Fenómeno de cepas y determinantes moleculares de la barrera de transmisión y la neurodegeneración en las enfermedades priónicas

La existencia de cepas en las enfermedades priónicas ha sido objeto de controversia debido a la naturaleza del agente causal de estas patologías, que, según la hipótesis más ampliamente aceptada, carece de cualquier ácido nucleico cuyos polimorfismos pudieran explicar la variabilidad de los fenotipos observados. Las evidencias experimentales reunidas hasta la fecha, no obstante, indican que las cepas existen y que sus propiedades están codificadas en la conformación de las moléculas de PrPSc. Los modelos más actuales consideran que los aislados priónicos constituyen una “nube” de diversos componentes, “subcepas” o “cuasi-especies”, que coexisten en un equilibro inestable y de los cuales uno predomina y determina el fenotipo. Asimismo, estos modelos interpretan las cepas y las barreras de transmisión como dos manifestaciones del mismo fenómeno fundamental: la naturaleza conformacional de los procesos de selección y propagación de los priones.El fenómeno de cepas de priones y la capacidad natural de los estos agentes para adaptarse a nuevos hospedadores dificultan la monitorización y el control de la enfermedad de scrapie, lo que conlleva el riesgo de una aparición inadvertida de nuevas variantes con potencial zoonótico. Resulta por lo tanto crucial caracterizar la variabilidad de cepas presentes en los rebaños ovinos europeos, así como profundizar en la compresión de los fenómenos de selección y adaptación de los priones.Por ello, en el estudio nº 1 se realiza un análisis exhaustivo de varios aislados de scrapie natural de la zona fronteriza transpirenaica mediante bioensayo en las líneas transgénicas ovinas TgShp XI y Tg338. A pesar de que el análisis bioquímico de los aislados originales ovinos mostró resultados bastante homogéneos (con la excepción del inóculo 8L, todos contenían PrPres de 19 kDa), algunos de estos aislados produjeron acumulación de PrPres de 21 kDa en el tejido nervioso de los ratones TgShp XI, aunque sus periodos de supervivencia y características neuropatológicas no fueron diferentes de las del resto de inóculos. Otro grupo de aislados provocó periodos de supervivencia muy largos con bajas tasas de ataque y acumulación de PrPres de 21 kDa en ratones Tg338. Estos animales también presentaban una neuropatología menos severa, con una distribución de las lesiones espongiformes más limitada y la presencia ocasional de placas de amiloide en el encéfalo.Estos resultados sugieren que algunos de los aislados estudiados contienen mezclas de varios componentes, que pueden ser diferenciados y selectivamente amplificados empleando distintos modelos transgénicos. Se identificaron al menos tres subcepas diferentes: una isoforma mayoritaria de 19 kDa, presente en todos los aislados, y dos componentes de 21 kDa, uno que sólo se replica en ratones TgShp XI y otro que aparentemente es capaz de interferir con la propagación de la subcepa dominante en ratones Tg338, restringiendo las lesiones neuropatológicas y prolongando los periodos de supervivencia; es posible que esta interferencia esté mediada por su capacidad amiloidogénica.En contra de la posibilidad de que las subcepas de 21 kDa surgieran de novo por mutación del componente mayoritario de 19 kDa, el hecho de que sólo una proporción de los inóculos provocara este fenotipo hace suponer que dichas subcepas estaban presentes en los inóculos originales en una baja concentración. Sin embargo, la razón por la que cada línea transgénica fue capaz de propagar sólo uno de estos componentes minoritarios se desconoce. Factores como la secuencia de la PrPC ovina que expresan, e incluso los niveles de expresión de PrPC, son capaces de alterar la susceptibilidad selectiva a distintas cepas. En cualquier caso, los resultados de este trabajo sugieren que la coinfección de los animales con más de una cepa de scrapie es más frecuente que la infección con una sola cepa, y que distintos tejidos y órganos pueden acumular cepas diferentes.Las barreras de transmisión están fundamentalmente moduladas por el grado de correspondencia entre las secuencias primarias de la PrPSc entrante y la PrPC del hospedador. Sin embargo, existen otros factores que influyen, como el grado de glicosilación de la PrPC, que se sabe que es capaz de modificar la susceptibilidad de los ratones a la infección con diversas cepas priónicas, así como la eficiencia de propagación in vitro. El empleo de sustratos de PrPC no glicosilada en PMCA ha permitido la amplificación de algunas cepas de priones difíciles de transmitir a modelos murinos. En el estudio nº 2 se explora el efecto que tiene la eliminación de los glicanos sobre la capacidad de propagación in vitro y de transmisión in vivo de los priones responsables de varios tipos de enfermedades priónicas humanas con características atípicas. Para ello se empleó la línea transgénica TgNN6h, que expresa una PrPC humana con mutaciones en los residuos de asparagina 181 y 197, lo que impide su glicosilación. Este tipo de sustrato permitió la amplificación por PMCA de varias cepas priónicas clásicas y atípicas, entre ellas la cepa GSS A117V. La inoculación de esta cepa, previamente adaptada in vitro, en ratones TgNN6h causó el desarrollo de una enfermedad con características neuropatológicas que se correspondían con las de los pacientes humanos, lo que demuestra el mantenimiento de las propiedades de cepa. Por otra parte, el aislado de GSS 6OPRI parecía contener una mezcla de subcepas clásica y atípica, que se manifestaban respectivamente al realizar el bioensayo en un modelo normalmente glicosilada (Tg340) o en el modelo TgNN6h. Finalmente, la inoculación de cualquiera de las cepas atípicas, previamente adaptadas al sustrato no glicosilado por PMCA, no causaba enfermedad en ratones Tg340. En conjunto, estos resultados sugieren que la eliminación de los glicanos facilita la amplificación selectiva de priones con características atípicas, mientras que la presencia de los mismos impide su propagación.En la patogenia de enfermedades priónicas juega un papel clave la muerte neuronal. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a este proceso se desconocen. Varios estudios han sugerido la implicación de un grupo de factores de crecimiento específicos del sistema nervioso denominados neurotrofinas. De entre los receptores a través de los cuales actúan, p75NTR es el más interesante, ya que se ha visto que es capaz de mediar respuestas tanto de supervivencia como de muerte celular en función de varios factores. En el estudio nº 3 se analiza la distribución de esta proteína y su correlación con otros marcadores neuropatológicos de enfermedad priónica en el encéfalo de animales natural y experimentalmente infectados. En ratones Tg338, p75NTR mostró un marcaje glial astrocítico, que era más abundante en individuos infectados en estadio terminal y que se correlacionaba con la espongiosis, el depósito de PrPSc y la gliosis, sugiriendo una implicación de los astrocitos en la patogenia de la neurodegeneración. Por otra parte, los ovinos infectados en estadio preclínico mostraban mayores niveles de inmunomarcaje que los individuos terminales y que los controles, lo que sugiere una sobreexpresión de p75NTR en los estadios tempranos del proceso neurodegenerativo en ovinos, que posteriormente se vería contrarrestada por la pérdida neuronal. Las técnicas diagnósticas de enfermedad priónica actuales poseen una efectividad limitada. El único biomarcador patognomónico de la enfermedad es la presencia de PrPSc en el sistema nervioso, lo que sólo puede demostrarse post-mortem. En consecuencia, se hace precisa la identificación de nuevos biomarcadores, que sean mensurables en tejidos y fluidos fácilmente obtenibles, como la sangre o el líquido cefalorraquídeo (LCR), y que permitan el diagnóstico de los individuos en el estadio preclínico de la enfermedad. Sin embargo, las muestras de pacientes humanos con estas características son escasas y difíciles de conseguir, por lo que es necesario el empleo de modelos alternativos válidos dónde buscar nuevos biomarcadores y testar los ya existentes. En el scrapie clásico, la identificación de animales preclínicos puede realizarse fácilmente mediante la detección inmunohistoquímica de PrPSc en muestras obtenidas por biopsia rectal, aunque la sensibilidad de esta técnica no es la deseable, ya que existen genotipos de Prnp ovino en los que la PrPSc no se disemina por tejido linfoide asociado a mucosa rectal. En el estudio nº 4, se emplearon muestras de LCR de ovinos infectados en estadios terminal y preclínico para validar varios biomarcadores empleados en el diagnóstico rutinario de EET humanas. Los marcadores subrogados de daño neuronal proteína 14-3-3 y tau total se encontraron aumentados exclusivamente en LCR de individuos terminales. Sin embargo, los niveles de PrP total en LCR se encontraron disminuidos también en estadio preclínico. Por su parte, la medida de la “seeding activity” por RT-QuIC en LCR demostró una sensibilidad del 78% en casos terminales y del 62% en preclínicos, mientras que la especificidad fue del 100%. Estos resultados son coherentes con lo visto en pacientes humanos y demuestran la eficacia de estas técnicas para detectar animales positivos de la especie ovina.<br /

An amino acid substitution found in animals with low susceptibility to prion diseases confers a protective dominant-negative effect in prion-infected transgenic mice

While prion diseases have been described in numerous species, some, including those of the Canidae family, appear to show resistance or reduced susceptibility. A better understanding of the factors underlying prion susceptibility is crucial for the development of effective treatment and control measures. We recently demonstrated resistance to prion infection in mice overexpressing a mutated prion protein (PrP) carrying a specific amino acid substitution characteristic of canids. Here, we show that coexpression of this mutated PrP and wild-type mouse PrP in transgenic mice inoculated with different mouse-adapted prion strains (22 L, ME7, RML, and 301C) significantly increases survival times (by 45 to 113%). These data indicate that this amino acid substitution confers a dominant-negative effect on PrP, attenuating the conversion of PrPC to PrPSc and delaying disease onset without altering the neuropathological properties of the prion strains. Taken together, these findings have important implications for the development of new treatment approaches for prion diseases based on dominant-negative proteins

Enfermedades priónicas: historia, diversidad e importancia socioeconómica como paradigma de las Enfermedades Raras

Rare disease are those pathologies that affect a reduced proportion of the population (less than 50 cases per 100 000 people). For this reason, the research on their causes and mechanisms, which is essential to find a way to treat or prevent them, is insufficient. This causes that the patients report a lack of coverage by the health system and the social discrimination that suffering one of these pathologies entails. Among rare diseases, we find the so-called prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies. Although they are relatively well-known due to the health crisis provoked by the “mad cow disease” at the end of the last century, there are still many uncertainties about these disorders that affect both animals and humans. This monograph aims at bringing to light the fascinating history and the diversity of prion diseases, which shook the foundations of the biology known before the 1980s by bringing out a new and puzzling type of infectious agent: prions.Las enfermedades raras son aquellas patologías que afectan a una proporción muy reducida de la población (menos de 50 casos por cada 100 000 personas). Por esta razón, la investigación sobre sus causas y mecanismos, algo imprescindible para dar con una forma de tratarlas o prevenirlas, es insuficiente. Por ello, los pacientes denuncien la falta de cobertura del sistema sanitario y la discriminación social que supone padecer una de estas patologías. Entre las enfermedades raras, se encuentran las denominadas enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles. A pesar de ser relativamente conocidas gracias a la crisis sanitaria que supuso el “mal de las vacas locas” a finales del siglo pasado, se conoce todavía relativamente poco sobre estas patologías que afectan tanto a animales como a humanos. En este monográfico se pretende dar a conocer la fascinante historia y la diversidad de las enfermedades priónicas, que sacudieron los cimientos de la biología conocida hasta los años 80 al poner en escena a un nuevo y desconcertante tipo de agente infeccioso: los priones