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Estudio retrospectivo para la detecci贸n de cromatolisis idiopatica neuronal del tronco del encefalo (IBNC) en bovinos adultos.
En los humanos, la mayor铆a de las demencias cr贸nicas est谩n asociadas a la hiperfosforilaci贸n y agregaci贸n generalizada intra y extracelular de una prote铆na asociada a microt煤bulos denominada tau. De relevancia, cabe destacar la enfermedad de Alzheimer, el Parkinson y el Huntington, y otras menos frecuentes como la par谩lisis supranuclear, la demencia con granos argir贸filos, la degeneraci贸n corticobasal y la demencia frontotemporal familiar. En los animales dom茅sticos, las 煤nicas enfermedades que podr铆an considerarse tauopat铆as son las lesiones detectadas en animales senescentes y en los afectados por enfermedades pri贸nicas. La cromatolisis idiop谩tica neuronal del tronco del enc茅falo (Idiopathic Brainstem Neuronal Chromatolysis; IBNC) en bovinos adultos es una enfermedad que fue reconocida por primera vez en Reino Unido a consecuencia del an谩lisis histopatol贸gico masivo de animales en el curso de la crisis de la Encefalopat铆a espongiforme bovina (EEB). El objetivo del presente trabajo es el an谩lisis retrospectivo de la m茅dula oblongada a nivel del obex de bovinos recibidos en el Centro Nacional de Referencia de las Encefalopat铆as Espongiformes Transmisibles, con el fin de evaluar la presencia de IBNC en animales sospechosos de padecer la EEB que fueron diagnosticados como negativos. Para la metodolog铆a del trabajo, se han seleccionado todos aquellos animales sospechosos de padecer una EEB que fueron diagnosticados como negativos. Posteriormente se ha realizado el procesado histol贸gico rutinario y tinci贸n con hematoxilina y eosina para la evaluaci贸n de las lesiones t铆picas de esta enfermedad. Los resultados encontrados en el presente trabajo reflejan que, de los 165 animales analizados, aproximadamente un 17% muestran lesiones compatibles con una Listeriosis; un 10% han mostrado fragilidad vascular; un 58% cursaron con sintomatolog铆a y lesiones inespec铆ficas, no atribuibles a ning煤n proceso concreto pero compatibles con procesos v铆ricos de car谩cter leve; y finalmente, un 15% de las muestras analizadas reflejaron lesiones compatibles con procesos neurodegenerativos y similares a las descritas en la cromatolisis idiop谩tica neuronal del tronco del enc茅falo. Estudios espec铆ficos de inmunohistoqu铆mica y western blot ser谩n realizados como continuaci贸n de este estudio con el fin de caracterizar la prote铆na tau y confirmar o descartar la presencia de la IBNC en nuestro pa铆s
Caracterizaci贸n molecular y fenot铆pica del agente causal en casos no concluyentes de Encefalopat铆as espongiformes transmisibles animales
Las Encefalopat铆as Espongiformes Transmisibles (EET) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas que, tras un largo periodo de incubaci贸n, provocan la muerte. El origen de la enfermedad reside en el cambio conformacional de una prote铆na localizada fisiol贸gicamente en el tejido nervioso (prote铆na pri贸n celular, PrPc) que adquiere caracter铆sticas patol贸gicas (PrPsc), siendo el 煤nico agente causal conocido y denominado pri贸n. La identificaci贸n de los dep贸sitos de PrPsc en el tejido nervioso central se considera espec铆fica de la enfermedad y en ello se basan la mayor铆a de las t茅cnicas diagn贸sticas. Aunque estas enfermedades afectan a varias especies animales, adem谩s de a la humana, las m谩s importantes son la enfermedad bovina (Encefalopat铆a espongiforme bovina), ovina y caprina (Scrapie), la del vis贸n (Encefalopat铆a transmisible del vis贸n) y la que afecta a c茅rvidos (enfermedad cr贸nica caquectizante). El presente trabajo se ha centrado en la primera de ellas, la Encefalopat铆a espongiforme bovina (EEB). Tras la aparici贸n de la EEB y el incremento progresivo en el n煤mero de casos de la enfermedad bovina desde 1987 y, particularmente, tras la demostraci贸n de la transmisi贸n de 茅sta a humanos (variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, vECJ), se consider贸 absolutamente necesario disponer de m茅todos de diagn贸stico sensibles y espec铆ficos. Por otra parte, el elevado n煤mero de animales a analizar oblig贸 a disponer de t茅cnicas de diagn贸stico r谩pido, aunque ello supusiera una cierta p茅rdida en su sensibilidad. En el curso del programa de vigilancia de la EEB establecido para la identificaci贸n de los casos de la enfermedad y la aplicaci贸n de las correspondientes medidas de control de la misma, uno de los problemas que surgi贸 fue la existencia de muestras que ofrec铆an resultados no concluyentes. En este trabajo se han estudiado varias muestras que no presentaron un resultado concluyente con las t茅cnicas de confirmaci贸n aplicadas de rutina, inmunohistoqu铆mica (IHQ) y Western blot (WB), y que adem谩s presentaban un estado muy avanzado de autolisis. El objetivo planteado era analizar estas muestras mediante la aplicaci贸n de las t茅cnicas de confirmaci贸n establecidas por la OIE, adapt谩ndolas a las caracter铆sticas que presentaban. Pero, adem谩s, se plante贸 realizar por primera vez una comparaci贸n exhaustiva sobre la capacidad de cada una de ellas para llevar a cabo el diagn贸stico de este tipo de muestras. Para el estudio, se han seleccionado 5 muestras de tejido encef谩lico bovino que presentaban un avanzado estado de autolisis y que hab铆an sido diagnosticadas como muestras no concluyentes. Con la t茅cnica r谩pida utilizada (Prionics-Check Western test) estas muestras evidenciaron una se帽al, pero no lo suficientemente evidente como para ser consideradas como positivas, por lo que se aplicaron todas las t茅cnicas de confirmaci贸n establecidas por la OIE, todas ellas con modificaciones debido al car谩cter autol铆tico que presentaban y, tambi茅n, teniendo en consideraci贸n la hip贸tesis de que se pudiera partir de una cantidad muy baja de PrPsc. Las t茅cnicas diagn贸sticas de confirmaci贸n fueron la inmunohistoqu铆mica (IHQ), el Western blot (WB; SAF Immunoblot), la visualizaci贸n de las fibrillas asociadas a Scrapie (SAF) mediante microscop铆a electr贸nica y el bioensayo en rat贸n. No fue posible utilizar la histolog铆a en estas muestras a causa de su autolisis. Por otra parte, se llev贸 a cabo tambi茅n una t茅cnica de diferenciaci贸n (WB) para intentar determinar el agente causal involucrado en estas muestras y evaluar la posibilidad de que una nueva cepa, diferente a la convencional, pudiera estar presente en ellas. Respecto al resultado obtenido con las t茅cnicas de confirmaci贸n aplicadas en este trabajo, se ha observado que la inmunohistoqu铆mica y la microscop铆a electr贸nica han sido capaces de confirmar el resultado positivo de las muestras, mientras que el Western blot s贸lo ha mostrado algunos signos de positividad, pero sin lograr confirmar el diagn贸stico. El bioensayo en rat贸n ha mostrado eficacia, pero no total, al transmitir la enfermedad s贸lo en un n煤mero limitado de ratones. La inmunohistoqu铆mica ha permitido confirmar la positividad de las muestras al revelar dep贸sitos de PrPsc en todas ellas, aunque fue preciso previamente realizar una adaptaci贸n del protocolo convencional debido al estado autol铆tico de las mismas. Dicha adaptaci贸n de la t茅cnica para muestras con avanzado estado de autolisis hab铆a sido establecida con anterioridad en el Centro de Investigaci贸n en Encefalopat铆as y Enfermedades Transmisibles Emergentes, pero en este trabajo se ha corroborado por primera vez en modelo in vivo la eficacia de la t茅cnica y su alta sensibilidad, lo que la convierte en una t茅cnica adecuada y fiable para el diagn贸stico de la EEB, a pesar del estado autol铆tico de las muestras analizadas. Del mismo modo, la microscop铆a electr贸nica se ha revelado como una t茅cnica muy sensible y objetiva para diagnosticar esta clase de muestras, ya que ha permitido confirmar los resultados observados en la inmunocitoqu铆mica mediante la visualizaci贸n de SAF, estructuras formadas por PrPsc que s贸lo aparecen en animales afectados por la enfermedad. A pesar de que la sola observaci贸n de las fibrillas es suficiente para realizar un diagn贸stico definitivo, este hallazgo ha sido corroborado con la aplicaci贸n de la inmunohistoqu铆mica con oro coloidal, al unirse las part铆culas de oro a la PrPsc localizada en las fibrillas. La aplicaci贸n del Western blot de la OIE no ha ofrecido un resultado concluyente porque, a pesar de realizar previamente todos los protocolos de concentraci贸n y purificaci贸n, s贸lo se ha obtenido una se帽al muy d茅bil. Con el WB de diferenciaci贸n se ha podido observar una se帽al sugestiva de positividad, pero tambi茅n d茅bil, por lo que no ha sido suficiente para determinar el patr贸n de glicosilaci贸n correspondiente al agente causal presente en las muestras analizadas. Respecto al bioensayo, en este trabajo se evidencia que esta t茅cnica puede presentar en algunas ocasiones problemas para obtener un diagn贸stico concluyente en este tipo de muestras. Aunque se ha confirmado la positividad de las muestras bovinas, ya que en cada uno de los grupos inoculados con las diferentes muestras se han detectado ratones positivos, el n煤mero de 茅stos ha sido muy reducido. Por otra parte, el dep贸sito de PrPsc en placa, caracter铆stico de la inoculaci贸n de EEB en la especie murina, s贸lo se ha observado en un rat贸n, a diferencia del resto de animales que han presentado dep贸sitos de PrPsc con un patr贸n granular. Los resultados obtenidos por inmunohistoqu铆mica en este modelo in vivo se han corroborado al detectarse SAF mediante la t茅cnica de la microscop铆a electr贸nica. El conjunto de los resultados obtenidos en este estudio, mediante la aplicaci贸n de todas las t茅cnicas utilizadas, puede ser explicado por la naturaleza y caracter铆sticas de las muestras estudiadas. As铆, parece que la autolisis no afecta en gran medida al diagn贸stico de las muestras, ya que no logra impedir la obtenci贸n de un resultado concluyente en ellas. Por otro lado, la posibilidad de la presencia de una cepa con nuevas caracter铆sticas no ha podido ser descartada. La explicaci贸n m谩s probable para todos los resultados obtenidos con las t茅cnicas aplicadas parece ser la baja concentraci贸n de PrPsc de partida presente en las muestras bovinas, que justificar铆a los resultados obtenidos en este estudio. Esta hip贸tesis se reforzar铆a si se tiene en cuenta la digesti贸n enzim谩tica que est谩 asociada a los procesos de autolisis y que implicar铆a una disminuci贸n adicional de esa concentraci贸n de partida. Ello podr铆a explicar el mayor tiempo de incubaci贸n de los animales inoculados respecto al observado en otros estudios similares, la presencia del dep贸sito de PrPsc granular (no en placa) visto en la mayor铆a de los animales inoculados, as铆 como el menor n煤mero y tama帽o de las SAF visualizadas por microscop铆a electr贸nica. Por otra parte, la falta de concordancia entre los animales con signos cl铆nicos y su respuesta en t茅cnicas de confirmaci贸n observada en algunos casos, podr铆a ser explicada por la posibilidad de requerir periodos m谩s largos de incubaci贸n asociados a la baja concentraci贸n de PrPsc, aunque tambi茅n podr铆a deberse a una relaci贸n no exclusiva entre la presencia de PrPsc y la infectividad, como ya ha sido sugerida por algunos autores
Estudio anatomopatol贸gico de tumores en perros y gatos
Los tumores son una patolog铆a frecuente en perros y gatos, aunque su prevalencia var铆a porregiones geogr谩ficas, dependiendo de las condiciones socioecon贸micas del pa铆s. En ocasiones,estos tumores son la causa de la muerte o sacrificio, aunque pueden ser tambi茅n hallazgosincidentales en animales muertos por diferentes causas. El diagn贸stico tumoral, en ocasiones,puede resultar dif铆cil, siendo necesario el empleo de t茅cnicas especiales, como lainmunohistoqu铆mica, para caracterizarlos adecuadamente.Este trabajo pretende analizar la prevalencia de tumores en perros y gatos que han llegado a lasala de necropsias de la Facultad de Veterinaria en los cinco 煤ltimos a帽os, as铆 como caracterizardichos tumores anatomopatol贸gicamente. Tambi茅n se quiere observar qu茅 tumores son causade muerte directa o sacrificio, y cu谩les son hallazgos de necropsia.<br /
Valoraci贸n de la cobertura vacunal antirr谩bica
La rabia es una enfermedad v铆rica, causada por virus pertenecientes al g茅nero Lyssavirus. Es una zoonosis que produce una encefalomielitis, casi siempre mortal una vez que han aparecido los s铆ntomas cl铆nicos. Su distribuci贸n es mundial y aunque la incidencia real de rabia humana se desconoce, la OMS estima que cada a帽o se producen en el mundo unas 55.000 muertes por esta enfermedad, principalmente en pa铆ses en desarrollo. Espa帽a est谩 libre de esta zoonosis en mam铆feros terrestres desde 1978. Desde esta fecha, se han diagnosticado varios casos de "rabia importada", en perros procedentes de Marruecos. A este dato hay que a帽adir que se han declarado una veintena de murci茅lagos positivos al virus en Espa帽a. Teniendo en cuenta estos datos epidemiol贸gicos, as铆 como la situaci贸n geogr谩fica de nuestro pa铆s como zona de paso entre Europa y pa铆ses end茅micos, resulta necesario extremar las medidas de prevenci贸n y control de la enfermedad. Con el fin de lograr una percepci贸n real de la situaci贸n actual de protecci贸n y vacunaci贸n contra la rabia se realiza un estudio preliminar para valorar el estado inmunol贸gico frente al virus causal de esta enfermedad en una muestra representativa de c谩nidos mediante la determinaci贸n de anticuerpos contra dicho virus. Se aplica una prueba serol贸gica basada en un ELISA indirecto como t茅cnica inmunol贸gica admitida por la OIE para la detecci贸n cualitativa de anticuerpos contra la rabia en muestras de sueros individuales con el objeto de determinar si los animales presentan seroconversi贸n tras su vacunaci贸n. El estudio se ha llevado a cabo sobre 17 muestras, procedentes de perros del Albergue Sanitario de Movera (Zaragoza). El estudio evidencia que en el 23.5 % y 5.9 % de los perros muestreados se ha logrado la seroconversi贸n al presentar t铆tulos iguales o superiores a 0.5 UI/ml, respectivamente, mientras que el 70.6 % restante no alcanza este umbral de protecci贸n establecido por la OIE
Aproximaci贸n diagn贸stica al mastocitoma cut谩neo canino
El mastocitoma canino (MTC) es una de las neoplasias malignas de c茅lulas cut谩neas m谩s comunes en el perro y presenta una gran variedad de apariencias tanto histol贸gicas como de comportamiento. La etiolog铆a no es muy conocida aunque se han descrito diferentes factores que afectan en la aparici贸n de este tumor. Los mastocitomas son diagnosticados inicialmente por citolog铆a. El protocolo terap茅utico es la cirug铆a, la radioterapia y/o la quimioterapia. Se elegir谩 una u otra en funci贸n del estadio cl铆nico, de las caracter铆sticas histopatol贸gicas y de otros factores de pron贸stico. Es absolutamente necesario realizar un estudio histopatol贸gico para determinar el grado histol贸gico, el estado de los m谩rgenes quir煤rgicos y el 铆ndice mit贸tico. Estos datos histopatol贸gicos permiten valorar su comportamiento biol贸gico y orientar el tratamiento y el pron贸stico. Los objetivos de este trabajo son tres. El primero es realizar una revisi贸n bibliogr谩fica bien documentada y actualizada sobre el mastocitoma canino. El segundo es realizar un estudio histol贸gico y citol贸gico de una serie de casos de este tumor. De esta manera aprender a diagnosticar esta neoplasia, conocer los diferentes grados de clasificaci贸n histol贸gica y aprender a reconocer las caracter铆sticas que histol贸gicamente llevan a emitir un pron贸stico y orientar el tratamiento. El tercero es asistir a las consultas de oncolog铆a en el Hospital Veterinario de la Universidad de Zaragoza para conocer los aspectos cl铆nicos y la metodolog铆a de trabajo en la consulta, pudiendo acceder al archivo de historiales cl铆nicos del hospital, para as铆 relacionar las caracter铆sticas histopatol贸gicas y cl铆nicas. Para alcanzar estos objetivos se utilizar谩 la siguiente metodolog铆a. Uso de libros, publicaciones y plataformas cient铆ficas para realizar la revisi贸n bibliogr谩fica. Conocimiento de las t茅cnicas y caracter铆sticas citol贸gicas e histol贸gicas correspondientes para diagnosticar y emitir un pron贸stico. Comprender la cl铆nica mediante el estudio de historiales y aplicar la metodolog铆a de trabajo en las consultas de oncolog铆a
Contribuciones al estudio de biomarcadores, terapia y fen贸meno de cepas en las enfermedades pri贸nicas
Las enfermedades pri贸nicas son trastornos neurodegenerativos mortales que no se pueden prevenir o tratar, por lo que actualmente muchas de las investigaciones en torno a estas enfermedades se centran en el desarrollo de tratamientos espec铆ficos. Se considera que parte de la muerte neuronal que ocurre en las enfermedades pri贸nicas se debe a la activaci贸n de la apoptosis y la alteraci贸n de la homeostasis de mecanismos autof谩gicos. El fragmento C-terminal no t贸xico de la toxina tet谩nica (TTC) se ha descrito como una mol茅cula neuroprotectora que se une a los receptores Trk desencadenando v铆as de supervivencia neuronal, inhibiendo la apoptosis y regulando la autofagia. Debido a esto, en el estudio n煤mero 1 de esta tesis, se presenta un estudio piloto para probar el potencial terap茅utico del TTC en las enfermedades pri贸nicas. Ratones wild type de la l铆nea C57BL6 y ratones transg茅nicos Tg338, que sobreexpresan la PrPC ovina en su variante VRQ/VRQ, se inocularon intracerebralmente con el agente pri贸nico del scrapie y luego fueron tratados mediante la inyecci贸n intramuscular de TTC. Los resultados de este estudio muestran, en el grupo tratado de ambos modelos murinos, una disminuci贸n de las prote铆nas caspasa-3 y p62 y un aumento de LC3B y NeuN a nivel encef谩lico. Adem谩s, los ratones wild type tratados mostraron diferencias en la regulaci贸n de la expresi贸n g茅nica de Atg5, Becn1 y Fbxw7. As铆, se observa que la inyecci贸n de TTC gener贸 efectos neuroprotectores en ambos modelos murinos de enfermedad pri贸nica a trav茅s de la reducci贸n de la apoptosis y de la regulaci贸n de la autofagia, lo que result贸 en un aumento de la supervivencia neuronal, pese a no aumentar el tiempo de supervivencia. Estos hallazgos refuerzan el papel del TTC como regulador de la apoptosis y la autofagia en enfermedades neurodegenerativas y, lo que es m谩s importante, como mol茅cula neuroprotectora. Otro de los principales focos de las investigaciones actuales en enfermedades pri贸nicas est谩 en la b煤squeda de biomarcadores que permitan detectar la enfermedad en fases precl铆nicas. La neurogranina (Ng) y la cadena ligera del neurofilamento (NfL) son prote铆nas que reflejan el da帽o sin谩ptico y axonal y se postulan como buenos biomarcadores para trastornos neurodegenerativos. En el estudio n煤mero 2, se eval煤an Ng y NfL como posibles biomarcadores precl铆nicos en la enfermedad de scrapie. Para esto, se estudia tanto su concentraci贸n proteica como su nivel de expresi贸n g茅nica en el sistema nervioso central (SNC) de ovejas afectadas por scrapie en estadios precl铆nico y cl铆nico, en comparaci贸n con controles sanos. Adem谩s, se eval煤an tambi茅n sus niveles en l铆quido cefalorraqu铆deo (LCR) y su correlaci贸n con los principales eventos neuropatol贸gicos en las enfermedades pri贸nicas, el dep贸sito de PrPSc y la espongiosis. Los resultados muestran una disminuci贸n en los niveles de expresi贸n proteica y g茅nica de Ng y NfL a medida que avanza la enfermedad, y cambios significativos entre los animales del grupo control y precl铆nico. Por el contrario, los niveles de LCR de NfL aumentaron a lo largo de la progresi贸n de la enfermedad. Adem谩s, se encontr贸 una correlaci贸n negativa entre los marcadores neuropatol贸gicos de enfermedad pri贸nica y la concentraci贸n de las prote铆nas estudiadas. As铆, en este estudio se corrobora que la concentraci贸n en el tejido nervioso de Ng y NfL, marcadores de da帽o sin谩ptico y axonal, se ve afectada por la acumulaci贸n de priones, y que esta condici贸n es detectable incluso en etapas precl铆nicas enfermedad pri贸nica. Por lo tanto, los resultados obtenidos respaldan la utilidad de ambas prote铆nas como biomarcadores precl铆nicos para enfermedades pri贸nicas. Los priones son pat贸genos exclusivamente proteicos cuya estructura terciaria y cuaternaria puede diferir, dando lugar a la aparici贸n de diferentes cepas, que se manifiestan a trav茅s de variabilidad fenot铆pica. Adem谩s, la capacidad de transmisi贸n de los priones a las diferentes especies est谩 铆ntimamente ligada con sus caracter铆sticas de cepa. Ampliar el conocimiento y la caracterizaci贸n de las cepas pri贸nicas es crucial para evaluar el potencial de los priones para infectar distintas especies, y para el control y la erradicaci贸n de las enfermedades pri贸nicas. En el scrapie, se ha visto que varias cepas pueden propagarse a partir de un mismo aislado, por lo que se considera que, en ciertos casos, distintas cepas coexisten en el aislado original. Por esto, en el estudio n煤mero 3, se eval煤a, mediante la t茅cnica de Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA), la presencia de cepas de scrapie asociadas a un perfil de 21kDa en aislados de origen ovino y su evoluci贸n durante su transmisi贸n seriada en un bioensayo en ratones que expresan la PrPC ovina. Para esto, se utiliz贸 la PMCA en diferentes condiciones para evaluar la cantidad y proporci贸n de subcomponentes contenidos en distintas muestras del bioensayo. Los resultados muestran que la PMCA se puede utilizar en determinadas condiciones en las que el fenotipo de 19kDa, asociado a una cepa de scrapie, no es amplificable. Bajo estas mismas condiciones, la PMCA es capaz de amplificar el subcomponente de 21kDa del scrapie, asociado a varias cepas distintas de esta enfermedad. A partir del m茅todo de PMCA establecido en este estudio, adem谩s, se detecta el componente de 21kDa en aislados de scrapie ovino que mostraban en un inicio un perfil de glicosilaci贸n de 19kDa. Por tanto, los resultados demuestran, por un lado, que la PMCA se puede utilizar para detectar cepas de 21kDa en homogeneizados que muestran una firma de 19kDa, y tambi茅n que es capaz de detectar la selecci贸n diferencial dependiente del tejido que ocurre en los bioensayos. Por otro lado, y de forma m谩s importante, los resultados sugieren que algunos aislados naturales de scrapie ovino utilizados en el estudio conten铆an mezclas de cepas y que la coinfecci贸n con varias cepas podr铆a ocurrir de forma frecuente en la naturaleza. La generaci贸n in vitro de priones recombinantes infecciosos fue un gran logro en la investigaci贸n de las enfermedades pri贸nicas ya que permite la producci贸n de PrP recombinante de alta pureza para su uso en futuras investigaciones. Sin embargo, estos priones recombinantes pueden existir y propagarse en muchas conformaciones que pueden diferir en su patogenicidad y ser desde absolutamente inocuas hasta letales, lo que limita su uso como buenos modelos de priones. La generaci贸n de priones recombinantes que retengan las caracter铆sticas de los priones de mam铆fero es de crucial importancia, ya que el conocimiento obtenido de los estudios con priones recombinantes podr铆a ayudar a comprender los aspectos desconocidos de la patog茅nesis de las enfermedades pri贸nicas. En el estudio n煤mero 4 de esta tesis, se analizan comparativamente las caracter铆sticas de distintas cepas pri贸nicas de mam铆fero y de sus hom贸logas recombinantes tras su bioensayo en el modelo TgVole, con el fin de determinar c贸mo var铆an sus propiedades biol贸gicas tras propagarse in vitro sobre una prote铆na recombinante y posteriormente in vivo. Tras la inoculaci贸n de las cepas de mam铆fero de scrapie 22L, RML, 263K y ME7, as铆 como de cepas recombinantes hom贸logas de 茅stas en el modelo transg茅nico TgVole, que expresa la PrPC 109I del bank vole, todas fueron capaces de producir enfermedad en los animales. Adem谩s, las cepas recombinantes 22L-PMSA-2 y RML-PMSA-1, obtenidas tras la replicaci贸n in vitro de las cepas naturales 22L y RML respectivamente, mostraron una gran similitud con sus hom贸logas naturales en las caracter铆sticas neuropatol贸gicas asociadas a la infecci贸n por priones (espongiosis y dep贸sito de PrPSc). Aunque este estudio se completar谩 en el futuro con el an谩lisis de las propiedades bioqu铆micas de estas cepas, los resultados obtenidos implican que estas dos cepas de scrapie mantienen sus propiedades neuropatol贸gicas tras su propagaci贸n en prote铆na recombinante, y que por lo tanto podr铆an ser buenos modelos para posteriores estudios. Los cuatro estudios desarrollados en esta tesis han cumplido los objetivos de la misma, ampliando el conocimiento actual tanto sobre la patogenia, diagn贸stico y tratamiento de las enfermedades pri贸nicas como de los priones como agentes pat贸genos. <br /
El papel de la gl铆a en la progresi贸n de las enfermedades pri贸nicas: Estudio morfol贸gico
Las Encefalopat铆as Espongiformes Transmisibles (EET), tambi茅n llamadas enfermedades pri贸nicas, pertenecen a un grupo de patolog铆as neurodegenerativos con pron贸stico fatal en todos los casos que afectan al ser humano y a algunas especies animales. Aunque la v铆a de transmisi贸n difiere seg煤n el tipo de EET, todas ellas se asocian a la acumulaci贸n de la prote铆na pri贸n patol贸gica (PrPsc) en determinadas 谩reas espec铆ficas del sistema nervioso central (SNC). Se caracterizan por presentar largos per铆odos de incubaci贸n, cursar con trastornos neurol贸gicos progresivos con d茅ficit cognitivo, sensorial y motor y no generar respuesta inmunitaria ni inflamatoria. La PrPsc es una isoforma anormal de la prote铆na pri贸n celular (PrPc) que en estado fisiol贸gico se localiza principalmente en el tejido nervioso, y que al sufrir un cambio de conformaci贸n que altera su estructura terciaria y adquirir un incorrecto plegamiento se convierte en patol贸gica. Las principales alteraciones neuropatol贸gicas que presentan las EET son p茅rdida neuronal, gliosis y cambio espongiforme inducido por la vacuolizaci贸n del neuropilo y pericarion neuronal. El diagn贸stico se realiza mediante examen histopatol贸gico y la detecci贸n de la PrPsc mediante inmunohistoqu铆mica o Western Blot, principalmente. En este trabajo se utilizaron los modelos naturales de Scrapie ovino y de ECJ humano para determinar el papel de la gl铆a, en concreto de las astrogl铆a y la microgl铆a, en las EET. En concreto, mediante la utilizaci贸n del modelo animal se ha pretendido determinar su implicaci贸n en la propagaci贸n de la enfermedad a trav茅s de la valoraci贸n de los cambios producidos en relaci贸n con estas poblaciones gliales en diferentes estadios cl铆nicos (pre-cl铆nico, cl铆nico y terminal) de la enfermedad. Para ello, en el estudio se incluyeron animales que se encontraban en diferentes estadios de Scrapie. Tambi茅n se llev贸 a cabo un estudio sobre muestras de tejido cerebelar humano, que hab铆an sido diagnosticados de ECJ. En concreto, EJC espor谩dico o familiar. Para determinar la participaci贸n de la neurogl铆a y describir las lesiones neuropatol贸gicas en el tejido cerebelar humano y ovino, se aplicaron t茅cnicas histol贸gicas de tinci贸n con hematoxilina eosina y de inmunotinci贸n con diferentes anticuerpos espec铆ficos para la valoraci贸n mediante microscop铆a 贸ptica y confocal. Los resultados m谩s relevantes en relaci贸n con el modelo de Scrapie consisten en que el inmunomarcaje frente a la GFAP en las muestras analizadas demostr贸 un evidente aumento cuantitativo, principalmente en relaci贸n con las c茅lulas de Purkinje, conforme la enfermedad avanzaba. Otra observaci贸n destacable es la correspondencia del inmunomarcaje frente a la prote铆na GFAP con la gl铆a de Bergmann, tanto en el estadio pre-cl铆nico como en el terminal. Las principales observaciones histopatol贸gicas realizadas demostraron vacuolizaci贸n perineuronal e intraneuronal alrededor de las c茅lulas de Purkinje, intensific谩ndose en la fase terminal, que a menudo se asociaba a la muerte de este tipo celular. En este 煤ltimo estadio, tambi茅n se encontr贸 un engrosamiento de las neuritas de las c茅lulas de Purkinje que hab铆a sido descrita en la especie humana, pero no en la animal. La implicaci贸n de la microgl铆a en el progreso de la enfermedad no pudo confirmarse al observarse una escasa presencia de microgl铆a reactiva independientemente del estadio cl铆nico en el que se encontrara el animal. Sin embargo, s铆 que fue posible establecer una clara relaci贸n entre el comportamiento de esta microgl铆a y el genotipo que presentaba el animal. En el modelo humano, los estudios realizados sobre hiperplasia y/o hipertrofia astroc铆tica permitieron clasificar las muestras en dos patrones distintos: uno caracterizado por una intensa inmunoreacci贸n en todas las capas y otro por una reactividad principalmente localizada en la sustancia blanca. En ambos patrones se observ贸 una inmunotinci贸n coincidente con la gl铆a de Bergmann. Los estudios realizados utilizando la inmunohistoqu铆mica para detectar la microgl铆a reactiva sobre las muestras humanas permitieron su clasificaci贸n en tres grupos: en el primer grupo, la reactividad se observ贸 en todas las capas del cerebelo; en el segundo, la reactividad se localizaba casi exclusivamente en las capas molecular y granular; y en el tercero, 茅sta se detectaba preferentemente en la sustancia blanca. Respecto a las observaciones histopatol贸gicas en las muestras de pacientes diagnosticados de ECJ evidenciaron adem谩s de vacuolizaci贸n, una enorme p茅rdida neuronal, engrosamiento de las neuritas de las c茅lulas de Purkinje, presencia de rosetas floridas en la sustancia blanca y capa granular de una muestra, as铆 como de agregados proteicos
Valoraci贸n de la respuesta inflamatoria en el scrapie como prototipo de enfermedad pri贸nica
Las enfermedades pri贸nicas son un conjunto de enfermedades neurodegenerativas con largos periodos de incubaci贸n y para las cuales actualmente no existe tratamiento.Tradicionalmente, se ha considerado que no exist铆a una respuesta inmunol贸gica por parte del individuo afectado frente al agente causal de estas enfermedades debido a que no existe infiltraci贸n linfocitaria. Sin embargo, en los 煤ltimos a帽os se ha demostrado que en todas las enfermedades neurodegenerativas existe un proceso de neuroinflamaci贸n que puede conducir a la neurodegeneraci贸n. La hip贸tesis neuroinflamatoria est谩 basada en el hecho de que un est铆mulo patol贸gico (el dep贸sito de prote铆na prion) va a provocar la activaci贸n de la neurogl铆a,fundamentalmente astrogl铆a y microgl铆a, que a su vez van a liberar una serie de mediadores inflamatorios en el enc茅falo pudiendo contribuir al progreso neurodegenerativo. Aunque la principal funci贸n de las c茅lulas gliales ha sido tradicionalmente considerada la neuroprotecci贸n, a煤n no est谩 claro cu谩l es su papel real, ya que tambi茅n existen evidencias de que podr铆an ejercer un efecto potenciador de la neurodegeneraci贸n, convirti茅ndose enneurot贸xicas. Por lo tanto, dicha hip贸tesis pone de manifiesto que las c茅lulas gliales pueden representar el objetivo de estudios dirigidos a establecer una diana terap茅utica potencial que pudiera ralentizar la neurodegeneraci贸n.Con este escenario, en esta tesis doctoral se han llevado a cabo cuatro estudios para abordar diferentes aspectos de la respuesta inmunol贸gica que se produce en distintos estadios de la enfermedad de scrapie, prototipo de estudio de las enfermedades pri贸nicas. El objetivo es realizar una aproximaci贸n global al proceso neuroinflamatorio que se produce en el progreso neurodegenerativo de esta enfermedad, adem谩s de analizar el efecto de una terapia antiinflamatoria sobre par谩metros cl铆nicos y neuropatol贸gicos, definiendo para ello lasvariaciones morfol贸gicas y de intensidad de las c茅lulas astro y microgliales, as铆 como de varias citoquinas como marcadores neuroinflamatorios que 茅stas liberan, para finalmente poder comprender mejor su comportamiento durante el proceso neurodegenerativo.Se ha desarrollado un modelo de terapia cr贸nica con el glucocorticoide sint茅tico dexametasona con el fin de evaluar el efecto del f谩rmaco sobre la respuesta neuroglial, confirm谩ndose la delicada interacci贸n existente entre las poblaciones astroglial y microglial. Se ha demostrado que el tratamiento ha sido efectivo en la reducci贸n de la vacuolizaci贸n y el dep贸sito de prote铆na pri贸n patol贸gica en la fase temprana (en la que a煤n existe una respuestaneuroglial intacta), mientras que parece existir una par谩lisis y/o astenia astroglial en el estadio m谩s avanzado de scrapie (cuando presentan sintomatolog铆a cl铆nica), confirm谩ndose que las terapias antiinflamatorias pueden presentar potencial terap茅utico solamente en estados incipientes. Sin embargo, resulta esperanzadora la extensi贸n del periodo de supervivencia observada en una de las ovejas cl铆nicas tratadas, al abrir la posibilidad de que estos f谩rmacos puedan tener eficacia al menos en algunos casos cl铆nicos.Dentro de los objetivos planteados, tambi茅n se pretend铆a evaluar la expresi贸n de varias citoquinas y/o receptores en diferentes 谩reas encef谩licas durante el progreso del scrapie. Las observaciones realizadas confirman la existencia de una respuesta inmunol贸gica a nivel local a trav茅s de una compleja red de citoquinas, sugiriendo que la neurogl铆a intenta restablecer la homeostasis del enc茅falo en las fases iniciales de la enfermedad, pero surge un fallo funcional en estas poblaciones celulares conforme avanza la neurodegeneraci贸n, probablemente de lacomunicaci贸n entre astrogl铆a y microgl铆a, mediado por distintas citoquinas, de forma especial la IL-1.En definitiva, el conjunto de los resultados obtenidos en los cuatro estudios incluidos en esta tesis doctoral contribuyen a la elaboraci贸n del patr贸n neuroinflamatorio global que sucede en el progreso del scrapie ovino natural. Adem谩s, el modelo de este grupo de enfermedades podr铆a ser extrapolable al proceso neurodegenerativo que sucede en el resto de enfermedades pri贸nicas y prion-like, en las que tambi茅n existe un dep贸sito de prote铆na aberrante como est铆mulo patol贸gico.<br /
Estudio de rutas de vacunaci贸n en modelo murino para el uso profil谩ctico o terap茅utico de vacunas atenuadas de tuberculosis
La tuberculosis es una de las enfermedades infecciosas que produce mayor mortalidad en el mundo. El agente causante es Mycobacterium tuberculosis que convive estrechamente con el hombre desde sus inicios como Homo sapiens. De momento, la 煤nica vacuna disponible es BCG (derivada de Mycobacterium bovis) pero esta no es efectiva contra la tuberculosis pulmonar en adultos, que es adem谩s la forma responsable de la transmisi贸n de la enfermedad. Actualmente muchos equipos de investigaci贸n est谩n trabajando en el desarrollo de nuevas vacunas y tratamientos eficaces, siendo MTBVAC la 煤nica vacuna candidata basada en la atenuaci贸n del agente pat贸geno causante de la tuberculosis humana. La eficacia de esta vacuna est谩 siendo actualmente estudiada en ensayos cl铆nicos en Fase III de eficacia. Previo a la fase cl铆nica todos los estudios conllevan una fase de estudios precl铆nicos in vitro y despu茅s en animales de experimentaci贸n. El modelo murino es el modelo de elecci贸n en animales de experimentaci贸n, principalmente por su facilidad de manejo, econom铆a de estabulado y disponibilidad de reactivos espec铆ficos de rat贸n para estudios inmunol贸gicos. En esta tesis relacionamos distintos modelos de experimentaci贸n en ratones para lo cual hemos seleccionado 4 estudios de investigaci贸n basados en las vacunas vivas atenuadas MTBVAC y BCG. <br /