Electrogenic amino acid exchange via the rBAT transporter

AbstractA cDNA clone was isolated from rabbit renal cortex using DNA-mediated expression cloning, which caused alanine-dependent outward currents when expressed in Xenopus oocytes. The cDNA encodes rBAT, a Na-independent amino acid transporter previously cloned elsewhere. Exposure of cDNA-injected oocytes to neutral amino acids led to voltage-dependent outward currents, but inward currents were seen upon exposure to basic amino acids. Assuming one charge/alanine, the outward current represented 38% of the rate of uptake of radiolabelled alanine, and was significantly reduced by prolonged preincubation of oocytes in 5 mM alanine. The currents were shown to be due to countertransport of basic amino acids for external amino acids using the cut-open oocyte system. This transport represents a major mode of action of this protein, and may help in defining a physiological role for rBAT in the apical membrane of renal and intestinal cells

Interaction of mannose-6-phosphate with the hysteretic transition in glucose-6-phosphate hydrolysis in intact liver microsomes

AbstractWe showed previously that glucose-6-phosphatase activity was characterised in intact liver microsomes by a hysteretic transition between a rapid and a slower catalytic form of the enzyme. We have now further investigated the substrate specificity of these two kinetic forms. It was found that the pre-incubation of intact microsomes with mannose-6-phosphate or glucose-6-phosphate (50 μM for 30 s) suppressed the burst in glucose-6-phosphatase activity, that the hysteretic transition was reversible and that mannose-6-phosphate inhibited glucose-6-phosphate hydrolysis during the first seconds of incubation, but not anymore after the burst. Our results indicate (i) that mannose-6-phosphate is recognised by the enzyme and can promote the hysteretic transition and (ii) that the transient phase is part of the catalytic mechanism itself

Utilisation de la culture organotypique de jejunum de souris pour l'étude du renouvellement des composants protéiques et enzymatiques des membranes des bordures en brosse intestinales

L'étude du renouvellement des composants protéiques et de certaines enzymes de la MBB intestinale en particulier a été entreprise au niveau du jéjunum de souris dans un système de culture organotypique. L'absence de facteurs exogènes (sécrétions pancréatiques et biliaires) qui ont été impliqués dans ce renouvellement, un contrôle possible de l'environnement cellulaire par le choix de milieux de culture et de la participation de la desquamation dans ce renouvellement, et une meilleure accessibilité des marqueurs au niveau de chaque cellule sont autant d'éléments qui justifient l'objet d'une telle étude in vitro. Deux approches différentes ont été envisagées, à savoir l'étude de l'incorporation d'acides aminés radioactifs dans les différents constituants protéiques et enzymatiques des MBB d'une part, et l'analyse cinétique de l'évolution des activités enzymatiques en culture d'autre part. La première approche est essentiellement négative dans ses conclusions. La complexité des pools précurseurs, l'état non stationnaire des surfaces membranaires en culture et la localisation multiple de certaines activités enzymatiques sur gels de polyacrylamide rendent une mesure de la vitesse de synthèse des différents constituants protéiques et enzymatiques de la MBB sans valeur. En outre, l'importance des réutilisations isotopiques qui s'ajoute aux raisons précédentes rendent inadéquates l'étude de la dégradation en culture par les techniques de chasse ou de double marquage. Qualitativement, il apparaît toutefois que les mêmes composants protéiques et enzymatiques sont synthétisés et relâchés dans les milieux pendant 24 heures de culture au moins. La seconde approche s'avère plus fructueuse. L'analyse des cinétiques de l'évolution des différentes activités enzymatiques en culture, couplée à la résolution d'un modèle, permet en effet d'apporter les points suivants: 1) Il n'y a pas de dégradation des enzymes de la MBB en culture organotypique et la vitesse de synthèse de chacune d'elle peut être estimée directement et son évolution suivie par l'accumulation totale des activités (explants + milieux). Cette conclusion infirme l'hypothèse d'un relâchement bidirectionnel des enzymes de la MBB. 2) Le relâchement des différentes enzymes de la MBB relève de deux mécanismes complémentaires. Le premier fait intervenir une solubilisation différentielle des activités mais sa nature exacte ne peut être précisée. Le second fait intervenir une vésiculation des microvillosités dont l'importance in vivo serait dans la conciliation d'une synthèse membranaire unitaire avec un relâchement hétérogène

Utilisation de la culture organotypique de jejunum de souris pour l'étude du renouvellement des composants protéiques et enzymatiques des membranes des bordures en brosse intestinales

L'étude du renouvellement des composants protéiques et de certaines enzymes de la MBB intestinale en particulier a été entreprise au niveau du jéjunum de souris dans un système de culture organotypique. L'absence de facteurs exogènes (sécrétions pancréatiques et biliaires) qui ont été impliqués dans ce renouvellement, un contrôle possible de l'environnement cellulaire par le choix de milieux de culture et de la participation de la desquamation dans ce renouvellement, et une meilleure accessibilité des marqueurs au niveau de chaque cellule sont autant d'éléments qui justifient l'objet d'une telle étude in vitro. Deux approches différentes ont été envisagées, à savoir l'étude de l'incorporation d'acides aminés radioactifs dans les différents constituants protéiques et enzymatiques des MBB d'une part, et l'analyse cinétique de l'évolution des activités enzymatiques en culture d'autre part. La première approche est essentiellement négative dans ses conclusions. La complexité des pools précurseurs, l'état non stationnaire des surfaces membranaires en culture et la localisation multiple de certaines activités enzymatiques sur gels de polyacrylamide rendent une mesure de la vitesse de synthèse des différents constituants protéiques et enzymatiques de la MBB sans valeur. En outre, l'importance des réutilisations isotopiques qui s'ajoute aux raisons précédentes rendent inadéquates l'étude de la dégradation en culture par les techniques de chasse ou de double marquage. Qualitativement, il apparaît toutefois que les mêmes composants protéiques et enzymatiques sont synthétisés et relâchés dans les milieux pendant 24 heures de culture au moins. La seconde approche s'avère plus fructueuse. L'analyse des cinétiques de l'évolution des différentes activités enzymatiques en culture, couplée à la résolution d'un modèle, permet en effet d'apporter les points suivants: 1) Il n'y a pas de dégradation des enzymes de la MBB en culture organotypique et la vitesse de synthèse de chacune d'elle peut être estimée directement et son évolution suivie par l'accumulation totale des activités (explants + milieux). Cette conclusion infirme l'hypothèse d'un relâchement bidirectionnel des enzymes de la MBB. 2) Le relâchement des différentes enzymes de la MBB relève de deux mécanismes complémentaires. Le premier fait intervenir une solubilisation différentielle des activités mais sa nature exacte ne peut être précisée. Le second fait intervenir une vésiculation des microvillosités dont l'importance in vivo serait dans la conciliation d'une synthèse membranaire unitaire avec un relâchement hétérogène

Reduction of an Eight-State Mechanism of Cotransport to a Six-State Model Using a New Computer Program

A computer program was developed to allow easy derivation of steady-state velocity and binding equations for multireactant mechanisms including or without rapid equilibrium segments. Its usefulness is illustrated by deriving the rate equation of the most general sequential iso ordered ter ter mechanism of cotransport in which two Na1 ions bind first to the carrier and mirror symmetry is assumed. It is demonstrated that this mechanism cannot be easily reduced to a previously proposed six-state model of Na1-D-glucose cotransport, which also includes a number of implicit assumptions. In fact, the latter model may only be valid over a restricted range of Na1 concentrations or when assuming very strong positive cooperativity for Na1 binding to the glucose symporter within a rapid equilibrium segment. We thus propose an equivalent eight-state model in which the concept of positive cooperativity is best explained within the framework of a polymeric structure of the transport protein involving a minimum number of two transport-competent and identical subunits. This model also includes an obligatory slow isomerization step between the Na1 and glucose-binding sequences, the nature of which might reflect the presence of functionally asymmetrical subunits

A Mechanical Force Contributes to the “Osmotic Swelling” of Brush-Border Membrane Vesicles

Brush-border membrane vesicles and an osmotic swelling assay have been used extensively to monitor the pore-forming activity of Bacillus thuringiensis toxins. After a hypertonic shock, Manduca sexta midgut brush-border membrane vesicles shrink rapidly and reswell partially to a volume that depends on membrane permeability and toxin concentration rather than regaining their original volume as expected from theoretical models. Because efflux of buffer from the vesicles, as they shrink, could contribute to this phenomenon, vesicles were mixed with a hypertonic solution of the buffer with which they were loaded. Under these conditions, they are not expected to reswell, since the same solute is present on both sides of the membrane. Nevertheless, with several buffers, vesicles reswelled readily, an observation that demonstrates the involvement of an additional restoration force. Reswelling also occurred when, in the absence of toxin, the buffers were replaced by glucose, a solute that diffuses readily across the membrane, but did not occur with rat liver microsomes, despite their permeability to glucose. Unexpected swelling was also observed with rabbit jejunum brush-border membrane vesicles, suggesting that the cytoskeleton, present in brush-border membrane vesicles but absent from microsomes, could be responsible for the restoration force