NADPH-induced chemiluminescence and lipid peroxidation in kidney microsomes

NADPH-induced chemiluminescence and lipid peroxidation in kidney microsomes. Lipid peroxidation and reactive oxygen species have been shown to affect diverse biological processes potentially important in renal disease. We therefore examined NADPH-induced chemiluminescence (CL) and lipid peroxidation (LP) by renal cortical and, in some experiments, medullary microsomes. We further examined the role of reactive oxygen species in these processes by the use of enzymatic and chemical scavengers. Cortical microsomes gave a marked NADPH-induced CL accompanied by LP. The time course of LP closely paralleled the CL response. Cortical microsomal CL and LP increased with increasing concentrations of protein (0.3 to 1.8 mg) and NADPH (0.1 to 3.0mM); NADH could not substitute for NADPH. Using similar amounts of protein and NADPH concentrations, cortical CL was significantly higher than medullary CL at all time points examined (peak cortical CL: 490 ± 25 × 103 cpm/mg protein, N = 4; peak medullary CL: 226 ± 61 × 103 cpm/mg protein, N = 4). Cortical LP was similarly higher at all time points, values corresponding to peak CL being 44.7 ± 3 nmoles/mg protein for cortex and 29.9 ± 0.8 nmoles/mg protein for medulla. Para-chloromercuribenzoate (PCMB), an inhibitor of NADPH-cytochrome P450 reductase, caused a marked inhibition of the microsomal CL and LP whereas SKF 525A, an inhibitor of cytochrome P450, had a relatively minor effect. Marked inhibition of NADPH induced CL and LP was observed with chelators EDTA and 1,10-phenanthroline. The addition of NADPH to microsomes prepared with sucrose-EDTA and washed in a Chelex-treated buffer gave a negligible CL and LP response; the responses were restored by the addition of iron. Scavengers of superoxide anion (superoxide dismutase), hydrogen peroxide (catalase), and the hydroxyl radical (sodium benzoate, tryptophan) had a relatively minor effect on CL and LP. Singlet oxygen quenchers sodium azide and 1,4-diazabicyclo (2.2.2) octane (DABCO) caused an incomplete inhibition of CL and LP responses and then only after the first 30min. Taken together, these data suggest that other free radical mechanisms are likely to be important in the CL and LP responses. These results which demonstrate the production of excited states and LP by renal microsomes suggest that their role in renal disease deserves further study.Chemiluminescence induite par le NADPH et peroxydation des lipides dans les microsomes de rein. Il a été montré que la peroxydation des lipides et le type d'oxygène réactif modifient diversement les processus biologiques potentiellement importants dans les maladies rénales. C'est pourquoi nous avons examiné la chemiluminescence (CL) induite par le NADPH, et la peroxydation (LP) des lipides par des microsomes corticaux et dans quelques expériences, médullaires rénaux. Nous avons ensuite examiné le rôle du type d'oxygène réactif dans ces processus en utilisant des agents métabolisants enzymatiques et chimiques. Les microsomes corticaux donnaient une CL marquée induite par le NADPH accompagnée par une LP. Dans le temps, la LP était étroitement parallèle à la réponse CL. La CL et la LP microsomiales corticales s'élevaient avec l'accroissement des concentrations de protéines (0, 1 à 1,8 mg) et de NADPH (0,1 à 3,0mM); le NADH ne pouvait so substituer au NADPH. En utilisant des quantités identiques de protéines et de NADPH, la CL corticale était significativement plus élevée que la CL médullaire à tous les temps examinés (pic de CL corticale: 490 ± 25 × 103 cpm/mg protéine, N = 4, pic de CL médullaire: 226 ± 61 × 103 cpm/mg protéine, N = 4). De même la LP corticale était plus élevée à tous les temps, les valeurs correspondant au pic de CL étant de 44,7 ± 3 nmoles/mg protéine pour le cortex et de 29,9 ± 0,8 nmoles/mg protéine pour la médullaire. Le parachloromercuribenzoate (PCMB), un inhibiteur de la réductase NADPH-cytochrome P450a entraîné une inhibition marquée de la CL et de la LP microsomiales tandis que le SKF 525 A, un inhibiteur du cytochrome P450, avait un effet relativement minime. Une inhibition marquée de la CL induite par le NADPH et de la LP a été observée avec des chélateurs tels l'EDTA et le 1,10-phénanthroline. L'addition de NADPH à des microsomes préparés dans du sucrose-EDTA et lavés dans un tampon traité au Chelex entraînait une réponse CL et LP négligeable; les réponses étaient restaurées par l'addition de fer. Les agents métabolisants l'anion superoxide (dismutase superoxide), le peroxide d'hydrogène (catalase), et le radical hydroxylé (benzoate de sodium, tryptophane) avaient un effet relativement minime sur CL et LP. Les capteurs d'oxygène singulet comme l'azide de sodium et le 1,4-diazabicyclo (2.2.2) octane (DABCO) entraînaient une inhibition incomplète des réponses CL et LP et cela seulement après les 30 premières min. Prises dans leur ensemble, ces données suggèrent que d'autres mécanismes par radicaux libres sont probablement importants dans les réponses CL et LP. Ces résultats, qui démontrent la production d'états excités et de LP par des microsomes rénaux, suggèrent que leur rôle dans les maladies rénales nécessite d'autres études

The Inhibitory Effect of siRNAs on The High Glucose-Induced Overexpression of TGF-β1 in Mesangial Cells

Diabetic nephropathy is characterized by an expansion of the glomerular mesangium, caused by mesangial cell proliferation and an excessive accumulation of extracellar matrix (ECM) proteins, which eventually leading to glomerulosclerosis. TGF-β1 was found to play an important role in the accumulation of ECM in the kidney. In this study, TGF-β1 RNA interference was used as an effective therapeutic strategy. The inhibitory effect of TGF-β1 small interfering RNAs (siRNAs) on the high glucose-induced overexpression of TGF-β1 in rat mesangial ceys (RMCs). A high levels of glucose induces TGF-β1 mRNA and protein, and TGF-β1 siRNAs reduce the ability of high glucose to stimulate their expression. We also examined the inhibitory effect of TGF-β1 siRNAs on the expression of plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 and Collagen Type I which are down-regulators of TGF-β1. The expression of TGF-β1, PAI-1 and Collagen Type I was increased in RMCs that were stimulated by 30 mM glucose. TGF-β1 siRNAs reduces high glucose-induced TGF-β1, PAI-1, and Collagen Type I mRNA and protein expression in a dose-dependent manner. In conclusion, the present study demonstrates that TGF-β1 siRNAs effectively inhibits TGF-β1 mRNA and protein expression in RMCs. These suggest that TGF-β1 siRNAs through RNAi may be a useful tool for developing new therapeutic applications for the treatment of diabetic nephropathy

Molecular analysis of metastasis in a polyomavirus middle T mouse model: the role of osteopontin

INTRODUCTION: In order to study metastatic disease, we employed the use of two related polyomavirus middle T transgenic mouse tumor transplant models of mammary carcinoma (termed Met and Db) that display significant differences in metastatic potential. METHODS: Through suppression subtractive hybridization coupled to the microarray, we found osteopontin (OPN) to be a highly expressed gene in the tumors of the metastatic mouse model, and a lowly expressed gene in the tumors of the lowly metastatic mouse model. We further analyzed the role of OPN in this model by examining sense and antisense constructs using in vitro and in vivo methods. RESULTS: With in vivo metastasis assays, the antisense Met cells showed no metastatic tumor formation to the lungs of recipient mice, while wild-type Met cells, with higher levels of OPN, showed significant amounts of metastasis. The Db cells showed a significantly reduced metastasis rate in the in vivo metastasis assay as compared with the Met cells. Db cells with enforced overexpression of OPN showed elevated levels of OPN but did not demonstrate an increase in the rate of metastasis compared with the wild-type Db cells. CONCLUSIONS: We conclude that OPN is an essential regulator of the metastatic phenotype seen in polyomavirus middle T-induced mammary tumors. Yet OPN expression alone is not sufficient to cause metastasis. These data suggest a link between metastasis and phosphatidylinositol-3-kinase-mediated transcriptional upregulation of OPN, but additional phosphatidylinositol-3-kinase-regulated genes may be essential in precipitating the metastasis phenotype in the polyomavirus middle T model

Place du Raloxifène dans le traitement de l'ostéoporose

L'ostéoporose est définie comme une affection diffuse du squelette, caractérisée par une masse osseuse basse et des altérations micro architecturales du tissu osseux, conduisant à une augmentation de la fragilité osseuse et à un risque accru de fractures. Les traitements sont les THS, les biphosphonates, les SERM (dont le raloxifène) et le Calcium + Vitamine D. L'interêt du raloxifène est évident en relais des THS dans la prévention de l'ostéoporose ou en alternative aux biphosphonates lors d'un traitement curatif. Une réduction significative de l'incidence des fractures vertébrales mais non des fractures de l'extrémité du fémur a été démontrée. Il a par ailleurs un effet bénéfique sur le cancer du sein, aucun effet néfaste sur l'utérus et des effets cardiovasculaires. De plus le raloxifène possède les même contre-indications par rapport aux accidents thrombo-emboliques. Il n'a ni d'effets sur les manifestations climatériques ni sur les fractures périphériquesTOULOUSE3-BU Santé-Centrale (315552105) / SudocTOULOUSE3-BU Santé-Allées (315552109) / SudocSudocFranceF