Viabilidade de espermatozóides bovinos colhidos de epidídimos mantidos em temperatura ambiente de 18-20ºC

Orientador : Prof. Dr. Romildo Romualdo WeissDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 07/03/2012Bibliografia: fls.69-76Área de concentração: Biotecnologia e Reprodução AnimalResumo: A recuperação de espermatozóides do epidídimo de animais mortos é uma alternativa viável para preservar o material genético de animais valiosos ou de espécies ameaçadas de extinção. Os objetivos desse estudo foram verificar a viabilidade de espermatozóides colhidos da cauda de epidídimos mantidos em temperatura ambiente de 18-20°C, comparar os espermatozoides colhidos do epidídimo com os colhidos por eletroejaculação e avaliar o tempo de resistência em 5°C pós-coleta. Dez pares de testículos de touros da raça Tabapuã (Bos taurus indicus) foram obtidos por orquiectomia, e armazenados por 6 (G6), 12 (G12), 18 (G18), 24 (G24) e 30 (G30) horas em temperatura ambiente de 18-20°C antes da coleta dos espermatozóides da cauda do epidídimo por fluxo retrógrado. Sete dias antes da orquiectomia dos touros o sêmen foi colhido por eletroejaculação para comparação. Os parâmetros avaliados foram: motilidade espermática, vigor, concentração, porcentagem de espermatozóides morfologicamente deformados e porcentagem de defeitos de acrossoma. Os espermatozóides do epidídimo e do ejaculado foram avaliados e em seguida preservados em refrigeração (5°C) até que a motilidade fosse ? 30%. O parâmetro espermático mais afetado pelo tempo pós-orquiectomia foi a motilidade que apresentou uma queda significativa (p<0,05) para o G30. Os espermatozóides colhidos do epidídimo apresentaram menor motilidade, menor vigor e maior percentual de defeitos morfológicos que os espermatozoides colhidos por eletroejaculação. Houve uma queda pouco expressiva no vigor e aumento dos defeitos morfológicos com a progressão no tempo antes da coleta dos espermatozoides do epidídimo, entretanto a integridade do acrossoma não variou entre os grupos. A refrigeração do sêmen a 5°C conservou os espermatozóides viáveis por 15 a 40,8 horas pós-coleta. Concluiu-se que é possível recuperar espermatozóides viáveis com 41,25% de motilidade da cauda de epidídimo de touros quando armazenados em temperatura ambiente por 30 horas, além disso, os espermatozoides do epidídimo diferem dos do ejaculado apresentando menor motilidade e vigor e maior número de defeitos morfológicos, e a conservação em 5°C manteve os espermatozoides com motilidade mínima de 30 % por 15 a 40,8 horas pós-coleta permitindo a conservação em curto prazo dos gametas.Abstract: Post-mortem spermatozoa recovery is a viable alternative to preserve genetic material from valuable animals or endangered species. The aim of this study were to determine the viability time of spermatozoa stored in the cauda epididymis of Tabapuã bulls (Bos taurus indicus) at room temperature of 18-20°C, compare the spermatic parameters (motility, vigor, morphological defects in spermatozoa and acrosome defects) of spermatozoa collected from the caudal epididymal with those obtained by electro-ejaculation method, as well as assessing the resistance time of the spermatozoa when stored at 5°C post-collection. For this purpose, ten pairs of testes from Tabapuã bulls (Bos taurus indicus) were obtained by orquiectomy and stored for 6 (G6), 12 (G12), 18 (G18), 24 (G24) and 30 (G30) hours on room temperature of 18-20°C, before the spermatozoa recovery by retrograde flushing. Seven days before the orquiectomy, the semen was collected by electro-ejaculation method. The parameters evaluated were: sperm motility, vigor, concentration, sperm morphology and acrosome defects. The spermatozoa from the epididymis and the ejaculate were evaluated and then preserved in refrigeration (5°C). Sperm motility showed a significant decrease (p<0.05) when spermatozoa were stored for 30 hours in the epididymis. The spermatozoa from the epididymis showed low sperm motility, vigor and higher percentage of morphological defects than spermatozoa from ejaculation. There was a little expressive reduction in vigor and increased of morphological defects with storage time, but the acrosome integrity was not affected. The cold storage (5°C) maintained sperm viable for 15 to 40.8 hours. We conclude that is possible to recovery viable sperm with 41.25% of motility from epididymis stored at room temperature of 18-20°C for 30 hours. The epididymal spermatozoa differs from the ejaculated spermatozoa which represent greater motility (p<0.05) and less amount of total morphological defects, and conservation at 5°C maintained sperm motility at least 30% for 15 to 40.8 hours post-collection allowing temporary preservation of gametes

Potencial de fertilização in vitro e in vivo de espermatozoides bovinos criopreservados de epidídimos mantidos até 30 horas em temperatura ambiente (18-20ºC)

Orientador : Prof. Dr. Romildo Romualdo WeissTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 03/03/2016Inclui referências : fÁrea de concentração: Biotecnologia agroalimentarResumo: Os objetivos desse estudo foram: comparar as dimensões do epidídimo, a biometria testicular e a viabilidade dos espermatozoides recuperados da cauda de epidídimos direitos e esquerdos de touros zebuínos, determinar a eficácia de dois diluentes comerciais na criopreservação e avaliar a capacidade de fertilização dos espermatozoides do epidídimo, na produção in vitro de embriões (PIVE) e na inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Após orquiectomia de dez touros da raça Tabapuã, as dimensões e peso testiculares foram aferidos e os espermatozoides recuperados por fluxo retrógrado após permanecerem 6, 12, 18, 24 e 30 horas na cauda dos epidídimos (n=20) em 19 ± 1°C. Em seguida, foram avaliados os seguintes parâmetros espermáticos: motilidade, vigor, concentração e morfologia, e os resultados comparados entre os obtidos dos epidídimos direitos e esquerdos. Para criopreservação utilizou-se dois diluentes comerciais: Botubov® (BB) e Bovimix® (BV). Os parâmetros espermáticos pós-descongelamento foram determinados no CASA (computer-assisted sperm analysis) e por análises microscópicas (integridade de membranas plasmáticas e acrossomal e morfologia). Doses de espermatozoides do epidídimo (G6, G12, G18, G24 e G30), e do ejaculado criopreservadas com o diluente BB, foram utilizadas na fertilização in vitro (FIV) de oócitos obtidos em abatedouro. O cultivo in vitro (CIV) dos embriões manteve-se por oito dias e a taxa de clivagem (dia três), a taxa de blastocistos (dia sete e oito) e a taxa de eclosão (dia oito) foram determinadas para cada grupo. O número total de células embrionárias foi definido. Dez doses criopreservadas do grupo que permaneceu mais tempo na cauda do epidídimo após orquiectomia (G30) foram utilizadas na inseminação artificial em tempo fixo de dez novilhas da raça Tabapuã. Os softwares JMP v.15 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA) e o Statgraphics® Centurion XVI foram utilizados para estatística. Utilizou-se nível de significância (p0,05). Em todos os grupos foi possível produzir embriões viáveis in vitro. O número de blastocistos, e a taxa de eclosão são menores conforme aumenta o tempo de exposição à temperatura ambiente dos espermatozoides na cauda do epidídimo. Quando testados in vivo, os espermatozoides do G30, com apenas 5,2% de motilidade progressiva, estavam aptos a fecundar, obtendo-se o resultado satisfatório de uma prenhez. Conclui-se que, os dois testículos e epidídimos são semelhantes em morfologia e características espermáticas, BB e BV podem ser utilizados na criopreservação de espermatozoides do epidídimo e é possível produzir embriões in vitro até o estágio de blastocisto eclodido e uma gestação após IATF a partir de espermatozoides bovinos criopreservados quando recuperados da cauda de epidídimos mantidos em temperatura ambiente de 18 à 20°C, até 30 horas pós-orquiectomia. Palavras-chave: espermatozoides, epidídimo, criopreservação, FIV, IATFAbstract: The aims of this study were: to compare the epididymis dimensions, testis size and viability of recovered spermatozoa from right and left epididymis of Zebu bulls, to determine the efficacy of two commercial extenders in cryopreservation and assess the fertilizing capacity on in vitro embryo production and fixed time artificial insemination (FTAI) of sperm from the epididymis. After orchiectomy of ten Tabapuã bulls, the dimensions and testicular weight were measured. The sperm were recovered by retrograde flow after remaining for 6, 12, 18, 24 and 30 hours at room temperature (19 ± 1°C) on the epididymal tail (n=20). The following sperm parameters were evaluated: motility, vigor, concentration and morphology, and the results compared between right and left testicle. For cryopreservation, two commercial extenders were used: Botubov® (BB) and Bovimix® (BV). The post-thaw sperm parameters were determined with CASA (computer-assisted sperm analysis) and microscopic analyzes for assessing the integrity of cell and acrosomal membranes, and sperm morphology. Cryopreserved doses (G6, G12, G18, G24 e G30) with BB diluent, from the epididymis and electroejaculation of the same bulls, have been used in vitro fertilization (IVF) of oocytes obtained from a slaughterhouse. After fertilization, the in vitro culture (IVC) of the embryos was maintained for eight days. The cleavage rate (day three), blastocyst rate (day seven and eight) and hatching rate (day eight) were determined for each group. The total number of cells of embryos has been set. Ten doses of cryopreserved sperm from the group that remained more time in the epididymal tail after orchiectomy (G30) were used in fixed time artificial insemination of ten Tabapuã heifers. The software JMP v.15 and the Statgraphics® Centurion XVI were used for statistical analysis. For all analyzes, significance level was (P0.05). In all groups it was possible to produce viable embryos in vitro. The number of blastocyst and hatching rates are lower with increasing time of exposure of the spermatozoa to room temperature. When tested in vivo, the sperm of G30, with only 5.2% of progressive motility, were able to fertilize, resulting in one successful pregnancy. In conclusion both testicles and epididymides are similar in morphology and sperm characteristics, BB and BV may be used for cryopreservation of epididymal bull sperm and it is possible to produce embryos (blastocyst) in vitro and a pregnancy after FTAI from cryopreserved bull spermatozoa after recovery from the tail of epididymis kept at room temperature of 18 to 20°C until 30 hours. Keywords: spermatozoa, epididymis, cryopreservation, IVF, FTA

COMPARISON OF LONG-TERM PROGESTERONE-BASED PROTOCOL ON REPRODUCTIVE PERFORMANCE OF PREPUBERTAL AND PUBERTAL BEEF HEIFERS.

The aim of this study was to investigate estrus synchronization in prepubertal and pubertal heifers (crossbred ½ Nelore x Red Angus - commercial herd) submitted to a long-term progesterone-based protocol for timed artificial insemination (TAI), as well as overall pregnancy rates. Four hundred forty-seven heifers underwent ultrasound examination of the ovaries and were assigned to one of 3 groups: (1) prepubertal heifers (PPNS; n = 114) with ovarian follicles 8 mm in diameter and/or a CL that underwent the same protocol as PPTAI heifers. Overall pregnancy rate was determined by transrectal ultrasonography on d 45 after NS or TAI. Data were analyzed using the FREQ procedure of SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC). Pregnancy rates were as follows: 20.1% in PPNS, 37.0% in PPTAI, and 48.5% in PTAI (P < 0.05). In conclusion, TAI after estrus synchronization with a hormonal protocol using EB and ECP in prepubertal and pubertal heifers resulted in higher pregnancy rates than prepubertal heifers exposed to natural service, and exposure of prepubertal heifers to a long-term progesterone-based protocol effectively synchronized estrus

CARACTERÍSTICAS BIOMÉTRICAS E PARÂMETROS ESPERMÁTICOS DE TESTÍCULOS E EPIDÍDIMOS DIREITOS E ESQUERDOS DE TOUROS ZEBUÍNOS

A capacidade reprodutiva de touros é um dos principais fatores que interfere no ganho em produtividade e consequentemente no sucesso da bovinocultura de corte. Os objetivos do estudo foram: comparar os testículos e epidídimos direitos e esquerdos de touros, quanto à dimensão, peso e parâmetros espermáticos, e verificar a correlação entre o peso do testículo e a reserva espermática no epidídimo. Dez touros da raça Tabapuã com idade entre 36 e 84 meses, foram castrados para obtenção e mensuração das estruturas do aparelho sexual externo, e posterior colheita de espermatozoides diretamente da cauda do epidídimo por fluxo retrógrado. O comprimento, largura e altura testicular foram semelhantes (P>0,05). Em relação aos parâmetros espermáticos, os valores médios encontrados para os lados direito e esquerdo foram, respectivamente: motilidade total 63,5 e 62,5%, vigor 4,6 e 4,5, total de defeitos morfológicos 14,7 e 16,8% e concentração por mL de 243,75x106 e 254,25x106, não diferindo entre si (P>0,05). Ocorreu correlação negativa, moderada e não significativa (r=0,20; P>0,05) entre a concentração espermática e o peso testicular. Concluímos que ambos os testículos e epidídimos de um bovino possuem dimensões e peso semelhantes e mantêm uma produção de gametas com motilidade, vigor, morfologia e concentração similares

Timed artificial insemination (TAI) based on CIDR first, second or third use in Bos indicus cows

The study aimed to verify the effects of CIDR (P4) first, second or third use on PR in protocols for TAI. Five hundred and forty-seven Nelore cows were divided: CIDR1 (CIDR first use; n=196); CIDR2 (second use; n=188) and CIDR3 (third use; n=163). All animals were submitted to the same protocol: day 0(d0), 2mg EB+CIDR1, CIDR2 or CIDR3, according the CIDR use; d9, CIDR removal + 12.5 dinoprost thrometamin+0.6mg ECP + 48 hours calf removal; d11, TAI + return of the calves to dams. The overall pregnancy rate (PR) was 63.8, 53.7 and 27.0% for CIDR1, CIDR2, and CIDR3, respectively. Differences in the PR were observed between: CIDR1 and CIDR2 (P=0.04); CIDR1 and CIDR3 (P=0.0001); and CIDR2 and CIDR3 (P=0.0001). The open days (OD) in post partum and body condition score (BCS) resulted in differences (P<0.05) among groups. There was a correlation between open days in CIDR 1 and 2 versus BCS, as well as between BCS of the CIDR 1 and 3 against PR In conclusion, CIDR1 showed better reproductive efficiency than CIDR2 and CIDR3 use. Differences were observed between the groups in regard to DO, and by cows submitted to CIDR earlier in the postpartum period having a lower PR than those submitted at a later time. A BCS of 3.1 resulted in a higher PR than those with 3.5 and 3.7.

TAXA DE GESTAÇÃO EM NOVILHAS NELORE SINCRONIZADAS PARA IATF E INSEMINADAS COM SÊMEN RESFRIADO E CONGELADO

O presente estudo teve como objetivos: comparar as taxas de prenhez após a inseminação artificial em tempo fixo com sêmen resfriado a 5ºC ou congelado a -196ºC, avaliar a relação entre taxas de prenhez e o diâmetro do folículo pré-ovulatório em novilhas Nelore, verificar a influência dos níveis de cortisol na taxa de prenhez e a eficácia do acetato de deslorelina como indutor da ovulação. Para isso, 96 novilhas foram divididas em dois grupos, G1 (n=47) e G2 (n=49) e inseminadas com sêmen resfriado e congelado, respectivamente. O protocolo utilizado foi: Dia 0 (D0) = BE + implante auricular de P4; D8 = retirada do implante + PGF2α + eCG; D10 = acetato de deslorelina; D11 = IATF. Para avaliar a correspondência dos níveis de cortisol sérico com a prenhez foram feitas análises através do Teste de ELISA por competição. O sêmen foi coletado de um único touro da raça Nelore, por meio de eletroejaculação, e dividido em duas frações, acrescentando diluente à base de gema de ovo, com crioprotetor (para G1), e sem crioprotetor (para G2) e em seguida foi realizado o envase em palhetas de 0,5 mL, com 30 milhões de espermatozoides viáveis por palheta. Não houve diferença (p≥0,05) entre a taxa de gestação do grupo G1(48,94%) e G2(46,94%). Houve diferença estatística (P<0,05) entre os diâmetros de folículos pré-ovulatórios de G1 e G2, mas não houve relação desse parâmetro com a porcentagem de gestações entre os grupos. Níveis altos de cortisol foram detectados. Concluiu-se que não houve diferença na taxa de gestação entre novilhas inseminadas com sêmen resfriado e com sêmen congelado, que não há relação do diâmetro dos folículos pré-ovulatórios e dos níveis séricos de cortisol com as taxas de prenhez, e que o acetato de deslorelina é eficaz como indutor de ovulação em novilhas Nelore

EFICIÊNCIA DA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQÜINA (eCG) E DO DESMAME TEMPORÁRIO (DT) EM PROTOCOLOS PARA A INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF) EM VACAS NELORE, PREVIAMENTE TRATADAS COM PROGESTERONA(P4) E BENZOATO DE ESTRADIOL (BE).

O objetivo do estudo foi checar a eficiência reprodutiva da eCG e do desmame temporário em protocolos para IATF em vacas Nelore pluríparas, previamente tratadas com progesterona intravaginal e benzoato de estradiol (BE). Foram utilizadas 343 animais, com ECC médio de 2,65 (1=magra; 5= gorda), no período pós parto (media 51,9 dias), e divididas em dois grupos(G): GeCG (grupo gonadotrofina coriônica eqüina; n=144) recebeu no dia 0 (d0) 0,558 g de P4 + 1,0 mg de BE; em d8 (remoção da P4 + 0,075 mg de PGF2 alfa+1,5 mg de cipionato de estradiol–ECP + 400UI de eCG); em d10 execução da IATF; o GDT (grupo desmame temporário; n=199) o mesmo que GeCG  sem eCG no d8, e com desmame temporário por 48 horas e retorno dos bezerros às mães no dia da IATF(d10). A taxa de prenhez (TP) à IATF, após 35 dias resultou em 59,0 e 63,3 % respectivamente para os GeCG e GDT ( P>0,05) e a TP  à  IATF + o repasse com touros, em 90,9 e 95,9 % (P=0,056), após 90 dias de estação de monta. Concluiu-se que ambos os protocolos mostraram-se eficientes em fazendas comerciais de bovinos de corte, enfatizando-se a utilização do DT onde haja facilidade de manejo

EFEITO DA DEXAMETASONA NA FERTILIDADE DO TOURO

A fertilidade de reprodutores bovinos é a condição essencial para o progresso genético e alta produtividade animal, podendo ser afetada por diversas patologias testiculares e pelo uso de alguns medicamentos de ação sistêmica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da administração de dexametasona sobre o comportamento sexual, parâmetros espermáticos e dosagem de testosterona sérica de touros. Foram utilizados 6 touros com idade em torno dos 5 anos e escore de condição corporal semelhante, os quais foram divididos em dois grupos, controle (n=3) e tratado (n=3). O experimento foi dividido em dois períodos, preliminar e experimental, com duração de 18 semanas. Após a padronização das características avaliadas durante o período preliminar, os animais do grupo tratado receberam doses diárias de 20mg de dexametasona intramuscular durante 5 dias. Foram analisados e comparados os dados obtidos nos dois períodos para ambos os grupos. As características avaliadas foram: comportamento sexual, volume, pH e concentrações de frutose e ácido cítrico do ejaculado, motilidade progressiva, turbilhonamento, vigor, concentração, morfologia espermática e dosagem de testosterona plasmática. Dos parâmetros avaliados, houve diferença significativa (P<0,5) somente na dosagem de testosterona sérica

EJACULAÇÃO INDUZIDA EM TOURO (BOS TAURUS INDICUS) POR ESTIMULAÇÃO MANUAL DO PÊNIS

Este trabalho tem por objetivo descrever a coleta de sêmen por estimulação manual do pênis em touro. Foi utilizado um touro da raça Nelore de 96 meses de idade não condicionado para nenhum método de coleta de sêmen. A técnica desenvolvida consistiu em massagem da região perineal até que o animal apresentasse ereção, seguida de pressão na glande até que o animal respondesse com movimentos de fricção. Durante a propulsão, o corpo do pênis era segurado e pressionado com os dedos, e o copo coletor era posicionado na extremidade livre do pênis para coleta do ejaculado. Após o condicionamento do animal, pelo período de três meses, foram coletados cinco ejaculados em intervalos regulares para avaliação macro e microscópica e pH. Todas as amostras apresentaram aspecto cremoso e branco. O volume médio foi de 6,5 ± 1,17ml, a motilidade progressiva média 83 ± 4,47%, o vigor 5, o turbilhonamento 5, o pH 6,05 ± 0,09, a concentração espermática 1,475x109 ± 0,32x109 por ml, o número total de espermatozoides 9,87x109 ± 3,64x109 por ejaculado e a média de espermatozoides anormais totais foi de 9,6 ± 2,07%. O tempo médio de duração das coletas foi de 176,2 ± 12,93 segundos. A partir da análise dos resultados, conclui-se que a estimulação manual do pênis pode representar uma alternativa para a coleta de sêmen no touro