Characterization of neutralizing human anti-tetanus monoclonal antibodies produced by stable cell lines

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Modelagem Cross-Layer de Perdas de Pacotes Sobre Perdas de PSNR em rede IEEE 802.11ac / Cross-Layer Modeling of Packet Losses Over PSNR in IEEE 802.11ac Network

Neste artigo é apresentado o comportamento da perda de qualidade de vídeo com resolução espacial de 3840x2160 pixel codificados em H.264/AVC e transmitidos pela rede sem fio no padrão IEEE 802.11ac. Para o estudo são realizadas transmissões em ambiente real, onde métricas de QoS (Quality of Service) e QoE (Quality of Experience) são extraídas para proposição da modelagem. Técnicas de regressão linear são utilizadas nos dados medidos, onde a partir da porcentagem de perda de pacote é estimado a perda de PSNR (Peak Signal-to-Noise). O valor de RMSE (Root Mean Square Error) e o Desvio Padrão do Erro (DPE) são calculados para avaliar o desempenho da proposta, e foram encontrados valores inferiores a 2,5 dB para ambas as métricas de desempenho. Validando a proposta

Seminário temático na graduação em direito em tempos de pandemia: relato de experiência do uso de tecnologias digitais na discussão sobre o acesso à justiça na disciplina Filosofia como fio condutor do projeto/ Thematic seminar in the graduate of law in pandemic times: experience report on the use of digital technologies in the discussion about the access to justice in the Philosophy discipline as the main thread of the projec

O uso de metodologias ativas tem por objetivo tornar o aluno sujeito protagonista do processo de ensino aprendizagem. Por meio do modelo de projeto, o Seminário Temático do curso de Direito vespertino da Faculdade Santa Terezinha – CEST do primeiro semestre letivo do ano de 2020 intentou problematizar os impactos do direito fundamental de acesso à justiça na atualidade. Com o advento da pandemia de Covid-19 e obrigatoriedade do isolamento social, modificou-se a metodologia de trabalho, incorporando um Ambiente Virtual de Aprendizagem – AVA e Tecnologias de Informação e Comunicação – TICs. O presente artigo traz um relato dessa experiência, utilizando-se de método dedutivo e de pesquisas bibliográfica e análise documental, com caráter qualitativo. Concluiu-se que a utilização das TICs em conjunto ao uso da metodologia ativa incrementou os resultados, gerando aprofundamento dos trabalhos e o desenvolvimento de capacidade crítica e observação do mundo sob novos ângulos

(Des)vinculações de Planos Municipais de Educação metropolitanos com outros instrumentos de gestão local da educação

Resumo É possível afirmar que são poucos os estudos sobre os Planos Municipais de Educação (PMEs) aprovados no Brasil ao longo do período de vigência do PNE 2001-2010, especialmente os relativos às Regiões Metropolitanas (RMs), cuja necessidade de conhecimento se torna mais evidente em face dos desafios postos pelo PNE 2014-2024 à reformulação desses planos locais. Assim, o presente artigo visa à análise das vinculações previstas em PMEs em relação a outros instrumentos de gestão local da educação, tomando por base empírica os planos pertencentes a dez municípios da RM do estado do Rio de Janeiro, aprovados no período 2001-2012, com vistas ao delineamento de eventuais problemas internos, também relacionados ao planejamento em escala metropolitana. Trata-se de um estudo de caráter exploratório, metodologicamente ancorado na análise de conteúdo de documentos legislativos, cujas conclusões mais gerais apontam, de um lado, nítidas desvinculações em relação ao conjunto de instrumentos de gestão considerados nas análises, e, de outro, ausência de um enfoque regional-metropolitano nesses mesmos planos. Evidencia, ainda, que essas desarticulações locais e regionais constituem importantes reptos a serem superados com vistas à adequação desses planos ao novo PNE, postulando que tais enlaces são passíveis de previsão a partir da compreensão de que um plano de educação não constitui um instrumento independente e suficiente de gestão e, embora se afigure numa espécie de registro de coordenação e sistematização das decisões previstas para a condução das políticas educacionais no município, é parte integrante dessas mesmas políticas e não estranho a elas

HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CD3: obtaining and physico-chemical and functional caracterization with evaluation of the immunoregulatory profile

O CD3 é um conjunto de cadeias proteicas não-covalentemente associadas às cadeias do receptor das células T (TCR). O complexo CD3 é essencial para a ativação dos linfócitos T e até para a correta expressão do seu TCR na superfície celular. O complexo TCR-CD3 é alvo de várias imunoterapias focadas na regulação da atividade dessas células. Anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD3 possuem grande potencial no tratamento de doenças autoimunes (diabetes mellitus I, doenças inflamatórias do intestino), na indução de tolerância em transplantes alogênicos e na imunoterapia oncológica (anticorpos bi-específicos). O mAb anti-CD3 produzido por hibridoma murino possui limitações de uso terapêutico pela indução de reações adversas como proliferação de células T e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Para evitar problemas associados à imunogenicidade das moléculas não-humanas, alguns mAbs anti-CD3 passaram por humanização. como o Otelixizumab, Visilizumab, Teplizumab. O uso experimental de mAbs anti-CD3 humanizados tem sido associado a um aumento de linfócitos T reguladores (Treg) e de citocinas relacionadas com um perfil imunorregulador. Para testar o potencial imunorregulador de um anti-CD3 humanizado a partir de um hibridoma reclonado no Instituto Butantan, este trabalho propõe a avaliação da atividade imunorreguladora induzida por mAbs anti-CD3 humanizados através de ensaios in vitro. Os genes das cadeias leve e pesada da molécula humanizada in silico foram clonados em vetor pCHO e transfectados em células CHO-S. Os clones foram avaliados pela produtividade, crescimento celular e ligação ao CD3 humano. Para os ensaios de ligação por ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi expresso um antígeno humano CD3 gama-épsilon. O gene do antígeno recombinante foi construído por DNA assembly e expresso em Escherichia coli. O perfil de ligação dos anticorpos humanizados é mais baixo do que aquele visto com o anti-CD3 murino, o que indica uma menor afinidade da molécula humanizada. Dos 280 clones de anti-CD3 umanizado, foram selecionados alguns para os ensaios funcionais in vitro com PBMC humano, além do pool estável pré-clonagem. Por citometria de fluxo a taxa de proliferação de dois clones avaliados foi mais baixa do que a induzida por tratamento com o anti-CD3 murino em ambas as concentrações testadas (1 e 5 g/mL). O tratamento com o anticorpo humanizado aumentou a subpopulação de células T CD4&#43 e diminuiu o CD8&#43 em relação ao murino. A subpopulação de Treg (CD4&#43 CD127-CD25highFoxp3&#43 ) aumentou com o tratamento humanizado, ao inverso do mesmo com o anticorpo murino. O perfil de citocinas/quimiocinas (48h/192h) para o tratamento com o anti-CD3 murino foi altamente inflamatório no tempo de 48h na avaliação do sobrenadante e nos tempos de 24 e 72 h no ensaio de marcação intracelular. Os clones humanizados presentaram um perfil próximo ao controle não tratado na avaliação dessas citocinas. Entretanto, o estudo das citocinas intracelulares apresentou um aumento dos granulócitos nos grupos tratados com o anticorpo humanizado, sendo que esses grupos não apresentaram um aumento na produção de IFN-&#947 e TNF-&#945. Estes dados contribuem para a compreensão da cinética do anti-CD3 humanizado, apesar de não conclusivos. Mais estudos são necessários nas possíveis construções do anti-CD3 humanizado (monoespecíficos, biespecíficos etc.).CD3 is a protein chain set non-covalently associated with TCR. The CD3 complex is essential to T cell activation even to the correct TCR expression on the cell surface. TCR-CD3\'s chains are targets for immunotherapies that focus on the regulation of the T cell´s activity. Monoclonal antibodies (mAbs) anti-CD3 have the potential to treat autoimmune diseases (diabetes mellitus I, inflammatory bowel diseases), host-vs-graft disease prevention or reversion, and câncer immunotherapy (bispecific antibodies). Production of the murine anti-CD3 mAb by hybridoma has therapeutics limitations associated with its capacity to cause adverse reactions like T cell proliferation induction and pro-inflammatory cytokines secretion. To overcome those issues also associated with non-human molecules immunogenicity, some anti-CD3 mAbs were humanized like Otelixizumab, Visilizumab, Teplizumab. The experimental usage of humanized anti-CD3 mAbs has been associated with an increase of regulatory T lymphocytes (Treg) and immunoregulatory cytokines. To test the immunoregulatory potential of the humanized anti-CD3 from a murine hybridoma recloned at Butantan Institute, this study aims to evaluate in vitro the regulatory activity of clones of humanized anti-CD3 mAbs. The humanized molecule light and heavy chains genes were cloned into pCHO vector, then transfected into CHO-S. The clones were ranked by their specific productivity, cellular growth, and human CD3 binding capacity. For the binding assay by surface plasmonic resonance (SPR) we used an in-house recombinant antigen of the human CD3 gamma-epsilon. The recombinant antigen was made by DNA assembly technique and expressed in E. coli in inclusion bodies, then solubilized and in vitro refolded. The binding capacity of the humanized anti-CD3 was lower in comparison to the murine molecule, it indicates a low affinity of the humanized anti-CD3. From 280 clones expressing the humanized anti-CD3, some were selected for the in vitro functional assays with human PBMC. By flow cytometry, the proliferation rate induced by two clones was lower than that induced by the murine anti-CD3 treatment at two concentrations, 1 e 5 g/mL. The treatment with the humanized antibody increased the CD4&#43 subpopulation and decreased CD8&#43 cells in relation to the murine version. The Treg (CD4&#43 CD127-CD25highFoxp3&#43) subpopulation was increased when the humanized mAb was added and decreased with the murine antibody treatment. The secreted cytokine profile (48 h/192 h) due to the murine anti-CD3 treatment was highly inflammatory at 48 h and at 24 and 72 h in the intracellular assay. However, the two humanized clones showed a profile close to the non-treated group. The intracellular cytokines assay shows more granulocytes with humanized anti-CD3, and no IFN-&#947 e TNF-&#945 were produced by those group of cells. These data contribute to the understanding of the humanized anti-CD3, although not conclusive. More studies are necessary for the possible constructions of the humanized anti-CD3 (monospecific, bispecific etc.)

<em>In silico</em> Techniques for Prospecting and Characterizing Monoclonal Antibodies

In the past few years, improvement in computational approaches provided faster and less expensive outcomes on the identification, development, and optimization of monoclonal antibodies (mAbs). In silico methods, such as homology modeling, to predict antibody structures, identification of epitope-paratope interactions, and molecular docking are useful to generate 3D structures of the antibody–antigen complexes. It helps identify the key residues involved in the antigen–antibody complex and enable modifications to enhance the antibody binding affinity. Recent advances in computational tools for redesigning antibodies are significant resources to improve antibody biophysical properties, such as binding affinity, solubility, stability, decreasing the timeframe and costs during antibody engineering. The immunobiological market grows continuously with new molecules, both natural and new molecular formats, such as bispecific antibodies, Fc-antibody fusion proteins, and mAb fragments, requiring novel methods for designing, screening, and analyzing. Algorithms and software set the in silico techniques on the innovation frontier

Characterization of Neutralizing Human Anti-Tetanus Monoclonal Antibodies Produced by Stable Cell Lines

Tetanus toxin (TeNT) is produced by C. tetani, a spore-forming bacillus broadly spread in the environment. Although an inexpensive and safe vaccine is available, tetanus persists because of a lack of booster shots and variable responses to vaccines due to immunocompromised status or age-decreased immune surveillance. Tetanus is most prevalent in low- and medium-income countries, where it remains a health problem. Neutralizing monoclonal antibodies (mAbs) can prevent the severity of illness and death caused by C. tetani infection. We identified a panel of mAbs that bind to TeNT, some of which were investigated in a preclinical assay, showing that a trio of mAbs that bind to different sites of TeNT can neutralize the toxin and prevent symptoms and death in mice. We also identified two mAbs that can impair the binding of TeNT to the GT1b ganglioside receptor in neurons. In this work, to generate a series of cell lines, we constructed vectors containing sequences encoding heavy and light constant regions that can receive the paired variable regions resulting from PCRs of human B cells. In this way, we generated stable cell lines for five mAbs and compared and characterized the antibody produced in large quantities, enabling the characterization experiments. We present the results regarding the cell growth and viability in a fed-batch culture, titer measurement, and specific productivity estimation. The affinity of purified mAbs was analyzed by kinetics and under steady-state conditions, as three mAbs could not dissociate from TeNT within 36,000 s. The binding of mAbs to TeNT was confirmed by ELISA and inhibition of toxin binding to GT1b. The use of the mAbs mixture confirmed the individual mAb contribution to inhibition. We also analyzed the binding of mAbs to Fc&gamma;R by surface plasmon resonance (SPR) and the glycan composition. Molecular docking analyses showed the binding site of an anti-tetanus mAb