Contaminação bacteriana e consumo de xilose durante a produção de etanol por "Saccharomyces cerevisiae"

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães PereiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: O Brasil é uma das principais potências no campo da produção de biocombustíveis com o bioetanol como seu principal produto. O bioetanol brasileiro é produzido principalmente pela fermentação da cana-de-açúcar e é conhecido como etanol de primeira geração (1G). Recentemente, materiais lignocelulósicos também estão sendo usados como matéria-prima, originando o etanol de segunda geração (2G). O bioetanol é considerado um produto de baixo valor agregado, portanto, baixos custos de produção são essenciais para que seja economicamente viável. Considerando os processos 1G e 2G, várias etapas e condições ainda podem ser aprimoradas. Na produção de etanol 1G, por exemplo, muitas vezes é detectada a presença de micro-organismos indesejáveis que levam a perdas severas e, em alguns casos, ao fechamento temporário da usina. Atualmente, a principal estratégia adotada para superar esse problema é o uso profilático de antibióticos. No entanto, a crescente preocupação relacionada à seleção de bactérias resistentes, juntamente com as questões ambientais e seu elevado custo, levaram a uma busca por agentes anti-microbianos alternativos. Na produção de etanol 2G, um dos principais desafios é a eficiente fermentação da xilose pela levedura S. cerevisiae. A xilose isomerase (XI) é uma enzima chave para conversão da biomassa lignocelulósica em etanol. No entanto, a maioria dos genes XI não são funcionais quando expressos em S. cerevisiae. No trabalho apresentado, os problemas que ocorrem na 1G e 2G são abordados. O Capítulo I tem como objetivo demonstrar que a XI de Propionibacterium acidipropionici se torna funcional em S. cerevisiae quando co-expressa com um complexo bacteriano de chaperoninas adquirindo uma capacidade elevada de converter xilose em etanol. No capítulo II é proposto um desenvolvimento de leveduras geneticamente modificadas capazes de controlar o crescimento bacteriano em fermentações etanólicasAbstract: Brazil is one of the main potencies in the field of biofuels production with bioethanol as its major product. Brazilian bioethanol is mostly produced by fermentation of sugarcane and is known as first-generation ethanol (1G). Recently, lignocellulosic materials are also being used as a feedstock, originating the second-generation ethanol (2G). Bioethanol is considered a low value-added product, therefore low production costs are essential for it to be economically viable. Considering 1G and 2G processes, several steps and conditions can still be improved. In 1G ethanol production for instance it is often detected the presence of unwanted microorganisms that lead to severe losses and in some cases temporary closure of the ethanol plant. Currently, the main strategy adopted to overcome this problem is the prophylactic use of antibiotics. Nevertheless, the crescent concern related to selection of resistant strains of bacteria, along with environmental issues and its elevated cost, have led to a search for alternative antimicrobial agents. In 2G ethanol production, one of the main challenges is efficient xylose fermentation by the yeast S. cerevisiae. Xylose isomerase (XI) is a key enzyme 2G biomass conversion. However, most XI genes are not functional when expressed in S. cerevisiae. In the presented work both 1G and 2G problems are addressed. Chapter I aims to demonstrate that XI from Propionibacterium acidipropionici becomes functional in S. cerevisiae when co-expressed with a bacterial chaperonin complex and has an elevated ability of converting xylose to ethanol. In chapter II is proposed a development of genetically modified yeast capable of controlling the bacterial growth in ethanolic fermentationsDoutoradoBioenergiaDoutora em CiênciasCAPE

Fatores associados à gravidade da COVID-19 em gestantes adolescentes brasileiras: estudo de base populacional

Objetivo: identificar los factores asociados a la necesidad de hospitalización en unidad de cuidados intensivos en adolescentes brasileñas embarazadas con COVID-19. Método: estudio de cohorte no concurrente de base poblacional, utilizando bases de datos secundarias. El estudio incluyó adolescentes brasileñas embarazadas que tuvieron confirmación de laboratorio de SARS-CoV-2 por Real Time, entre el 14 de marzo de 2020 y el 11 de abril de 2021. Análisis estadístico realizado por el modelo de regresión múltiple de Poisson, estimándose el riesgo relativo y respectivos intervalos de confianza del 95%, siendo significativos valores de p <0,05. Resultados: se incluyeron en el análisis 282 gestantes, con mediana de edad de 17 años, la mayoría de color de piel parda, en el tercer trimestre del embarazo y residentes en zona urbana o periurbana. La tasa de hospitalización en la unidad de cuidados intensivos fue del 14,5%, asociada a vivir en la región Sudeste (RR=5,03, IC95%=1,78-14,24, p=0,002), tener saturación sanguínea de oxígeno inferior al 95% (RR=2,62, IC95%=1,17-5,87, p=0,019) y tener alguna comorbilidad (RR=2,05, IC95%=1,01-4,16, p=0,047). Conclusión: la tasa de hospitalización en cuidados intensivos fue alta entre las adolescentes brasileñas embarazadas y se asoció con vivir en la región Sudeste, tener alguna comorbilidad y/o tener baja saturación de oxígeno.Objective:  to identify the factors associated with need for intensive care unit admission of Brazilian pregnant adolescents with COVID-19. Method: population-based non-concurrent cohort study using secondary databases. Brazilian pregnant adolescents who had laboratory confirmation of SARS-CoV-2 by RT-PCR, between March 14, 2020 and April 11, 2021 were included in the study. Statistical analysis using the Poisson multiple regression model, estimating the relative risk and respective 95% confidence intervals, with values of p <0.05 considered significant. Results: in total, 282 pregnant women were included in the study, with median age of 17 years, most with brown skin, in the third trimester of pregnancy, and living in urban or peri-urban areas. The intensive care unit admission rate was 14.5%, associated with living in the Southeast region of Brazil (RR=5.03, 95%CI=1.78-14.24, p=0.002), oxygen saturation below 95% (RR=2.62, 95%CI=1.17-5.87, p=0.019), and having some comorbidity (RR=2.05, 95%CI=1.01-4.16, p=0.047). Conclusion: the intensive care unit admission rate was high among Brazilian pregnant adolescents and was associated with living in the Southeast region of Brazil, having some comorbidity and/or presenting low oxygen saturation.Objetivo: identificar os fatores associados à necessidade de internação em unidade de terapia intensiva em gestantes adolescentes brasileiras com COVID-19. Método: estudo de coorte não concorrente de base populacional, utilizando banco de dados secundários. Foram incluídas no estudo as gestantes adolescentes brasileiras que possuíam confirmação laboratorial de SARS-CoV-2 por Real Time, entre 14 de março de 2020 e 11 abril de 2021. Análise estatística realizada pelo modelo de regressão múltipla de Poisson, estimando-se o risco relativo e respectivos intervalos de confiança de 95%, sendo significativos valores de p <0,05. Resultados: foram incluídas na análise 282 gestantes, com mediana de idade de 17 anos, a maioria com cor da pele parda, no terceiro trimestre de gestação e residentes em zona urbana ou periurbana. A taxa de internação em unidade de terapia intensiva foi de 14,5%, associando-se a viver na região Sudeste (RR=5,03, IC95%=1,78-14,24, p=0,002), ter saturação de oxigênio inferior a 95% (RR=2,62, IC95%=1,17-5,87, p=0,019) e possuir alguma comorbidade (RR=2,05, IC95%=1,01-4,16, p=0,047). Conclusão: a taxa de internação em terapia intensiva foi elevada entre gestantes adolescentes brasileiras e associou-se a viver na região Sudeste, possuir alguma comorbidade e/ou apresentar baixa saturação de oxigênio

Produção e caracterização de a-L-arabinofuranosidase de Penicillium janczewskii

A xilana, o segundo principal componente da parede celular vegetal, pertence ao grupo das hemiceluloses, sendo composta por diferentes carboidratos, principalmente xilose e arabinose. Na natureza, devido a sua heterogeneidade estrutural, este complexo polissacarídeo é completamente hidrolisado pela ação sinergística de diferentes enzimas, incluindo xilanases e β-xilosidases, responsáveis pela degradação da sua cadeia principal e outras enzimas chamadas auxiliares ou desramificantes, importantes para remoção dos grupos laterais. Dentre estas últimas, destacam-se as α-L-arabinofuranosidases, enzimas responsáveis pela remoção de resíduos L-arabinofuranosil do polímero. As arabinofuranosidases podem ser produzidas por micro-organismos, como bactérias e fungos, sendo essencialmente enzimas extracelulares. Fungos, especialmente os de solo e madeira, têm sido utilizados para produção de enzimas xilanolíticas, sendo particularmente interessantes do ponto de vista industrial, pelo fato de secretarem suas enzimas diretamente no meio em que se encontram não necessitando de ruptura celular para a liberação das mesmas. Além disso, apresentam níveis de produção mais elevados que os obtidos em culturas bacterianas ou de leveduras. A crescente preocupação com a escassez dos recursos naturais e com a degradação ambiental tem levado à busca por tecnologias mais eficientes, mais competitivas e menos poluentes. Atualmente, muitos processos industriais empregam enzimas microbianas, apresentando inúmeras vantagens em relação às técnicas convencionais. As α-L-arabinofuranosidases podem ser utilizadas individualmente ou em combinação com outras enzimas, representando uma ferramenta promissora para aplicação em diversos processos biotecnológicos como no branqueamento da polpa celulósica, na síntese de oligossacarídeos, na produção de etanol de segunda geração, ou ainda...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo

Expression of a xylose isomerase from Propionibacterium acidipropionici in Saccharomyces cerevisiae aiming the production of lignocellulosic ethanol

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães PereiraDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Um dos principais desafios a serem superados para que a produção de etanol lignocelulósico seja viável é a obtenção de um micro-organismo capaz de fermentar pentoses e hexoses de maneira eficiente. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal micro-organismo utilizado nas fermentações industriais, devido à sua alta eficiência no consumo de glicose e tolerância às altas concentrações de etanol. Entretanto, linhagens selvagens dessa levedura não são capazes de consumir pentoses naturalmente. Desta maneira, a expressão heteróloga de genes que possibilitem o consumo de pentoses em S. cerevisiae é uma abordagem interessante que vem sendo desenvolvida por diversos grupos de pesquisa. A xilose é o açúcar de cinco carbonos presente em maior porcentagem nos materiais lignocelulósicos e é consumida pelos organismos através de duas vias principais, a via da xilose isomerase (XI) e a via oxi-redutiva. A bactéria Propionibacterium acidipropionici, industrialmente interessante por produzir ácido propiônico, foi estudada neste trabalho com relação à sua capacidade de consumir xilose. A partir dos ensaios de fermentação realizados, foi possível comprovar que ela é capaz de consumir este açúcar na msma proporção que a glicose. A análise de dados genômicos de P. acidipropionici indicou que a via da XI é a utilizada para o consumo de xilose. Assim, o gene xylA, que codifica a XI de P. acidipropionici, foi expresso em uma linhagem industrial de S. cerevisiae. Após a realização de testes fermentativos foi possível constatar que a linhagem construída não apresentou consumo de xilose. Apesar da expressão do gene xylA ser comprovada, não foi possível detectar atividade enzimática da XI, resultados que fornecem indícios de que a proteína pode não estar sendo sintetizada ou, caso esteja sendo sintetizada, não é funcional. Mais de 36 XIs provenientes de organismos diferentes já foram expressas em S. cerevisiae, dentre essas apenas 12 foram funcionalmente expressas. As causas da não funcionalidade na maioria das tentativas de expressão heteróloga das XIs são desconhecidas. Entretanto, alguns trabalhos afirmam que esse fenômeno pode estar relacionado ao enovelamento incorreto da xilose isomerase em S. cerevisiae. Desta forma, a expressão de genes que codificam chaperonas específicas é uma estratégia promissora para a obtenção de uma xilose isomerase funcionalAbstract: One of the main challenges to be overcome to enable the production of lignocellulosic ethanol is the development of a microorganism capable of fermenting pentoses and hexoses efficiently. Currently the yeast Saccharomyces cerevisiae is the main microorganism used in industrial fermentations due to its high efficiency in glucose uptake and tolerance to high concentrations of ethanol; however, it is not able to consume pentoses naturally. Thus the heterologous expression of genes that allow the pentose consumption in S. cerevisiae is an interesting approach that has been developed by several research groups. Xylose is the main component in lignocellulosic biomass, and is consumed by organisms through two main pathways, the xylose isomerase (XI) pathway and the oxy-reductive pathway. The bacterium Propionibacterium acidipropionici is industrially interesting for its production of propionic acid, and was studied in this work with respect to its ability to consume xylose. Fermentation assays conducted proved that these bacteria can consume xylose in the same proportion as glucose. The analysis of genomic data from P. acidipropionici indicated that the XI pathway is used to ferment xylose, in this manner the xylA gene encoding this species XI was expressed in an industrial strain of S. cerevisiae. After conducting fermentation tests it was found that the strain developed was not able to consume xylose even though the XI gene was expressed in the yeast. Moreover, it was not possible to detect enzymatic activity of XI, indicating that the protein is probably not being synthesized or it is not functional. Over 36 XIs from different organisms have been expressed in S. cerevisiae, among these only 12 were functionally expressed. The causes of non-functionality in most attempts at heterologous expression of the XIs are unknown, however, some studies claim that this event may be related to the absence of chaperones, which assist the correct folding of proteins. Thus the expression of genes that encode specific chaperone is a promising strategy to obtain functional expression of these XIsMestradoGenetica de MicroorganismosMestra em Genética e Biologia Molecula

α-L-Arabinofuranosidase from Penicillium janczewskii: Production with brewer’s spent grain and orange waste

The highest production of α-L-arabinofuranosidase by Penicillium janczewskii in medium with brewer’s spent grain and orange waste was observed when cultivation was carried out in pH 5.0 at 25°C, for 8.5 days under shaking. The α-L-arabinofuranosidase present in the crude filtrate was optimally active at 60°C and pH 4.0; it was stable in a wide range of pH, maintaining 90% of the activity from 2.0 to 8.0. The enzyme was very stable at 40°C, maintaining 90% of the activity within 1 h. The estimated half-life at 50°C was 10 min, and at 60 and 70°C, it was 5 min. This enzyme was activated in the presence of Ba2+, Ca2+, Mn2+ and NH4+ while the ions Pb2+, Mg2+, Hg2+, Co2+ and Cu2+, as well as PMSF, DTT, β-mercaptoethanol, EDTA and SDS inhibited it.Keywords: α-L-Arabinofuranosidase, Penicillium janczewskii, enzyme production, enzyme properties, industrial wastesAfrican Journal of Biotechnology, Vol 13(17), 1796-180

Production of xylanolytic enzymes by Penicillium janczewskii

The production of extracellular xylanase, beta-xylosidase and alpha-L-arabinofuranosidase by the mesophilic fungus Penicillium janczewskii under submerged cultivation was investigated with different carbon sources. Optimization steps included studies of carbon source concentration, temperature of cultivation and initial pH of culture medium. The production of these enzymes was increased two times when cultures were supplemented with brewer's spent grain at 2% concentration, pH 6.0 and carried out at 25 degrees C. Under these optimized conditions were obtained xylanase activity of 15.19 U mL(-1) and 23.54 U mg prot(-1), beta-xylosidase activity of 0.16 U mL(-1) and 0.25 U mg prot(-1) and alpha-L-arabinofuranosidase activity of 0.67 U mL(-1) and 1.04 U mg prot(-1).Brewer's spent grain is a promising substrate for P. janczewskii growth and xylanolytic enzyme production, since it is the main by-product from the brewing industry, available in large amounts and at low-cost in many countries. (C) 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES

Conversion of an inactive xylose isomerase into a functional enzyme by co-expression of GroEL-GroES chaperonins in Saccharomyces cerevisiae

Abstract Background Second-generation ethanol production is a clean bioenergy source with potential to mitigate fossil fuel emissions. The engineering of Saccharomyces cerevisiae for xylose utilization is an essential step towards the production of this biofuel. Though xylose isomerase (XI) is the key enzyme for xylose conversion, almost half of the XI genes are not functional when expressed in S. cerevisiae. To date, protein misfolding is the most plausible hypothesis to explain this phenomenon. Results This study demonstrated that XI from the bacterium Propionibacterium acidipropionici becomes functional in S. cerevisiae when co-expressed with GroEL-GroES chaperonin complex from Escherichia coli. The developed strain BTY34, harboring the chaperonin complex, is able to efficiently convert xylose to ethanol with a yield of 0.44 g ethanol/g xylose. Furthermore, the BTY34 strain presents a xylose consumption rate similar to those observed for strains carrying the widely used XI from the fungus Orpinomyces sp. In addition, the tetrameric XI structure from P. acidipropionici showed an elevated number of hydrophobic amino acid residues on the surface of protein when compared to XI commonly expressed in S. cerevisiae. Conclusions Based on our results, we elaborate an extensive discussion concerning the uncertainties that surround heterologous expression of xylose isomerases in S. cerevisiae. Probably, a correct folding promoted by GroEL-GroES could solve some issues regarding a limited or absent XI activity in S. cerevisiae. The strains developed in this work have promising industrial characteristics, and the designed strategy could be an interesting approach to overcome the non-functionality of bacterial protein expression in yeasts