In vivo evaluation of P4501A2, P4502A6, n-acetyltransferase and xanthine oxidase activities in patients with chronic liver disease by high performance liquid chromatographic analysis of urine caffeine metabolites

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is metabolized by CYP1A2, CYP2A6, Xanthine Oxidase and N-acetyltransferase-2 and its major urinary metabolites are 1-methyluric acid (1U), 5-acetylamino-6-formylamino-3-methyluracil (AFMU), 1-methylxanthine (1X), 1,7-dimethyluric acid (17U) and 1,7-dimethylxanthine (17X). CYP1A2, CYP2A6, XO and NAT-2 activities are estimated from the metabolic ratios (AFMU+1U+1X)/17U, 17U/(17U+17X), 1U/(1X+1U) and AFMU/(AFMU+1U+1X), respectively. The aim of the study was the development of a High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method for the quantification of caffeine metabolites in urine and the evaluation of the above ratios in 125 healthy and 342 liver disease patients. After a 30-hours xanthine-free and medication-free period 200mg caffeine were administered and a 6-hours spot urine sample was collected. Caffeine metabolites and the Internal Standard were extracted with chloroform/isopropanol (85:15, v/v) and separated on a C18 column using solvent A (0.1% acetic acid–methanol–acetonitrile, 92:4:5, v/v) and solvent B (0.1% acetic acid–methanol, 60:40, v/v), and detected at 280nm. Adequate metabolite separation, accuracy (94.1–106.3%), intraday (8.02%) and interday (8.78%) precision were achieved. Age and gender had no effect on enzymes activity whereas smoking induced CYP1A2 and inhibited CYP2A6. NAT-2 exhibited bimodal distribution with 59.2% of the healthy and 57.0% of the patients being slow acetylators. CYP1A2 and CYP2A6 were suppressed in patients and inhibition was more pronounced in cirrhotics. It was demontstrated, that CYP1A2 was inhibited in autoimmune hepatitis, in non-alcoholic steatohepatitis, in HBV and HCV infection, in alcoholic liver disease and in autoimmune cholostatic liver diseases. Τhe inducing effect of smoking masked the inhibitory effect of disease on CYP1A2 activity, in most patients subgroups, with the exception of alcoholic liver disease and non alcoholic steatohepatitis. Smoking did not mask CYP1A2 inhibition by cirrhosis, due to the pronounced enzyme failure in decompensated patients while no such effect was observed in compensated cirrhotics. XO activity was elevated, especially in virus infected patients. Finally, it was demonstrated that NAT-2 activity was reduced in fast acetylators. The logarithm of the ratio (AFMU+1U+1X)/17U exhibited 70.7-85.4% specificity and 60.1-91.7% sensitivity in the diagnosis of different stages of liver disease, in the non-smokers group. In the smokers group sensitivity was 31.5-83.3% while specificity was 72.1-86.0%. In most cases, the CYP1A2 index was more sensitive than routine tests while the combined use of this ratio and conventional tests improved the detection of liver disease with 69.6-100.0% sensitivity, in non-smokers, and 51.7-83.3% sensitivity in smokers. Caffeine metabolic ratios assessment in spot urine samples is a non-invasive, innocuous and valid procedure for the determination of CYP1A2, CYP2A6, XO and ΝΑΤ-2 activities while the logarithm of the ratio (AFMU+1U+1X)/17U along with conventional liver function tests contributes towards a significant improvement in the diagnosis of liver disease.Η καφεΐνη (1,3,7-τριμεθυλοξανθίνη) μεταβολίζεται μέσω των ενζύμων CYP1A2, CYP2A6, οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ) και Ν-ακετυλοτρανσφεράση-2 (ΝΑΤ-2). Οι κυριώτεροι μεταβολίτες στα ούρα είναι το 1-μεθυλουρικό οξύ, η 5-ακετυλάμινο-6-φορμυλάμινο-3-μεθυλουρακίλη (ΑFMU), η 1-μεθυλοξανθίνη (1Χ), το 1,7-διμεθυλουρικό οξύ (17U) και η 1,7 διμεθυλο ξανθίνη (17Χ). Η δραστικότητα των ανωτέρω ενζύμων προσδιορίζεται με τους μεταβολικούς λόγους (AFMU+1U+1X)/17U, 17U/(17U+17X), 1U/(1U+1X) και AFMU/(AFMU+1U+1X). Σκοπός της εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθόδου Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC) για την ανάλυση των μεταβολιτών της καφεΐνης στα ούρα και ο προσδιορισμός των ανωτέρω μεταβολικών λόγων σε 125 υγιείς και 342 ηπατοπαθείς. Μετά από αποχή από μεθυλοξανθίνες και φάρμακα οι εθελοντές έλαβαν 200mg καφεΐνης και 6 ώρες αργότερα συλλέχτηκε δείγμα ούρων. Οι μεταβολίτες και το εσωτερικό πρότυπο απομονώθηκαν με χλωροφόρμιο/ισοπροπανόλη (85/15, v/v), διαχωρίστηκαν σε στήλη C18 σε δύο στάδια, μεταβαίνοντας από τον διαλύτη Α (0,1% οξικό οξύ/μεθανόλη/ακετονιτρίλιο, 92/4/5, v/v) στον διαλύτη Β (0,1% οξικό οξύ/μεθανόλη, 60/40, v/v) και ανιχνεύτηκαν στα 280nm. Ο διαχωρισμός ήταν επαρκής, η ακρίβεια 94,1–106,3%, η εντός σειράς και μεταξύ σειρών επαναληψιμότητα μικρότερη του 8,02% και του 8,78%, αντίστοιχα. Φύλο και ηλικία δεν είχαν επίδραση στα ένζυμα ενώ το κάπνισμα είχε επαγωγική δράση στο CYP1A2 και ανασταλτική στο CYP2A6. Η δραστικότητα της ΝΑΤ-2 παρουσίασε δικόρυφη κατανομή και 59,2% των υγιών και 57,0% των ασθενών χαρακτηρίστηκαν ως βραδείς ακετυλιωτές. Η δραστικότητα των CYP1A2 και CYP2A6 ανεστάλη κατά την ηπατοπάθεια και εμφανέστερα κατά την κίρρωση. Το CYP1A2 ανεστάλη στην αυτοάνοση ηπατίτιδα, στην μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα, στην ιογενή ηπατίτιδα, στην αλκοολική ηπατοπάθεια και στα αυτοάνοσα χολοστατικά νοσήματα. Το κάπνισμα επικάλυψε την αναστολή του CYP1A2 στις περισσότερες περιπτώσεις, με εξαίρεση την αλκοολική νόσο και την μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα. Το κάπνισμα δεν επικάλυψε την αναστολή του CYP1A2 στους κιρρωτικούς, λόγω σοβαρής ανεπάρκειας του ενζύμου στην μή αντιρροπούμενη κίρρωση, ενώ στην αντιρροπούμενη το κάπνισμα επισκίασε την αναστολή του ενζύμου. Δείχθηκε ότι η ΧΟ επάγεται κατά την ηπατοπάθεια και ιδιαίτερα στην ιογενή ηπατίτιδα. Δείχθηκε, τέλος, ότι μόνον η ταχεία ακετυλίωση υποχωρεί στους ηπατοπαθείς. Ο λογάριθμος του λόγου (AFMU+1U+1X)/17U παρουσίασε εξειδίκευση 70,7-85,4% και ευαισθησία 60,1-91,7% στην διάγνωση διαφόρων σταδίων της ηπατικής νόσου, στους μη καπνιστές, ενώ στους καπνιστές είχε εξειδίκευση 72,1-86,0% και ευαισθησία 31,5-83,3%. Στις περισσότερες περιπτώσεις ο ανωτέρω λογάριθμος είχε μεγαλύτερη ευαισθησία από τις συνήθεις δοκιμασίες, ενώ ο συνδυασμός του με αυτές βελτίωσε την ευαισθησία της διάγνωσης με ποσοστά από 69,6-100,0% και 51,7-83,3% στους μη καπνιστές και καπνιστές, αντίστοιχα. Η μέθοδος των μεταβολικών λόγων της καφεΐνης στα ούρα είναι μη επεμβατική, αβλαβής, ανώδυνη και αξιόπιστη διαδικασία για την εκτίμηση της δραστικότητας των CYP1A2, CYP2A6, XO και ΝΑΤ-2. Ο λογάριθμος του λόγου (AFMU+1U+1X)/17U, σε συνδυασμό με τις συνήθεις δοκιμασίες του ήπατος, βελτιώνει σημαντικά την διάγνωση της ηπατικής νόσου

Development and Validation of a Simple and Reliable HPLC-UV Method for Determining Gemcitabine Levels: Application in Pharmacokinetic Analysis

Background and Objectives: Gemcitabine has been used to treat various solid cancers, including, since 1997, metastatic pancreatic cancer. Here, we developed an HPLC-UV method to determine serum gemcitabine levels and use it in pharmacokinetic studies. Materials and Methods: The analysis was performed after a single protein precipitation step on a reversed-phase column, isocratically eluted with sodium phosphate buffer and methanol. For the pharmacokinetic study, NOD/SCID mice received a single dose of gemcitabine at 100 mg/kg by either subcutaneous (SC) or intraperitoneal (IP) administration. Blood samples were collected at 5, 15, and 30 min and 1, 2, 4, and 6 h after the administration of gemcitabine for further analysis. Results: The duration of the analysis was ~12.5 min. The calibration curve was linear (r2 = 0.999) over the range of 1–400 μM. The mean recovery of GEM was 96.53% and the limit of detection was 0.166 μΜ. T1/2, Tmax, Cmax, AUC0–t, and clearance were 64.49 min, 5.00 min, 264.88 μmol/L, 9351.95 μmol/L*min, and 0.0103(mg)/(μmol/L)/min, respectively, for the SC administration. The corresponding values for the IP administration were 59.34 min, 5.00 min, 300.73 μmol/L, 8981.35 μmol/L*min and 0.0108(mg)/(μmol/L)/min (not statistically different from the SC administration). Conclusions: A simple, valid, sensitive, and inexpensive method for the measurement of gemcitabine in serum has been developed. This method may be useful for monitoring gemcitabine levels in cancer patients as part of therapeutic drug monitoring