Estudio retrospectivo para la detección de cromatolisis idiopatica neuronal del tronco del encefalo (IBNC) en bovinos adultos.

En los humanos, la mayoría de las demencias crónicas están asociadas a la hiperfosforilación y agregación generalizada intra y extracelular de una proteína asociada a microtúbulos denominada tau. De relevancia, cabe destacar la enfermedad de Alzheimer, el Parkinson y el Huntington, y otras menos frecuentes como la parálisis supranuclear, la demencia con granos argirófilos, la degeneración corticobasal y la demencia frontotemporal familiar. En los animales domésticos, las únicas enfermedades que podrían considerarse tauopatías son las lesiones detectadas en animales senescentes y en los afectados por enfermedades priónicas. La cromatolisis idiopática neuronal del tronco del encéfalo (Idiopathic Brainstem Neuronal Chromatolysis; IBNC) en bovinos adultos es una enfermedad que fue reconocida por primera vez en Reino Unido a consecuencia del análisis histopatológico masivo de animales en el curso de la crisis de la Encefalopatía espongiforme bovina (EEB). El objetivo del presente trabajo es el análisis retrospectivo de la médula oblongada a nivel del obex de bovinos recibidos en el Centro Nacional de Referencia de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles, con el fin de evaluar la presencia de IBNC en animales sospechosos de padecer la EEB que fueron diagnosticados como negativos. Para la metodología del trabajo, se han seleccionado todos aquellos animales sospechosos de padecer una EEB que fueron diagnosticados como negativos. Posteriormente se ha realizado el procesado histológico rutinario y tinción con hematoxilina y eosina para la evaluación de las lesiones típicas de esta enfermedad. Los resultados encontrados en el presente trabajo reflejan que, de los 165 animales analizados, aproximadamente un 17% muestran lesiones compatibles con una Listeriosis; un 10% han mostrado fragilidad vascular; un 58% cursaron con sintomatología y lesiones inespecíficas, no atribuibles a ningún proceso concreto pero compatibles con procesos víricos de carácter leve; y finalmente, un 15% de las muestras analizadas reflejaron lesiones compatibles con procesos neurodegenerativos y similares a las descritas en la cromatolisis idiopática neuronal del tronco del encéfalo. Estudios específicos de inmunohistoquímica y western blot serán realizados como continuación de este estudio con el fin de caracterizar la proteína tau y confirmar o descartar la presencia de la IBNC en nuestro país

Caracterización molecular y fenotípica del agente causal en casos no concluyentes de Encefalopatías espongiformes transmisibles animales

Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas que, tras un largo periodo de incubación, provocan la muerte. El origen de la enfermedad reside en el cambio conformacional de una proteína localizada fisiológicamente en el tejido nervioso (proteína prión celular, PrPc) que adquiere características patológicas (PrPsc), siendo el único agente causal conocido y denominado prión. La identificación de los depósitos de PrPsc en el tejido nervioso central se considera específica de la enfermedad y en ello se basan la mayoría de las técnicas diagnósticas. Aunque estas enfermedades afectan a varias especies animales, además de a la humana, las más importantes son la enfermedad bovina (Encefalopatía espongiforme bovina), ovina y caprina (Scrapie), la del visón (Encefalopatía transmisible del visón) y la que afecta a cérvidos (enfermedad crónica caquectizante). El presente trabajo se ha centrado en la primera de ellas, la Encefalopatía espongiforme bovina (EEB). Tras la aparición de la EEB y el incremento progresivo en el número de casos de la enfermedad bovina desde 1987 y, particularmente, tras la demostración de la transmisión de ésta a humanos (variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, vECJ), se consideró absolutamente necesario disponer de métodos de diagnóstico sensibles y específicos. Por otra parte, el elevado número de animales a analizar obligó a disponer de técnicas de diagnóstico rápido, aunque ello supusiera una cierta pérdida en su sensibilidad. En el curso del programa de vigilancia de la EEB establecido para la identificación de los casos de la enfermedad y la aplicación de las correspondientes medidas de control de la misma, uno de los problemas que surgió fue la existencia de muestras que ofrecían resultados no concluyentes. En este trabajo se han estudiado varias muestras que no presentaron un resultado concluyente con las técnicas de confirmación aplicadas de rutina, inmunohistoquímica (IHQ) y Western blot (WB), y que además presentaban un estado muy avanzado de autolisis. El objetivo planteado era analizar estas muestras mediante la aplicación de las técnicas de confirmación establecidas por la OIE, adaptándolas a las características que presentaban. Pero, además, se planteó realizar por primera vez una comparación exhaustiva sobre la capacidad de cada una de ellas para llevar a cabo el diagnóstico de este tipo de muestras. Para el estudio, se han seleccionado 5 muestras de tejido encefálico bovino que presentaban un avanzado estado de autolisis y que habían sido diagnosticadas como muestras no concluyentes. Con la técnica rápida utilizada (Prionics-Check Western test) estas muestras evidenciaron una señal, pero no lo suficientemente evidente como para ser consideradas como positivas, por lo que se aplicaron todas las técnicas de confirmación establecidas por la OIE, todas ellas con modificaciones debido al carácter autolítico que presentaban y, también, teniendo en consideración la hipótesis de que se pudiera partir de una cantidad muy baja de PrPsc. Las técnicas diagnósticas de confirmación fueron la inmunohistoquímica (IHQ), el Western blot (WB; SAF Immunoblot), la visualización de las fibrillas asociadas a Scrapie (SAF) mediante microscopía electrónica y el bioensayo en ratón. No fue posible utilizar la histología en estas muestras a causa de su autolisis. Por otra parte, se llevó a cabo también una técnica de diferenciación (WB) para intentar determinar el agente causal involucrado en estas muestras y evaluar la posibilidad de que una nueva cepa, diferente a la convencional, pudiera estar presente en ellas. Respecto al resultado obtenido con las técnicas de confirmación aplicadas en este trabajo, se ha observado que la inmunohistoquímica y la microscopía electrónica han sido capaces de confirmar el resultado positivo de las muestras, mientras que el Western blot sólo ha mostrado algunos signos de positividad, pero sin lograr confirmar el diagnóstico. El bioensayo en ratón ha mostrado eficacia, pero no total, al transmitir la enfermedad sólo en un número limitado de ratones. La inmunohistoquímica ha permitido confirmar la positividad de las muestras al revelar depósitos de PrPsc en todas ellas, aunque fue preciso previamente realizar una adaptación del protocolo convencional debido al estado autolítico de las mismas. Dicha adaptación de la técnica para muestras con avanzado estado de autolisis había sido establecida con anterioridad en el Centro de Investigación en Encefalopatías y Enfermedades Transmisibles Emergentes, pero en este trabajo se ha corroborado por primera vez en modelo in vivo la eficacia de la técnica y su alta sensibilidad, lo que la convierte en una técnica adecuada y fiable para el diagnóstico de la EEB, a pesar del estado autolítico de las muestras analizadas. Del mismo modo, la microscopía electrónica se ha revelado como una técnica muy sensible y objetiva para diagnosticar esta clase de muestras, ya que ha permitido confirmar los resultados observados en la inmunocitoquímica mediante la visualización de SAF, estructuras formadas por PrPsc que sólo aparecen en animales afectados por la enfermedad. A pesar de que la sola observación de las fibrillas es suficiente para realizar un diagnóstico definitivo, este hallazgo ha sido corroborado con la aplicación de la inmunohistoquímica con oro coloidal, al unirse las partículas de oro a la PrPsc localizada en las fibrillas. La aplicación del Western blot de la OIE no ha ofrecido un resultado concluyente porque, a pesar de realizar previamente todos los protocolos de concentración y purificación, sólo se ha obtenido una señal muy débil. Con el WB de diferenciación se ha podido observar una señal sugestiva de positividad, pero también débil, por lo que no ha sido suficiente para determinar el patrón de glicosilación correspondiente al agente causal presente en las muestras analizadas. Respecto al bioensayo, en este trabajo se evidencia que esta técnica puede presentar en algunas ocasiones problemas para obtener un diagnóstico concluyente en este tipo de muestras. Aunque se ha confirmado la positividad de las muestras bovinas, ya que en cada uno de los grupos inoculados con las diferentes muestras se han detectado ratones positivos, el número de éstos ha sido muy reducido. Por otra parte, el depósito de PrPsc en placa, característico de la inoculación de EEB en la especie murina, sólo se ha observado en un ratón, a diferencia del resto de animales que han presentado depósitos de PrPsc con un patrón granular. Los resultados obtenidos por inmunohistoquímica en este modelo in vivo se han corroborado al detectarse SAF mediante la técnica de la microscopía electrónica. El conjunto de los resultados obtenidos en este estudio, mediante la aplicación de todas las técnicas utilizadas, puede ser explicado por la naturaleza y características de las muestras estudiadas. Así, parece que la autolisis no afecta en gran medida al diagnóstico de las muestras, ya que no logra impedir la obtención de un resultado concluyente en ellas. Por otro lado, la posibilidad de la presencia de una cepa con nuevas características no ha podido ser descartada. La explicación más probable para todos los resultados obtenidos con las técnicas aplicadas parece ser la baja concentración de PrPsc de partida presente en las muestras bovinas, que justificaría los resultados obtenidos en este estudio. Esta hipótesis se reforzaría si se tiene en cuenta la digestión enzimática que está asociada a los procesos de autolisis y que implicaría una disminución adicional de esa concentración de partida. Ello podría explicar el mayor tiempo de incubación de los animales inoculados respecto al observado en otros estudios similares, la presencia del depósito de PrPsc granular (no en placa) visto en la mayoría de los animales inoculados, así como el menor número y tamaño de las SAF visualizadas por microscopía electrónica. Por otra parte, la falta de concordancia entre los animales con signos clínicos y su respuesta en técnicas de confirmación observada en algunos casos, podría ser explicada por la posibilidad de requerir periodos más largos de incubación asociados a la baja concentración de PrPsc, aunque también podría deberse a una relación no exclusiva entre la presencia de PrPsc y la infectividad, como ya ha sido sugerida por algunos autores

Estudio anatomopatológico de tumores en perros y gatos

Los tumores son una patología frecuente en perros y gatos, aunque su prevalencia varía porregiones geográficas, dependiendo de las condiciones socioeconómicas del país. En ocasiones,estos tumores son la causa de la muerte o sacrificio, aunque pueden ser también hallazgosincidentales en animales muertos por diferentes causas. El diagnóstico tumoral, en ocasiones,puede resultar difícil, siendo necesario el empleo de técnicas especiales, como lainmunohistoquímica, para caracterizarlos adecuadamente.Este trabajo pretende analizar la prevalencia de tumores en perros y gatos que han llegado a lasala de necropsias de la Facultad de Veterinaria en los cinco últimos años, así como caracterizardichos tumores anatomopatológicamente. También se quiere observar qué tumores son causade muerte directa o sacrificio, y cuáles son hallazgos de necropsia.<br /

Valoración de la cobertura vacunal antirrábica

La rabia es una enfermedad vírica, causada por virus pertenecientes al género Lyssavirus. Es una zoonosis que produce una encefalomielitis, casi siempre mortal una vez que han aparecido los síntomas clínicos. Su distribución es mundial y aunque la incidencia real de rabia humana se desconoce, la OMS estima que cada año se producen en el mundo unas 55.000 muertes por esta enfermedad, principalmente en países en desarrollo. España está libre de esta zoonosis en mamíferos terrestres desde 1978. Desde esta fecha, se han diagnosticado varios casos de "rabia importada", en perros procedentes de Marruecos. A este dato hay que añadir que se han declarado una veintena de murciélagos positivos al virus en España. Teniendo en cuenta estos datos epidemiológicos, así como la situación geográfica de nuestro país como zona de paso entre Europa y países endémicos, resulta necesario extremar las medidas de prevención y control de la enfermedad. Con el fin de lograr una percepción real de la situación actual de protección y vacunación contra la rabia se realiza un estudio preliminar para valorar el estado inmunológico frente al virus causal de esta enfermedad en una muestra representativa de cánidos mediante la determinación de anticuerpos contra dicho virus. Se aplica una prueba serológica basada en un ELISA indirecto como técnica inmunológica admitida por la OIE para la detección cualitativa de anticuerpos contra la rabia en muestras de sueros individuales con el objeto de determinar si los animales presentan seroconversión tras su vacunación. El estudio se ha llevado a cabo sobre 17 muestras, procedentes de perros del Albergue Sanitario de Movera (Zaragoza). El estudio evidencia que en el 23.5 % y 5.9 % de los perros muestreados se ha logrado la seroconversión al presentar títulos iguales o superiores a 0.5 UI/ml, respectivamente, mientras que el 70.6 % restante no alcanza este umbral de protección establecido por la OIE

Aproximación diagnóstica al mastocitoma cutáneo canino

El mastocitoma canino (MTC) es una de las neoplasias malignas de células cutáneas más comunes en el perro y presenta una gran variedad de apariencias tanto histológicas como de comportamiento. La etiología no es muy conocida aunque se han descrito diferentes factores que afectan en la aparición de este tumor. Los mastocitomas son diagnosticados inicialmente por citología. El protocolo terapéutico es la cirugía, la radioterapia y/o la quimioterapia. Se elegirá una u otra en función del estadio clínico, de las características histopatológicas y de otros factores de pronóstico. Es absolutamente necesario realizar un estudio histopatológico para determinar el grado histológico, el estado de los márgenes quirúrgicos y el índice mitótico. Estos datos histopatológicos permiten valorar su comportamiento biológico y orientar el tratamiento y el pronóstico. Los objetivos de este trabajo son tres. El primero es realizar una revisión bibliográfica bien documentada y actualizada sobre el mastocitoma canino. El segundo es realizar un estudio histológico y citológico de una serie de casos de este tumor. De esta manera aprender a diagnosticar esta neoplasia, conocer los diferentes grados de clasificación histológica y aprender a reconocer las características que histológicamente llevan a emitir un pronóstico y orientar el tratamiento. El tercero es asistir a las consultas de oncología en el Hospital Veterinario de la Universidad de Zaragoza para conocer los aspectos clínicos y la metodología de trabajo en la consulta, pudiendo acceder al archivo de historiales clínicos del hospital, para así relacionar las características histopatológicas y clínicas. Para alcanzar estos objetivos se utilizará la siguiente metodología. Uso de libros, publicaciones y plataformas científicas para realizar la revisión bibliográfica. Conocimiento de las técnicas y características citológicas e histológicas correspondientes para diagnosticar y emitir un pronóstico. Comprender la clínica mediante el estudio de historiales y aplicar la metodología de trabajo en las consultas de oncología

Contribuciones al estudio de biomarcadores, terapia y fenómeno de cepas en las enfermedades priónicas

Las enfermedades priónicas son trastornos neurodegenerativos mortales que no se pueden prevenir o tratar, por lo que actualmente muchas de las investigaciones en torno a estas enfermedades se centran en el desarrollo de tratamientos específicos. Se considera que parte de la muerte neuronal que ocurre en las enfermedades priónicas se debe a la activación de la apoptosis y la alteración de la homeostasis de mecanismos autofágicos. El fragmento C-terminal no tóxico de la toxina tetánica (TTC) se ha descrito como una molécula neuroprotectora que se une a los receptores Trk desencadenando vías de supervivencia neuronal, inhibiendo la apoptosis y regulando la autofagia. Debido a esto, en el estudio número 1 de esta tesis, se presenta un estudio piloto para probar el potencial terapéutico del TTC en las enfermedades priónicas. Ratones wild type de la línea C57BL6 y ratones transgénicos Tg338, que sobreexpresan la PrPC ovina en su variante VRQ/VRQ, se inocularon intracerebralmente con el agente priónico del scrapie y luego fueron tratados mediante la inyección intramuscular de TTC. Los resultados de este estudio muestran, en el grupo tratado de ambos modelos murinos, una disminución de las proteínas caspasa-3 y p62 y un aumento de LC3B y NeuN a nivel encefálico. Además, los ratones wild type tratados mostraron diferencias en la regulación de la expresión génica de Atg5, Becn1 y Fbxw7. Así, se observa que la inyección de TTC generó efectos neuroprotectores en ambos modelos murinos de enfermedad priónica a través de la reducción de la apoptosis y de la regulación de la autofagia, lo que resultó en un aumento de la supervivencia neuronal, pese a no aumentar el tiempo de supervivencia. Estos hallazgos refuerzan el papel del TTC como regulador de la apoptosis y la autofagia en enfermedades neurodegenerativas y, lo que es más importante, como molécula neuroprotectora. Otro de los principales focos de las investigaciones actuales en enfermedades priónicas está en la búsqueda de biomarcadores que permitan detectar la enfermedad en fases preclínicas. La neurogranina (Ng) y la cadena ligera del neurofilamento (NfL) son proteínas que reflejan el daño sináptico y axonal y se postulan como buenos biomarcadores para trastornos neurodegenerativos. En el estudio número 2, se evalúan Ng y NfL como posibles biomarcadores preclínicos en la enfermedad de scrapie. Para esto, se estudia tanto su concentración proteica como su nivel de expresión génica en el sistema nervioso central (SNC) de ovejas afectadas por scrapie en estadios preclínico y clínico, en comparación con controles sanos. Además, se evalúan también sus niveles en líquido cefalorraquídeo (LCR) y su correlación con los principales eventos neuropatológicos en las enfermedades priónicas, el depósito de PrPSc y la espongiosis. Los resultados muestran una disminución en los niveles de expresión proteica y génica de Ng y NfL a medida que avanza la enfermedad, y cambios significativos entre los animales del grupo control y preclínico. Por el contrario, los niveles de LCR de NfL aumentaron a lo largo de la progresión de la enfermedad. Además, se encontró una correlación negativa entre los marcadores neuropatológicos de enfermedad priónica y la concentración de las proteínas estudiadas. Así, en este estudio se corrobora que la concentración en el tejido nervioso de Ng y NfL, marcadores de daño sináptico y axonal, se ve afectada por la acumulación de priones, y que esta condición es detectable incluso en etapas preclínicas enfermedad priónica. Por lo tanto, los resultados obtenidos respaldan la utilidad de ambas proteínas como biomarcadores preclínicos para enfermedades priónicas. Los priones son patógenos exclusivamente proteicos cuya estructura terciaria y cuaternaria puede diferir, dando lugar a la aparición de diferentes cepas, que se manifiestan a través de variabilidad fenotípica. Además, la capacidad de transmisión de los priones a las diferentes especies está íntimamente ligada con sus características de cepa. Ampliar el conocimiento y la caracterización de las cepas priónicas es crucial para evaluar el potencial de los priones para infectar distintas especies, y para el control y la erradicación de las enfermedades priónicas. En el scrapie, se ha visto que varias cepas pueden propagarse a partir de un mismo aislado, por lo que se considera que, en ciertos casos, distintas cepas coexisten en el aislado original. Por esto, en el estudio número 3, se evalúa, mediante la técnica de Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA), la presencia de cepas de scrapie asociadas a un perfil de 21kDa en aislados de origen ovino y su evolución durante su transmisión seriada en un bioensayo en ratones que expresan la PrPC ovina. Para esto, se utilizó la PMCA en diferentes condiciones para evaluar la cantidad y proporción de subcomponentes contenidos en distintas muestras del bioensayo. Los resultados muestran que la PMCA se puede utilizar en determinadas condiciones en las que el fenotipo de 19kDa, asociado a una cepa de scrapie, no es amplificable. Bajo estas mismas condiciones, la PMCA es capaz de amplificar el subcomponente de 21kDa del scrapie, asociado a varias cepas distintas de esta enfermedad. A partir del método de PMCA establecido en este estudio, además, se detecta el componente de 21kDa en aislados de scrapie ovino que mostraban en un inicio un perfil de glicosilación de 19kDa. Por tanto, los resultados demuestran, por un lado, que la PMCA se puede utilizar para detectar cepas de 21kDa en homogeneizados que muestran una firma de 19kDa, y también que es capaz de detectar la selección diferencial dependiente del tejido que ocurre en los bioensayos. Por otro lado, y de forma más importante, los resultados sugieren que algunos aislados naturales de scrapie ovino utilizados en el estudio contenían mezclas de cepas y que la coinfección con varias cepas podría ocurrir de forma frecuente en la naturaleza. La generación in vitro de priones recombinantes infecciosos fue un gran logro en la investigación de las enfermedades priónicas ya que permite la producción de PrP recombinante de alta pureza para su uso en futuras investigaciones. Sin embargo, estos priones recombinantes pueden existir y propagarse en muchas conformaciones que pueden diferir en su patogenicidad y ser desde absolutamente inocuas hasta letales, lo que limita su uso como buenos modelos de priones. La generación de priones recombinantes que retengan las características de los priones de mamífero es de crucial importancia, ya que el conocimiento obtenido de los estudios con priones recombinantes podría ayudar a comprender los aspectos desconocidos de la patogénesis de las enfermedades priónicas. En el estudio número 4 de esta tesis, se analizan comparativamente las características de distintas cepas priónicas de mamífero y de sus homólogas recombinantes tras su bioensayo en el modelo TgVole, con el fin de determinar cómo varían sus propiedades biológicas tras propagarse in vitro sobre una proteína recombinante y posteriormente in vivo. Tras la inoculación de las cepas de mamífero de scrapie 22L, RML, 263K y ME7, así como de cepas recombinantes homólogas de éstas en el modelo transgénico TgVole, que expresa la PrPC 109I del bank vole, todas fueron capaces de producir enfermedad en los animales. Además, las cepas recombinantes 22L-PMSA-2 y RML-PMSA-1, obtenidas tras la replicación in vitro de las cepas naturales 22L y RML respectivamente, mostraron una gran similitud con sus homólogas naturales en las características neuropatológicas asociadas a la infección por priones (espongiosis y depósito de PrPSc). Aunque este estudio se completará en el futuro con el análisis de las propiedades bioquímicas de estas cepas, los resultados obtenidos implican que estas dos cepas de scrapie mantienen sus propiedades neuropatológicas tras su propagación en proteína recombinante, y que por lo tanto podrían ser buenos modelos para posteriores estudios. Los cuatro estudios desarrollados en esta tesis han cumplido los objetivos de la misma, ampliando el conocimiento actual tanto sobre la patogenia, diagnóstico y tratamiento de las enfermedades priónicas como de los priones como agentes patógenos. <br /

El papel de la glía en la progresión de las enfermedades priónicas: Estudio morfológico

Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET), también llamadas enfermedades priónicas, pertenecen a un grupo de patologías neurodegenerativos con pronóstico fatal en todos los casos que afectan al ser humano y a algunas especies animales. Aunque la vía de transmisión difiere según el tipo de EET, todas ellas se asocian a la acumulación de la proteína prión patológica (PrPsc) en determinadas áreas específicas del sistema nervioso central (SNC). Se caracterizan por presentar largos períodos de incubación, cursar con trastornos neurológicos progresivos con déficit cognitivo, sensorial y motor y no generar respuesta inmunitaria ni inflamatoria. La PrPsc es una isoforma anormal de la proteína prión celular (PrPc) que en estado fisiológico se localiza principalmente en el tejido nervioso, y que al sufrir un cambio de conformación que altera su estructura terciaria y adquirir un incorrecto plegamiento se convierte en patológica. Las principales alteraciones neuropatológicas que presentan las EET son pérdida neuronal, gliosis y cambio espongiforme inducido por la vacuolización del neuropilo y pericarion neuronal. El diagnóstico se realiza mediante examen histopatológico y la detección de la PrPsc mediante inmunohistoquímica o Western Blot, principalmente. En este trabajo se utilizaron los modelos naturales de Scrapie ovino y de ECJ humano para determinar el papel de la glía, en concreto de las astroglía y la microglía, en las EET. En concreto, mediante la utilización del modelo animal se ha pretendido determinar su implicación en la propagación de la enfermedad a través de la valoración de los cambios producidos en relación con estas poblaciones gliales en diferentes estadios clínicos (pre-clínico, clínico y terminal) de la enfermedad. Para ello, en el estudio se incluyeron animales que se encontraban en diferentes estadios de Scrapie. También se llevó a cabo un estudio sobre muestras de tejido cerebelar humano, que habían sido diagnosticados de ECJ. En concreto, EJC esporádico o familiar. Para determinar la participación de la neuroglía y describir las lesiones neuropatológicas en el tejido cerebelar humano y ovino, se aplicaron técnicas histológicas de tinción con hematoxilina eosina y de inmunotinción con diferentes anticuerpos específicos para la valoración mediante microscopía óptica y confocal. Los resultados más relevantes en relación con el modelo de Scrapie consisten en que el inmunomarcaje frente a la GFAP en las muestras analizadas demostró un evidente aumento cuantitativo, principalmente en relación con las células de Purkinje, conforme la enfermedad avanzaba. Otra observación destacable es la correspondencia del inmunomarcaje frente a la proteína GFAP con la glía de Bergmann, tanto en el estadio pre-clínico como en el terminal. Las principales observaciones histopatológicas realizadas demostraron vacuolización perineuronal e intraneuronal alrededor de las células de Purkinje, intensificándose en la fase terminal, que a menudo se asociaba a la muerte de este tipo celular. En este último estadio, también se encontró un engrosamiento de las neuritas de las células de Purkinje que había sido descrita en la especie humana, pero no en la animal. La implicación de la microglía en el progreso de la enfermedad no pudo confirmarse al observarse una escasa presencia de microglía reactiva independientemente del estadio clínico en el que se encontrara el animal. Sin embargo, sí que fue posible establecer una clara relación entre el comportamiento de esta microglía y el genotipo que presentaba el animal. En el modelo humano, los estudios realizados sobre hiperplasia y/o hipertrofia astrocítica permitieron clasificar las muestras en dos patrones distintos: uno caracterizado por una intensa inmunoreacción en todas las capas y otro por una reactividad principalmente localizada en la sustancia blanca. En ambos patrones se observó una inmunotinción coincidente con la glía de Bergmann. Los estudios realizados utilizando la inmunohistoquímica para detectar la microglía reactiva sobre las muestras humanas permitieron su clasificación en tres grupos: en el primer grupo, la reactividad se observó en todas las capas del cerebelo; en el segundo, la reactividad se localizaba casi exclusivamente en las capas molecular y granular; y en el tercero, ésta se detectaba preferentemente en la sustancia blanca. Respecto a las observaciones histopatológicas en las muestras de pacientes diagnosticados de ECJ evidenciaron además de vacuolización, una enorme pérdida neuronal, engrosamiento de las neuritas de las células de Purkinje, presencia de rosetas floridas en la sustancia blanca y capa granular de una muestra, así como de agregados proteicos

Valoración de la respuesta inflamatoria en el scrapie como prototipo de enfermedad priónica

Las enfermedades priónicas son un conjunto de enfermedades neurodegenerativas con largos periodos de incubación y para las cuales actualmente no existe tratamiento.Tradicionalmente, se ha considerado que no existía una respuesta inmunológica por parte del individuo afectado frente al agente causal de estas enfermedades debido a que no existe infiltración linfocitaria. Sin embargo, en los últimos años se ha demostrado que en todas las enfermedades neurodegenerativas existe un proceso de neuroinflamación que puede conducir a la neurodegeneración. La hipótesis neuroinflamatoria está basada en el hecho de que un estímulo patológico (el depósito de proteína prion) va a provocar la activación de la neuroglía,fundamentalmente astroglía y microglía, que a su vez van a liberar una serie de mediadores inflamatorios en el encéfalo pudiendo contribuir al progreso neurodegenerativo. Aunque la principal función de las células gliales ha sido tradicionalmente considerada la neuroprotección, aún no está claro cuál es su papel real, ya que también existen evidencias de que podrían ejercer un efecto potenciador de la neurodegeneración, convirtiéndose enneurotóxicas. Por lo tanto, dicha hipótesis pone de manifiesto que las células gliales pueden representar el objetivo de estudios dirigidos a establecer una diana terapéutica potencial que pudiera ralentizar la neurodegeneración.Con este escenario, en esta tesis doctoral se han llevado a cabo cuatro estudios para abordar diferentes aspectos de la respuesta inmunológica que se produce en distintos estadios de la enfermedad de scrapie, prototipo de estudio de las enfermedades priónicas. El objetivo es realizar una aproximación global al proceso neuroinflamatorio que se produce en el progreso neurodegenerativo de esta enfermedad, además de analizar el efecto de una terapia antiinflamatoria sobre parámetros clínicos y neuropatológicos, definiendo para ello lasvariaciones morfológicas y de intensidad de las células astro y microgliales, así como de varias citoquinas como marcadores neuroinflamatorios que éstas liberan, para finalmente poder comprender mejor su comportamiento durante el proceso neurodegenerativo.Se ha desarrollado un modelo de terapia crónica con el glucocorticoide sintético dexametasona con el fin de evaluar el efecto del fármaco sobre la respuesta neuroglial, confirmándose la delicada interacción existente entre las poblaciones astroglial y microglial. Se ha demostrado que el tratamiento ha sido efectivo en la reducción de la vacuolización y el depósito de proteína prión patológica en la fase temprana (en la que aún existe una respuestaneuroglial intacta), mientras que parece existir una parálisis y/o astenia astroglial en el estadio más avanzado de scrapie (cuando presentan sintomatología clínica), confirmándose que las terapias antiinflamatorias pueden presentar potencial terapéutico solamente en estados incipientes. Sin embargo, resulta esperanzadora la extensión del periodo de supervivencia observada en una de las ovejas clínicas tratadas, al abrir la posibilidad de que estos fármacos puedan tener eficacia al menos en algunos casos clínicos.Dentro de los objetivos planteados, también se pretendía evaluar la expresión de varias citoquinas y/o receptores en diferentes áreas encefálicas durante el progreso del scrapie. Las observaciones realizadas confirman la existencia de una respuesta inmunológica a nivel local a través de una compleja red de citoquinas, sugiriendo que la neuroglía intenta restablecer la homeostasis del encéfalo en las fases iniciales de la enfermedad, pero surge un fallo funcional en estas poblaciones celulares conforme avanza la neurodegeneración, probablemente de lacomunicación entre astroglía y microglía, mediado por distintas citoquinas, de forma especial la IL-1.En definitiva, el conjunto de los resultados obtenidos en los cuatro estudios incluidos en esta tesis doctoral contribuyen a la elaboración del patrón neuroinflamatorio global que sucede en el progreso del scrapie ovino natural. Además, el modelo de este grupo de enfermedades podría ser extrapolable al proceso neurodegenerativo que sucede en el resto de enfermedades priónicas y prion-like, en las que también existe un depósito de proteína aberrante como estímulo patológico.<br /

Estudio de rutas de vacunación en modelo murino para el uso profiláctico o terapéutico de vacunas atenuadas de tuberculosis

La tuberculosis es una de las enfermedades infecciosas que produce mayor mortalidad en el mundo. El agente causante es Mycobacterium tuberculosis que convive estrechamente con el hombre desde sus inicios como Homo sapiens. De momento, la única vacuna disponible es BCG (derivada de Mycobacterium bovis) pero esta no es efectiva contra la tuberculosis pulmonar en adultos, que es además la forma responsable de la transmisión de la enfermedad. Actualmente muchos equipos de investigación están trabajando en el desarrollo de nuevas vacunas y tratamientos eficaces, siendo MTBVAC la única vacuna candidata basada en la atenuación del agente patógeno causante de la tuberculosis humana. La eficacia de esta vacuna está siendo actualmente estudiada en ensayos clínicos en Fase III de eficacia. Previo a la fase clínica todos los estudios conllevan una fase de estudios preclínicos in vitro y después en animales de experimentación. El modelo murino es el modelo de elección en animales de experimentación, principalmente por su facilidad de manejo, economía de estabulado y disponibilidad de reactivos específicos de ratón para estudios inmunológicos. En esta tesis relacionamos distintos modelos de experimentación en ratones para lo cual hemos seleccionado 4 estudios de investigación basados en las vacunas vivas atenuadas MTBVAC y BCG. <br /