Régulation négative de la signalisation de l'interleukine-10 par le TNFa dans les monocytes humains : implication de NOX2 et impact dans la polyarthrite rhumatoïde

Interleukin-10 (IL-10) is a potent anti-inflammatory cytokine produced by most innate and adaptive immune cells and of which monocytes are a major target. Binding of interleukin-10 to its receptor initiates intracellular signaling involving STAT3 which induces the expression of genes encoding anti-inflammatory factors. Due to its immunomodulatory action, IL-10 has been considered as an interesting therapeutic tool in diseases, acute or chronic inflammatory diseases, and autoimmune diseases with an inflammatory component. However, administration of IL-10 has shown little efficacy in various pathological conditions such as rheumatoid arthritis (RA). The difficulty could be related to the complexity of the inflammatory environment where the presence of multiple cytokines could affect IL-10 signaling. In this context, the objective of the thesis was to determine whether TNFα, a major pro-inflammatory cytokine, could alter interleukin-10 signaling in human monocytes and to determine underlying mechanisms, involving NADPH oxidase 2 (NOX2) an important player in cell signaling and in which TNFα is an agonist, as well as the potential impact in pathological inflammatory situations, such as RA, using an experimental mouse model. Our results show that TNFα interferes with IL-10 signaling by inducing rapid dephosphorylation of STAT3 in human monocytes. TNFα-induced dephosphorylation of STAT3 results in decreased ability of IL-10 to induce expression of SOCS3, a major anti-inflammatory factor. The decrease in STAT3 phosphorylation involved SHP1 / 2 phosphatase because the use of NSC-87877, an SHP1 / 2 inhibitor, prevents the inhibitory action of TNFα on IL-10 signaling. In monocytes stimulated by TNFα, SHP1 is activated while SHP2 is not, suggesting the involvement of SHP1 and not that of SHP2 in the dephosphorylation of STAT3. The activation of SHP1 by TNFα is dependent on NOX2 because we observed that diphenyleneiodonium, an inhibitor of NOX2, suppressed the activation of SHP1 and the dephosphorylation of STAT3 triggered by TNFα. In addition, H2O2 mimicked the inhibitory action of TNFα on IL-10 signaling. Furthermore, activation of SHP1 by ROS in TNFα-stimulated monocytes is mediated by Lyn tyrosine kinase known to be regulated by oxidation. Finally, the SHP1 / 2 inhibitor, NSC-87877, attenuated collagen antibody-induced arthritis (CAIA) in mice. These results revealed that TNFα disrupted IL-10 signaling by inducing STAT3 dephosphorylation via the NOX2-ROS-Lyn-SHP1 axis in human monocytes and that inhibition of SHP1/2 in vivo protected against CAIA. This new finding might explain the resistance to IL-10 supplementation in arthritis and might be useful to harness IL-10 for immunotherapy.L'interleukine-10 (IL-10) est une puissante cytokine anti-inflammatoire produite par la plupart des cellules de l'immunité innée et adaptative et dont les monocytes en sont une cible majeure. La liaison de l'interleukine-10 à son récepteur initie une signalisation intracellulaire impliquant STAT3 ce qui induit l'expression de gènes codant pour des facteurs anti-inflammatoires. Du fait de son action immuno-modulatrice, l'IL-10 a été considérée comme un outil thérapeutique intéressant dans les maladies les maladies inflammatoires aigües ou chroniques, et les maladies auto-immunes ayant une composante inflammatoire. Cependant l'administration de l'IL-10 n'a montré que peu d'efficacité dans diverses situations pathologiques telle que la polyarthrite rhumatoïde (PR). La difficulté pourrait être liée à la complexité du foyer inflammatoire où la présence de multiples cytokines pourrait affecter la signalisation de l'IL-10. Dans ce contexte l'objectif de la thèse était de déterminer si le TNFα, une cytokine pro-inflammatoire majeure, pouvait altérer la signalisation de l'interleukine-10 dans les monocytes humains et de déterminer mécanismes sous-jacents, impliquant la NADPH oxydase 2 (NOX2) acteur important de la signalisation cellulaire et dont le TNFα en est agoniste, ainsi que l'impact potentiel dans les situations inflammatoires pathologiques, telle que la PR, en utilisant un modèle expérimental murin. Nos résultats montrent que le TNFα interfère avec la signalisation de l'IL-10 en induisant une déphosphorylation rapide de STAT3 dans les monocytes humains. La déphosphorylation de STAT3 induite par le TNFα se traduit par une diminution de la capacité de l'IL-10 à induire l'expression de SOCS3 un facteur anti-inflammatoire majeur. La diminution de la phosphorylation de STAT3 impliquait une phosphatase SHP1 / 2 car l'utilisation du NSC-87877, un inhibiteur de SHP1 / 2, empêche l'action inhibitrice du TNFα sur la signalisation de l'IL-10. Dans les monocytes stimulés par le TNFα la SHP1 est activée alors que la SHP2 ne l'est pas, suggérant l'implication de SHP1 et non pas celle de SHP2 dans la déphosphorylation de STAT3. L'activation de SHP1 par le TNFα est dépendante de NOX2 car nous avons observé que le diphénylèneiodonium, un inhibiteur de NOX2, supprime l'activation de SHP1 et la déphosphorylation de STAT3 déclenchée par le TNFα. De plus, H2O2 a reproduit l'action inhibitrice du TNFα sur la signalisation de l'IL-10. Par ailleurs, l'activation de SHP1 par les FRO dans les monocytes stimulés par le TNFα est médié par la tyrosine kinase Lyn connue pour être régulée par oxydation. Enfin, l'inhibiteur SHP1/2, NSC-87877, a atténue l'arthrite induite par les anticorps de collagène (CAIA) chez la souris. Ces résultats révèlent que le TNFα perturbe la signalisation de l'IL-10 en induisant la déphosphorylation de STAT3 via l'axe NOX2-ROS-Lyn-SHP1 dans les monocytes humains et que l'inhibition de SHP1/2 in vivo protège contre la CAIA. Cette nouvelle découverte pourrait expliquer la résistance à l'IL-10 dans l'arthrite et pourrait être utile pour exploiter l'IL-10 dans l'immunothérapie

Negative regulation of interleukin-10 signaling by TNFa in human monocytes : implication of NOX2 and impact in rheumatoid arthritis

L'interleukine-10 (IL-10) est une puissante cytokine anti-inflammatoire produite par la plupart des cellules de l'immunité innée et adaptative et dont les monocytes en sont une cible majeure. La liaison de l'interleukine-10 à son récepteur initie une signalisation intracellulaire impliquant STAT3 ce qui induit l'expression de gènes codant pour des facteurs anti-inflammatoires. Du fait de son action immuno-modulatrice, l'IL-10 a été considérée comme un outil thérapeutique intéressant dans les maladies les maladies inflammatoires aigües ou chroniques, et les maladies auto-immunes ayant une composante inflammatoire. Cependant l'administration de l'IL-10 n'a montré que peu d'efficacité dans diverses situations pathologiques telle que la polyarthrite rhumatoïde (PR). La difficulté pourrait être liée à la complexité du foyer inflammatoire où la présence de multiples cytokines pourrait affecter la signalisation de l'IL-10. Dans ce contexte l'objectif de la thèse était de déterminer si le TNFα, une cytokine pro-inflammatoire majeure, pouvait altérer la signalisation de l'interleukine-10 dans les monocytes humains et de déterminer mécanismes sous-jacents, impliquant la NADPH oxydase 2 (NOX2) acteur important de la signalisation cellulaire et dont le TNFα en est agoniste, ainsi que l'impact potentiel dans les situations inflammatoires pathologiques, telle que la PR, en utilisant un modèle expérimental murin. Nos résultats montrent que le TNFα interfère avec la signalisation de l'IL-10 en induisant une déphosphorylation rapide de STAT3 dans les monocytes humains. La déphosphorylation de STAT3 induite par le TNFα se traduit par une diminution de la capacité de l'IL-10 à induire l'expression de SOCS3 un facteur anti-inflammatoire majeur. La diminution de la phosphorylation de STAT3 impliquait une phosphatase SHP1 / 2 car l'utilisation du NSC-87877, un inhibiteur de SHP1 / 2, empêche l'action inhibitrice du TNFα sur la signalisation de l'IL-10. Dans les monocytes stimulés par le TNFα la SHP1 est activée alors que la SHP2 ne l'est pas, suggérant l'implication de SHP1 et non pas celle de SHP2 dans la déphosphorylation de STAT3. L'activation de SHP1 par le TNFα est dépendante de NOX2 car nous avons observé que le diphénylèneiodonium, un inhibiteur de NOX2, supprime l'activation de SHP1 et la déphosphorylation de STAT3 déclenchée par le TNFα. De plus, H2O2 a reproduit l'action inhibitrice du TNFα sur la signalisation de l'IL-10. Par ailleurs, l'activation de SHP1 par les FRO dans les monocytes stimulés par le TNFα est médié par la tyrosine kinase Lyn connue pour être régulée par oxydation. Enfin, l'inhibiteur SHP1/2, NSC-87877, a atténue l'arthrite induite par les anticorps de collagène (CAIA) chez la souris. Ces résultats révèlent que le TNFα perturbe la signalisation de l'IL-10 en induisant la déphosphorylation de STAT3 via l'axe NOX2-ROS-Lyn-SHP1 dans les monocytes humains et que l'inhibition de SHP1/2 in vivo protège contre la CAIA. Cette nouvelle découverte pourrait expliquer la résistance à l'IL-10 dans l'arthrite et pourrait être utile pour exploiter l'IL-10 dans l'immunothérapie.Interleukin-10 (IL-10) is a potent anti-inflammatory cytokine produced by most innate and adaptive immune cells and of which monocytes are a major target. Binding of interleukin-10 to its receptor initiates intracellular signaling involving STAT3 which induces the expression of genes encoding anti-inflammatory factors. Due to its immunomodulatory action, IL-10 has been considered as an interesting therapeutic tool in diseases, acute or chronic inflammatory diseases, and autoimmune diseases with an inflammatory component. However, administration of IL-10 has shown little efficacy in various pathological conditions such as rheumatoid arthritis (RA). The difficulty could be related to the complexity of the inflammatory environment where the presence of multiple cytokines could affect IL-10 signaling. In this context, the objective of the thesis was to determine whether TNFα, a major pro-inflammatory cytokine, could alter interleukin-10 signaling in human monocytes and to determine underlying mechanisms, involving NADPH oxidase 2 (NOX2) an important player in cell signaling and in which TNFα is an agonist, as well as the potential impact in pathological inflammatory situations, such as RA, using an experimental mouse model. Our results show that TNFα interferes with IL-10 signaling by inducing rapid dephosphorylation of STAT3 in human monocytes. TNFα-induced dephosphorylation of STAT3 results in decreased ability of IL-10 to induce expression of SOCS3, a major anti-inflammatory factor. The decrease in STAT3 phosphorylation involved SHP1 / 2 phosphatase because the use of NSC-87877, an SHP1 / 2 inhibitor, prevents the inhibitory action of TNFα on IL-10 signaling. In monocytes stimulated by TNFα, SHP1 is activated while SHP2 is not, suggesting the involvement of SHP1 and not that of SHP2 in the dephosphorylation of STAT3. The activation of SHP1 by TNFα is dependent on NOX2 because we observed that diphenyleneiodonium, an inhibitor of NOX2, suppressed the activation of SHP1 and the dephosphorylation of STAT3 triggered by TNFα. In addition, H2O2 mimicked the inhibitory action of TNFα on IL-10 signaling. Furthermore, activation of SHP1 by ROS in TNFα-stimulated monocytes is mediated by Lyn tyrosine kinase known to be regulated by oxidation. Finally, the SHP1 / 2 inhibitor, NSC-87877, attenuated collagen antibody-induced arthritis (CAIA) in mice. These results revealed that TNFα disrupted IL-10 signaling by inducing STAT3 dephosphorylation via the NOX2-ROS-Lyn-SHP1 axis in human monocytes and that inhibition of SHP1/2 in vivo protected against CAIA. This new finding might explain the resistance to IL-10 supplementation in arthritis and might be useful to harness IL-10 for immunotherapy

TNFα counteracts interleukin-10 anti-inflammatory pathway through the NOX2-Lyn-SHP-1 axis in human monocytes

TNFα-mediated signaling pathways play a pivotal role in the pathogenesis of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA) and inflammatory bowel disease (IBD) by promoting phagocyte inflammatory functions, notably cytokine release and reactive oxygen species (ROS) production by NOX2. In contrast, interleukin-10 (IL-10), a powerful anti-inflammatory cytokine, potently shuts down phagocyte activation, making IL-10 an attractive therapeutic candidate. However, IL-10 therapy has shown limited efficacy in patients with inflammatory diseases. Here, we report that TNFα blocks IL-10 anti-inflammatory pathways in human monocytes, thereby prolonging inflammation. TNFα decreased IL-10-induced phosphorylation of STAT3 and consequently IL-10-induced expression of the major anti-inflammatory factor, SOCS3. Decreased STAT3 phosphorylation was due to a SHP1/2 phosphatase, as NSC-87877, a SHP1/2 inhibitor, restored STAT3 phosphorylation and prevented the TNFα-induced inhibition of IL-10 signaling. TNFα activated only SHP1 in human monocytes and this activation was NOX2-dependent, as diphenyleneiodonium, a NOX2 inhibitor, suppressed SHP1 activation and STAT3 dephosphorylation triggered by TNFα. ROS-induced activation of SHP1 was mediated by the redox-sensitive kinase, Lyn, as its inhibition impeded TNFα-induced SHP1 activation and STAT3 dephosphorylation. Furthermore, H2O2 recapitulated TNFα-inhibitory activity on IL-10 signaling. Finally, NSC-87877 dampened collagen antibody-induced arthritis (CAIA) in mice. These results reveal that TNFα disrupts IL-10 signaling by inducing STAT3 dephosphorylation through a NOX2-ROS-Lyn-SHP1 axis in human monocytes and that inhibition of SHP1/2 in vivo protects against CAIA. These new findings might explain the poor efficacy of IL-10 therapy in patients with inflammatory diseases and suggest that anti-TNFα agents and SHP1/2 inhibitors could improve the therapeutic use of IL-10

Protein Kinase CK2 Acts as a Molecular Brake to Control NADPH Oxidase 1 Activation and Colon Inflammation

International audienceBACKGROUND & AIMS: NADPH oxidase 1 (NOX1) has emerged as a prime regulator of intestinal mucosa immunity and homeostasis. Dysregulation of NOX1 may cause inflammatory bowel disease (IBD). It is not clear how NOX1 is regulated in vivo under inflammatory conditions. We studied the role of CK2 in this process.METHODS: The NOX1 organizer subunit, NADPH oxidase organizer 1 (NOXO1), was immunoprecipitated from cytokine-treated colon epithelial cells, and bound proteins were identified by mass spectrometry analysis. Sites on NOXO1 phosphorylated by CK2 were identified by nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. NOX1 activity was determined in colon epithelial cells and colonoids in the presence or absence of CX-4945, a CK2 specific inhibitor. Acute colitis was induced by administration of trinitrobenzenesulfonic acid in mice treated or not with CX-4945. Colon tissues were analyzed by histologic examination, quantitative polymerase chain reaction, and Western blots. CK2 activity, markers of inflammation, and oxidative stress were assessed.RESULTS: We identified CK2 as a major partner of NOXO1 in colon epithelial cells under inflammatory conditions. CK2 directly binds NOXO1 at the C-terminus containing the Phox homology domain and phosphorylates NOXO1 on several sites. CX-4945 increased ROS generation by NOX1 in human colon epithelial cells and organoids. Strikingly, CK2 activity was reduced in trinitrobenzenesulfonic acid-induced acute colitis, and CX-4945 exacerbated colitis inflammation as shown by increased levels of CXCL1, ROS generation, lipid peroxidation, and colon damage.CONCLUSIONS: The ubiquitous protein kinase CK2 limits NOX1 activity via NOXO1 binding and phosphorylation in colonic epithelial cells and lessens experimental colitis. Loss of CK2 activity during acute colitis results in excessive ROS production, contributing to the pathogenesis. Strategies to activate CK2 could be an effective novel therapeutic approach in IBD

NOX1-derived ROS drive the expression of Lipocalin-2 in colonic epithelial cells in inflammatory conditions

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