Estudo dos mecanismos de resposta ao estresse fermentativo em Zymomonas mobilis

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2019.A crescente demanda global por fontes de energia renováveis e sustentáveis tem aumentado o destaque econômico dos biocombustíveis nas últimas décadas. Entre os principais biocombustíveis produzidos industrialmente, está o etanol produzido por microrganismos. A produção de etanol a partir de biomassa vegetal é grande interesse econômico e ambiental. Neste contexto, a bactéria Gram-negativa Zymomonas mobilis tem grande destaque devido à sua elevada produção de etanol e tolerância aos fatores de estresse fermentativo. Neste trabalho, o principal objetivo foi estudar os mecanismos de tolerância ao estresse fermentativo em Z. mobilis ZM4. Para tal, o perfil de crescimento, produção e tolerância ao etanol foi caracterizado e os métodos de manipulação genética em Z. mobilis foram estabelecidos, com a definição e teste de vetores de expressão, além de um sistema eficiente para a deleção gênica. O gene correspondente à proteína ZMO0994 (LEA-like) foi deletado com sucesso do genoma de Z. mobilis ZM4 e a linhagem resultante demonstrou perda significativa da tolerância ao estresse osmótico induzido por glicose e aumento da tolerância ao etanol. Esse é o primeiro relato de correlação entre uma proteína LEA-like bacteriana e os mecanismos de resposta ao estresse de fermentação alcoólica. Até o momento, não há nenhum trabalho publicado que demonstre experimentalmente o papel dos fatores sigma de Z. mobilis e nem a sua relação com os mecanismos de resposta ao estresse. Desta forma, os fatores sigma 70, sigma 32 e sigma 24 foram superexpressos em Z. mobilis ZM4 para investigar como esses fatores transcricionais se relacionam com a resposta às diferentes condições de estresse fermentativo. A superexpressão do fator sigma 32 aumentou a velocidade de crescimento em cultivos a 39oC e com 160 g/L de glicose, além de aumentar em 10% a taxa de consumo de glicose. O efeito em relação à tolerância ao etanol foi antagônico, diminuído a tolerância. A linhagem que superexpressa o fator sigma 24 também apresentou tolerância aumentada ao choque térmico, mas a relação com os outros fatores de estresse não foi conclusiva. Desta forma, é possível descrever o antagonismo existente entre a resposta ao estresse osmótico induzido por glicose e a resposta a elevadas concentrações de etanol, com o papel essencial desempenhado pela proteína ZMO0994 e pelo fator sigma 32. O melhor entendimento desses mecanismos contribui para o melhoramento de linhagens industriais de Z. mobilis, o que pode impactar diretamente a viabilidade econômica dos biocombustíveis produzidos por essa bactéria.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The growing global demand for renewable and sustainable energy sources has increased the economic prominence of biofuels in recent decades. Ethanol produced by microorganisms is among the most explored biofuels. The production of ethanol from plant biomass is of great economic and environmental interest. In this context, the Gram-negative bacterium Zymomonas mobilis is highlighted due to its high ethanol production and high tolerance to fermentative stress conditions. In this work, the main goal was to study the mechanisms of tolerance to fermentative stress in Z. mobilis ZM4. To do so, the growth, production and ethanol tolerance was characterized. Genetic manipulation methods for Z. mobilis have also been established. Efficient expression vectors and an accurate system for genetic knockout were developed and tested. The gene corresponding to the ZMO0994 protein (LEA-like) was successfully deleted from Z. mobilis ZM4 genome and the resulting strain showed significant loss of tolerance to osmotic stress induced by glucose and also showed increased tolerance to ethanol and heat. This is the first study to demonstrate a co-relation between a bacteria LEA-like protein and the mechanisms of fermentation stress response. To date, there is no published work that demonstrate the role of Z. mobilis sigma factors and their relationship to stress response mechanisms. Therefore, sigma 70, sigma 32 and sigma 24 factors were overexpressed in Z. mobilis ZM4 to investigate how these transcriptional factors relate to the response to different fermentative stress conditions. Overexpression of sigma 32 increased the strain growth rate at 39oC and with 160 g/L of glucose, also increasing in 10% the glucose consumption rates. The effect on ethanol tolerance was opposite, decreasing tolerance. The strain that overexpresses the sigma 24 also presented increased tolerance to heat shock, but the correlation to other stress factors was not conclusive. Therefore, it is possible to describe the antagonism between glucose-induced osmotic stress response and the response to high ethanol concentrations in Z. mobilis ZM4, highlighting the essential role played by the ZMO0994 protein and the sigma 32 factor. The better understanding of these mechanisms contributes to the improvement of industrial strains of Z. mobilis, which may directly impact the economic viability of the biofuels produced by this bacterium

Engineering Zymomonas mobilis for the production of xylonic acid from sugarcane bagasse hydrolysate

Sugarcane bagasse is an agricultural residue rich in xylose, which may be used as a feedstock for the production of high-value-added chemicals, such as xylonic acid, an organic acid listed as one of the top 30 value-added chemicals on a NREL report. Here, Zymomonas mobilis was engineered for the first time to produce xylonic acid from sugarcane bagasse hydrolysate. Seven coding genes for xylose dehydrogenase (XDH) were tested. The expression of XDH gene from Paraburkholderia xenovorans allowed the highest production of xylonic acid (26.17 ± 0.58 g L−1) from 50 g L−1 xylose in shake flasks, with a productivity of 1.85 ± 0.06 g L−1 h −1 and a yield of 1.04 ± 0.04 gAX/gX. Deletion of the xylose reductase gene further increased the production of xylonic acid to 56.44 ± 1.93 g L−1 from 54.27 ± 0.26 g L−1 xylose in a bioreactor. Strain performance was also evaluated in sugarcane bagasse hydrolysate as a cheap feedstock, which resulted in the production of 11.13 g L−1 xylonic acid from 10 g L−1 xylose. The results show that Z. mobilis may be regarded as a potential platform for the production of organic acids from cheap lignocellulosic biomass in the context of biorefineries

Isolamento, identificação e caracterização enzimática de uma bactéria de fonte termal do Cerrado

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010.Fontes hidrotermais possuem grande diversidade de microrganismos termo resistentes, que são importantes para as indústrias de conversão de biomassa vegetal. A lignocelulose é o componente mais abundante da biomassa, mas é subutilizado pela indisponibilidade de enzimas de baixo custo que realizem a degradação com eficiência. Neste trabalho, treze bactérias foram isoladas da água de duas fontes termais do Parque Nacional de Caldas Novas, GO. Uma foi selecionada para ser identificada e caracterizada enzimaticamente por suportar a maior temperatura de crescimento e deter maior atividade em placa contra carboximetilcelulose (CMC), celulose ultracritalina (UCel) e xilana. Após análises das sequências gênicas do RNA ribossomal 16S e da subunidade β da RNA polimerase, a bactéria selecionada foi classificada no grupo do Bacillus cereus, mas não foi possível a diferenciação entre o B. cereus e o B. thuringinensis, sendo denominada como Bacillus sp. linhagem FT9. Após a classificação, o Bacillus sp. FT9 foi cultivado em CMC, UCel, xilana oat spelts (XOS), xilana birchwood (XBW) e glicose. Para os substratos complexos, a maior taxa de crescimento específico e os mais elevados rendimentos de indução foram encontrados nas culturas induzidas com XOS, sendo observada atividade de xilanase no sobrenadante dessa cultura igual a 0,537 UI/mL a 50 °C e pH 6,0. No sobrenadante da cultura induzida em CMC, foi encontrada atividade de CMCase e FTPase igual a 0,231 UI/mL e 0,111 UI/mL a 70 °C e pH 7,0, respectivamente. Esse é o primeiro relato de atividade xilanolítica e o segundo de atividade celulolítica para linhagens relacionadas filogeneticamente com o grupo do B. cereus. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTMicroorganisms from hot springs play an important role at the biomass conversion industries. Lignocellulose is the major component of vegetal biomass, however, it is underused because of the unavailability of cost-effective enzymes that perform efficiently its degradation. In this work, thirteen bacteria were isolated from two hot springs located at Caldas Novas National Park, Brazil. One of them was selected for identification and enzymatic description due to the highest grown temperature and the greatest cellulase and xylanase activity that it shown at preliminary assays. When its rDNA 16S and RNA polymerase’s β subunit sequences were analyzed, the chosen strain presented close phylogeny to Bacillus cereus group, although species classification has not been possible through these techniques, it was named Bacillus sp. strain FT9. Then, it was grown on carboxymetylcellulose (CMC), ultracrystalline cellulose (UCel), xylan oat spelts, xylan birchwood and glucose. Considering the complex substrates, the highest rates of specific grown and yields were found at fermentation on XOS, which had 0,537 UI/mL of xylanase activity at 50 °C and pH 6,0. On CMC grown cultures, 0,231 UI/mL of CMCase activity and 0,111 UI/mL of FTPase were detected, both at 70 °C and pH 7,0. That is the first work describing xylanase activity and the second one to describe cellulase activity at Bacillus cereus close related species

A study on the use of strain-specific and homologous promoters for heterologous expression in industrial Saccharomyces cerevisiae strains

Abstract Polymorphism is well known in Saccharomyces cerevisiae strains used for different industrial applications, however little is known about its effects on promoter efficiency. In order to test this, five different promoters derived from an industrial and a laboratory (S288c) strain were used to drive the expression of eGFP reporter gene in both cells. The ADH1 promoter (P ADH1 ) in particular, which showed more polymorphism among the promoters analyzed, also exhibited the highest differences in intracellular fluorescence production. This was further confirmed by Northern blot analysis. The same behavior was also observed when the gene coding for secreted α-amylase from Cryptococcus flavus was placed under the control of either P ADH1 . These results underline the importance of the careful choice of the source of the promoter to be used in industrial yeast strains for heterologous expression