5 research outputs found
Laminin-332 coordinates mechanotransduction and growth cone bifurcation in sensory neurons
Molekulare Marker der Mechanorezeptoren und potenzielle Moleküle zur Steuerung der Mechanotransduktion
In somatosensory perception the neurons of the dorsal root ganglia (DRG) are
the first responders to the different types of stimuli applied on the skin,
and a specific type of stimulus also activates a specific subtype of sensory
afferents. Genetic labelling of DRG cell subtypes allows their identification
in vivo and in vitro providing a unique opportunity to study the physiology of
these cells and could give insights into what makes them modality specific.
The first part of this study aimed to use the promoter of the T-type calcium
channel subunit 3.2 (Cav3.2) as a molecular marker for the mechanical ultra
sensitive subpopulation of DRG cells, the putative D-hair receptors. Using a
knock-in approach two mouse strains were produced. The first strain expresses
the GFP protein under the promoter of the Cav3.2 ion channel (Cav3.2GFP).
Characterization of the Cav3.2GFP knock-in mouse using immunofluorescence
analysis showed that the promoter of the Cav3.2 ion channel is strongly
activated in the hippocampus in the brain of adult mice. In addition, the
activity of the Cav3.2 ion channel promoter in the DRG was also determined in
development. Analysis of GFP expression using immunofluorescence, Western blot
and qPCR, showed that GFP protein can be detected at stage E9.5 in some cells
of the neuronal crest. At stage E13.5 few GFP+ cells are observed in the DRG,
and at stage E18.5 GFP is expressed in 7% of the cells of the DRG.
Characterization of sensory afferent subtypes at E18.5 using
immunofluorescence showed that GFP+ cells co-stained with TrkB and TrkC and
only few GFP+ cells were TrkA positive. The second strain expresses the CRE
recombinase under the promoter of the Cav3.2 ion channel (Cav3.2Cre). Breeding
of the Cav3.2Cre mouse with the reporter line Tau(mGFP) permited the analysis
of innervation of the sensory end organs in the skin. GFP+ afferents in
Cav3.2Cre; Tau(mGFP) animals innervated hair follicles and Meissner
corpuscles, but not Merkel cells. The GFP signal in Cav3.2Cre; Tau(mGFP)
animals was sufficient for visualization of GFP+ DRG cells in vitro so that
electrophysiological characterization of GFP+ DRG cells in cell culture was
possible. Whole-cell current clamp recordings showed that about 50% of GFP+
DRG cells have action potential with characteristics of mechanoreceptors and
that the other 50% of GFP+ DRG cells showed action potential with
characteristics of nociceptors. Although the Cav3.2 promoter did not show high
expression specificity only for D-hair receptors as expected, the strains
generated are still very useful tools to study the physiology of cells
expressing this subtype of T-type calcium channel and its role in those cells.
In contrast to the large body of information regarding the physiological and
anatomical properties of primary afferents and despite the extensive efforts
to identify mechanotransduction genes in mammals, the molecular components of
the transduction complex in DRG are still elusive. In mice only the stomatin-
like protein-3 (SLP-3) has been shown to be essential for touch sensation. In
the second part of this work I screened for a 100 nm long tether protein shown
previously in my laboratory to be involved in mechanotransduction by
connecting the transduction channel to the extracellular matrix. The tether
protein is expressed in DRG but not in SCG, binds to laminin and is cleaved by
furing proteinase. A pre-selection of candidate proteins to tether protein
were made using a Phython script to search for proteins with a furin cleavage
site in the mouse genome. Subsequently the expression of these proteins was
determined in DRG vs. SCG using qPCR, and from this analysis only six proteins
were selected as potential candidates. Using microcontact printing, it was
shown that six tether protein candidates localized to neurites growing on
laminin but not on neurites growing on laminin-332. After immunogold labeling
and transmission electron microscopy (TEM) of the six protein candidates only
two proteins remain promising candidates for the tether protein.Primär sensorische Neurone, deren Zellkörper in den dorsalen Wurzelganglien
liegen, sind die ersten Neurone, die Informationen ueber verschiedene
Stimulationen der Haut weiterleiten. Dabei führt ein spezifischer Stimulus zur
Aktivierung eines spezifischen Subtyps dieser sensorischen Afferenzen. Mit
Hilfe genetischer Marker können die verschiedenen Nervenzelltypen in vitro und
in vivo in den dorsalen Wurzelganglien identifiziert werden. Dies ermoeglicht
die Untersuchung der Physiologie und der Spezifizität der Modalität dieser
Zellen. Im ersten Teil dieser Studie wurde der Promotor des T-Typ Kalzium-
Kanals der Untereinheit 3.2 (Cav3.2) als molekularer Marker für putative
D-Haarrezeptoren, die sensitivste Subpopulation mechanischer Zellen der
dorsalen Wurzelganglien, verwendet. Zwei knock-in Mausstämme wurden in dieser
Studie generiert. Der erste Mausstamm exprimiert grün fluoreszierendes Protein
(GFP) unter Kontrolle des Promotors des Cav3.2 Ionenkanals (Cav3.2GFP). Durch
immunohistochemische Charakterisierung des Cav3.2GFP knock-in Mausstamms
konnte gezeigt werden, dass im Hippocampus adulter Mäuse der Promotor des
Cav3.2 Ionenkanals sehr stark aktiviert ist. Zusätzlich wurde die Aktivität
des Promotors für den Cav3.2 Ionenkanal im Laufe der Entwicklung bestimmt.
Durch die Analyse der GFP-Expression mittels Immunofluoreszenz, Western Blot
und qPCR konnte gezeigt werden, dass GFP während des Embryonalstadiums E9,5 in
einigen Zellen der Neuralleiste exprimiert wird. Im Embryonalstadium E13,5
konnten nur wenige GFP+ Zellen in den dorsalen Wurzelganglien lokalisiert
werden, während im Embryonalstadium E18,5 GFP in 7 % der Zellen der dorsalen
Wurzelganglien detektiert werden konnte. Die immunzytochemische
Charakterisierung verschiedener Subtypen sensorischer Afferenzen hat gezeigt,
dass die GFP+ Zellen positiv für TrkB (Mechanorezeptoren) und TrkC
(Propriozeptoren) waren und nur wenige positiv für TrkA (Nozizeptoren). Im
zweiten Mausstamm wird die Cre-Rekombinase unter Kontrolle des Promotors des
Cav3.2 Ionenkanals (Cav3.2Cre) exprimiert. Durch die Kreuzung der Cav3.2Cre
Maus mit der Reportermaus Tau(mGFP) konnte die Innervierung der putativen
D-Haarrezeptoren in den Sinnesendorganen der Haut untersucht werden. Eine
Innervierung mit GFP+ Afferenzen konnte in Haarfollikeln und Meissner-
Körperchen, jedoch nicht in Merkel-Zellen nachgewiesen werden. Des Weiteren
wurden die Zellen der dorsalen Wurzelganglien der Cav3.2Cre; Tau(mGFP) Maus
primaer kultiviert und die GFP+ Zellen elektrophysiologisch charakterisiert.
In Patch-Clamp- Messungen, durchgefuehrt in der Ganz-Zell-Konfiguration,
konnte gezeigt werden, dass 50 % der GFP+ Zellen Aktionspotentiale
charakteristisch für Mechanorezeptoren und 50 % solche charakteristisch für
Nozizeptoren erzeugen. Obwohl der Cav3.2 Promotor wider Erwarten nicht
spezifisch in D-Haarrezeptoren exprimiert wird, sind die generierten
Mausstämme für Untersuchungen der Physiologie dieses T-Typ Kalziumkanals
nuetzlich. Heute existiert ein breites Wissen über die physiologischen und
anatomischen Eigenschaften der primären Afferenzen und in der experimentellen
Forschung wurden große Anstrengungen zur Identifizierung der an der
Mechanotransduktion beteiligten Gene in Säugern unternommen. Jedoch konnten
die molekularen Komponenten des Transduktionskomplexes der dorsalen
Wurzelganglien bislang nicht identifiziert werden. In der Maus konnte
lediglich Stomatin-ähnliches Protein 3 (SLP-3) als für den Tastsinn
essentielles Protein gefunden werden. Aus diesem Grund wurde im zweiten Teil
dieser Arbeit nach der Identitaet eines 100 nm langen Halteproteins, dessen
Existenz zuvor in meinem Labor bewiesen wurde. Dieses Protein ist funktionell
an der Mechanotransduktion beteiligt, indem es moeglicherweise den
Transduktionskanal mit der extrazellulären Matrix verbindet. Das Halteprotein
wird in dorsalen Wurzelganglien, jedoch nicht in den superioren zervikalen
Ganglien exprimiert, bindet an Laminin und wird durch Furin-Proteinasen
gespaltet. Eine Vorauswahl möglicher in Frage kommender Kandidaten wurde durch
die Verwendung eines Phython-Skripts vorgenommen, um nach Proteinen mit einer
Furin-Spaltstelle im Mäusegenom zu suchen. Anschließend wurde die Expression
dieser Proteine mit qPCR in dorsalen Wurzelganglien bestimmt und mit
superioren zervikalen Ganglien verglichen. Mittels dieser Analyse wurden sechs
potentielle Kandidaten selektiert. Diese wurden durch Mikro-Kontakt-Printing
in Neuriten von auf kommerziellem Laminin wachsenden doralen
Wurzelganglienzellen lokalisiert. In Neuriten von auf Laminin-332 wachsenden
Zellen konnten diese Proteine nicht lokalisiert werden. Durch Immunogold-
Färbung und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) konnte ein Teil dieser
Protein-Kandidaten subzellulär in Zellen der dorsalen Wurzelganglien
lokalisiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse könnten zwei der untersuchten
Proteine mögliche Kandidaten für das Halteprotein sein
Estudio inmunocitoquímico y molecular de cultivo primario de tejido molar
Introduction. Gestational trophoblastic disease includes a group of pathologies characterized by abnormal trophoblast growth and invasion. The molecular bases of the disease are largely unknown, due in part to the lack of appropriate biological models. The insulin-like growth factor (IGF) system plays a fundamental role in the growth and development of many tissues and is involved in the progression of several diseases.Objectives. Primary cell cultures derived from first trimester placenta were characterized from patients with complete hydatidiform mole and spontaneous non molar abortion by immunocytochemical and molecular methods. Materials and Methods. The immunocytochemical method used specific markers for trophoblastic cells, whereas RT-PCR was used to identify insulin-like growth factor gene expression.Results. Histochemical staining with hematoxilin-eosin revealed that the cultures contained heterogeneous cell types, including trophoblast and endometrial decidual cells. The ratio of trophoblast cells in the cultures varied between 16% and 37%, as detected by cytokeratine-7 as the specific trophoblast marker. Gene expression analysis corroborated the presence of trophoblasts by detecting insulin-like growth factor II mRNA, whereas GH-V transcripts were correlated with the presence of syncitiotrophoblasts. Insulin-like growth factor I and insulin-like growth factor binding protein 1 mRNAs were related to mesenchyimal and decidual cells, respectively. Higher insulin-like growth factor II expression levels were found in molar tissues in comparison with non-molar abortions.Conclusion. By combining three methodologies-morphology, immunocytochemistry and gene expression, characterization and follow-up of placenta cultures from abnormal tissues is found to facilitate diagnosis.Introducción. La enfermedad trofoblástica gestacional comprende un conjunto de patologías caracterizadas por crecimiento e invasión anómalos del trofoblasto. Las bases moleculares de esta patología son desconocidas, en parte por la dificultad para disponer de modelos biológicos adecuados. Se plantea que el sistema de factores de crecimiento similares a la insulina puede tener un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad.Objetivo. Caracterizar cultivos primarios de placentas de primer trimestre provenientes de pacientes con mola hidatidiforme completa y aborto espontáneo no molar mediante morfología, inmunocitoquímica y expresión diferencial de algunos genes del sistema de factores de crecimiento similares a la insulina.Materiales y métodos. Se empleó inmunocitoquímica para determinar células trofoblásticas y detección por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa de genes del sistema de factores de crecimiento similares a la insulina asociados al tipo celular.Resultados. La morfología evidenció heterogeneidad de los cultivos, incluidas células mesenquimales, trofoblásticas y de decidua. El contenido de células de trofoblasto con citoqueratina-7 (marcador específico) estuvo entre 16 y 37%. La expresión de genes corroboró la presencia de trofoblasto por medio del ARNm del factor II de crecimiento similar a la insulina, en tanto que los transcritos de la hormona de crecimiento variante evidenciaron la presencia de sincitiotrofoblasto. El factor I de crecimiento similar a la insulina y la proteína de unión tipo 1 se relacionaron con células mesenquimales y de decidua. Se observó una mayor expresión del factor II de crecimiento similar a la insulina en tejidos molares en comparación con aborto no molar.Conclusiones. Los resultados mostraron la utilidad de combinar tres metodologías, morfología, inmunocitoquímica y expresión de genes, como herramientas para la caracterización y seguimiento de cultivos placentarios a partir de muestras de tejidos anómalos complejos, facilitando así el diagnóstico
Laminin-332 coordinates mechanotransduction and growth cone bifurcation in sensory neurons
Laminin-332 is a major component of the dermo-epidermal skin basement membrane and maintains skin integrity. The transduction of mechanical force into electrical signals by sensory endings in the skin requires mechanosensitive channels. We found that mouse epidermal keratinocytes produce a matrix that is inhibitory for sensory mechanotransduction and that the active molecular component is laminin-332. Substrate-bound laminin-332 specifically suppressed one type of mechanosensitive current (rapidly adapting) independently of integrin-receptor activation. This mechanotransduction suppression could be exerted locally and was mediated by preventing the formation of protein tethers necessary for current activation. We also found that laminin-332 could locally control sensory axon branching behavior. Loss of laminin-332 in humans led to increased sensory terminal branching and may lead to a de-repression of mechanosensitive currents. These previously unknown functions for this matrix molecule may explain some of the extreme pain experienced by individuals with epidermolysis bullosa who are deficient in laminin-332