Linie immunmodulatorisch wirksame Medikamente zur Behandlung der schubförmigen MS zugelassen wurden, sind die Behandlungsmöglichkeiten der chronisch progredienten MS immer noch stark limitiert. Es ist daher von hoher Relevanz, die der axonalen SchĂ€digung zugrundeliegenden AblĂ€ufe möglichst detailliert zu verstehen, um daraus in der Zukunft erfolgversprechende neuroprotektive TherapieansĂ€tze ableiten zu können.
Die Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das am weitesten verbreitete Tiermodell der MS in Ratten und MĂ€usen und hat trotz aller Limitationen wertvolle Erkenntnisse zur Pathogenese der MS geliefert. Aus diesem Modell wurde eine Vielzahl an Hypothesen zur Pathophysiologie der axonalen Degeneration im Kontext autoimmunentzĂŒndlicher ZNS-Erkrankungen abgeleitet. In unserem Labor konnte vor einigen Jahren der Prozess der axonalen SchĂ€digung im Rahmen der EAE mittels in-vivo Mikroskopie in Echtzeit im intakten Gewebe untersucht werden. Dieser Prozess der sogenannten fokalen axonalen Degeneration (FAD) lĂ€sst sich auch durch exogene reaktive Sauerstoff- (ROS) und Stickstoffspezies (RNS) induzieren und Ă€hnliche VerĂ€nderungen finden sich ebenfalls in Hirnautopsien von MS-Patienten. In Vorarbeiten zu der hier vorliegenden Arbeit konnte mittels in-vivo 2-Photonen-Kalziummikroskopie weiterhin gezeigt werden, dass Axone in akuten EAE-LĂ€sionen oftmals eine erhöhte intrazellulĂ€re Kalzium (Ca2+)-Konzentration aufweisen und dass diese Störung der Ca2+-Homöostase ein wichtiger Indikator dafĂŒr ist, ob ein Axon im weiteren zeitlichen Verlauf einen irreversiblen Degenerationsprozess durchlĂ€uft oder ob es der entzĂŒndlichen SchĂ€digung widerstehen kann. Zur in-vivo 2-Photonen-Ca2+-Mikroskopie werden bei uns im Labor transgene MĂ€use verwendet, die unter Kontrolle des neuronenspezifischen Promoters Thy-1 einen FRET-basierten, ratiometrischen Ca2+-Sensor exprimieren. Nachdem aber bislang kein Auslöser dieser pathophysiologisch relevanten Erhöhung der intraaxonalen Ca2+-Konzentration identifiziert werden konnte, befasste ich mich in der hier vorliegenden Arbeit mit der Frage, ob es im Rahmen der akuten EntzĂŒndungsreaktion durch die Produktion von ROS/RNS zu einer oxidativen SchĂ€digung der axonalen Zellmembran kommt und ob diese zu einer nachweisbaren Störung der MembranintegritĂ€t fĂŒhrt. Hierzu entwickelte ich einen neuartigen Versuchsaufbau, bei dem ich verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe intrathekal bei gesunden und akut an EAE erkrankten MĂ€usen injizierte. Dadurch gelang es mir zu zeigen, dass es im Rahmen der akuten EAE zu einer axonalen Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen als Hinweis auf MembranlĂ€sionen kommt und dass diese mit dem AusmaĂ der morphologischen SchĂ€digung zusammenhĂ€ngt, aber nicht zwangslĂ€ufig eine Demyelinisierung voraussetzt. Durch die Kombination von in-vivo 2-Photonen-Ca2+-Mikroskopie und intrathekaler Farbstoffinjektion konnte ich nachweisen, dass Axone mit einer erhöhten Ca2+-Konzentration signifikant hĂ€ufiger farbstoffpositiv sind als Axone mit einer physiologisch niedrigen Ca2+-Konzentration. Es liegt also der Schluss nahe, dass die MembranlĂ€sionen eine mögliche Ursache fĂŒr die Störung der axonalen Ca2+-Homöostase sein könnten
Cooperative 4Pi excitation and detection yields sevenfold sharper optical sections in live-cell microscopy
Zeitzeug*innen im GesprÀch 15: Winfried Bewersdorf: Mitschriften der Arbeitsstelle PÀdagogische Lesungen
A compact, multi-pixel parametric light source
The features of a compact, single pass, multi-pixel optical parametric
generator are discussed. Several hundreds of independent high spatial-quality
tunable ultrashort pulses were produced by pumping a bulk lithium triborate
crystal with an array of tightly focussed intense beams. The array of beams was
produced by shining a microlenses array with a large pump beam. Overall
conversion efficiency to signal and idler up to 30% of the pump beam has been
reported. Shot-to-shot energy fluctuation down to 3% was achieved for the
generated radiation.Comment: 11 pages, 6 figures, submitted to "Optics Communications
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