A rapid in vivo screen for pancreatic ductal adenocarcinoma therapeutics

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is the fourth leading cause of cancer-related deaths in the United States, and is projected to be second by 2025. It has the worst survival rate among all major cancers. Two pressing needs for extending life expectancy of affected individuals are the development of new approaches to identify improved therapeutics, addressed herein, and the identification of early markers. PDA advances through a complex series of intercellular and physiological interactions that drive cancer progression in response to organ stress, organ failure, malnutrition, and infiltrating immune and stromal cells. Candidate drugs identified in organ culture or cell-based screens must be validated in preclinical models such as KIC (p48Cre;LSL-KrasG12D;Cdkn2af/f) mice, a genetically engineered model of PDA in which large aggressive tumors develop by 4 weeks of age. We report a rapid, systematic and robust in vivo screen for effective drug combinations to treat Kras-dependent PDA. Kras mutations occur early in tumor progression in over 90% of human PDA cases. Protein kinase and G-protein coupled receptor (GPCR) signaling activates Kras. Regulators of G-protein signaling (RGS) proteins are coincidence detectors that can be induced by multiple inputs to feedback-regulate GPCR signaling. We crossed Rgs16::GFP bacterial artificial chromosome (BAC) transgenic mice withKIC mice and show that the Rgs16::GFP transgene is a KrasG12D-dependent marker of all stages of PDA, and increases proportionally to tumor burden in KIC mice. RNA sequencing (RNA-Seq) analysis of cultured primary PDA cells reveals characteristics of embryonic progenitors of pancreatic ducts and endocrine cells, and extraordinarily high expression of the receptor tyrosine kinase Axl, an emerging cancer drug target. In proof-of-principle drug screens, we find that weanling KIC mice with PDA treated for 2 weeks with gemcitabine (with or without Abraxane) plus inhibitors of Axl signaling (warfarin and BGB324) have fewer tumor initiation sites and reduced tumor size compared with the standard-of-care treatment. Rgs16::GFP is therefore an in vivo reporter of PDA progression and sensitivity to new chemotherapeutic drug regimens such as Axl-targeted agents. This screening strategy can potentially be applied to identify improved therapeutics for other cancers

Исследование противогриппозной активности комплексов миРНК против клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 на модели in vitro

Objectives. Evaluation of changes in the viral activity of influenza A/WSN/33 after complex knockdown of combinations of cellular genes FLT4, Nup98 and Nup205 in human lung cell culture A549. Methods. The work was carried out using the equipment of the Center for Collective Use of the I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russia. The authors performed transfection of combinations of small interfering ribonucleic acid (siRNA) complexes that cause simultaneous disruption of the expression of cellular genes FLT4, Nup98, and Nup205. Within three days from the moment of transfection and infection, the supernatant fluid and cell lysate were taken for subsequent viral reproduction intensity determination using the titration method for cytopathic action. The dynamics of changes in the concentration of viral ribonucleic acid (vRNA) was determined by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR). The nonparametric Mann–Whitney test was used to calculate statistically significant differences between groups.Results. Using all of the combinations of siRNA complexes, cell viability did not decrease below the threshold level of 70%. In cells treated with complex FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 at the multiplicity of infection (MOI) equal to 0.1, a significant decrease in viral reproduction by 1.5 lg was noted on the first day in relation to nonspecific and viral controls. The use of siRNA complexes at MOI 0.01 resulted in a more pronounced antiviral effect. The viral titer in cells treated with siRNA complexes FLT4.2 + Nup98.1 and Nup98.1 + Nup205 decreased by 1.5 lg on the first day. In cells treated with complexes FLT4.2 + Nup205 and FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205, it decreased by 1.8 and 2.0 lg on the first day and by 1.8 and 2.5 lg on the second day, respectively, in relation to nonspecific and viral controls. When conducting real-time RT-PCR, a significant decrease in the concentration of vRNA was noted. At MOI 0.1, a 295, 55, and 63-fold decrease in the viral load was observed with the use of siRNA complexes FLT4.2 + Nup98.1, Nup98.1 + Nup205, and FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205, respectively. On the second day, a decrease in vRNA was also observed in cells treated with complex A. A 415-fold decrease in vRNA on the third day was noted in cells treated with complex FLT4.2 + Nup205. At MOI 0.01, the concentration of vRNA decreased 9.5 times when using complex B relative to nonspecific and viral control.Conclusions. The study showed a pronounced antiviral effect of siRNA combinations while simultaneously suppressing the activity of cellular genes (FLT4, Nup98, and Nup205), whose expression products are playing important role in the viral reproduction process, and obtained original designs of siRNA complexes. The results obtained are of great importance for the creation of emergence prophylactic and therapeutic drugs, whose action is based on the mechanism of RNA interference.Цели. Оценка изменения вирусной активности гриппа A/WSN/33 после комплексного нокдауна комбинаций клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 в культуре легочных кле­ток человека А549.Методы. Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного поль­зования Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им И.И. Мечникова (Россия). Авторами выполнялась трансфекция комбинаций комплексов миРНК, вызыва­ющих одновременное нарушение экспрессии клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205. В течение трех дней с момента трансфекции и заражения проводился отбор надосадоч­ной жидкости и клеточного лизата для последующего определения интенсивности ви­русной репродукции по методу титрования по цитопатическому действию. Динамику изменения концентрации вирусной рибонуклеиновой кислоты (вРНК) определяли мето­дом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального вре­мени (ОТ-ПЦР-РВ). Для вычисления статистически значимых различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.Результаты. При использовании всех комбинаций комплексов малых интерферирую­щих РНК (миРНК) жизнеспособность клеток не снижалась ниже порогового уровня в 70%. В клетках, обработанных комплексом FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 при множественности заражения (Multiplicity of infection, MOI) 0.1 достоверное снижение вирусной репродукции на 1.5 lg отмечалось на первые сутки по отношению к неспецифическому и вирусному контролям. Использование комплексов миРНК при MOI 0.01 приводило к более выражен­ному противовирусному эффекту. Вирусный титр в клетках, обработанных комплек­сами миРНК FLT4.2 + Nup98.1 и Nup98.1 + Nup205 снижался на первые сутки на 1.5 lg. В клетках, обработанных комплексами FLT4.2 + Nup205 и FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 снижался на 1.8 и 2 lg на первые сутки и на 1.8 и 2.5 lg на вторые сутки соответствен­но по отношению к неспецифическому и вирусному контролям. При проведении ОТ-ПЦР-РВ отмечено достоверное снижение концентрации вирусной РНК. При MOI 0.1 снижение ви­русной в 295, 55 и 63 раза отмечался при использовании комплексов миРНК FLT4.2 + Nup98.1, Nup98.1 + Nup205 и FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 соответственно. На вторые сутки сниже­ние вирусной РНК также отмечалось в клетках, обработанных комплексом FLT4.2 + Nup98.1. Снижение вРНК на третьи сутки в 415 раз отмечалось в клетках, обработанных ком­плексом FLT4.2 + Nup205. При MOI 0.01 концентрация вРНК снизилась в 9.5 раз при ис­пользовании комплекса Nup98.1 + Nup205 относительно неспецифического и вирусного контроля.Выводы. В ходе исследования был показан выраженный противовирусный эффект ком­бинаций миРНК при одновременном подавлении активности клеточных генов (FLT4, Nup98 и Nup205), чьи продукты экспрессии играют важное участие в процессе вирусной репродукции, а также получены оригинальные конструкции комплексов миРНК. Полу­ченные результаты имеют важное значение для создания препаратов для экстренной профилактики и терапии, чье действие основано на механизме РНК-интерференции

Нокдаун клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 как супрессор вирусной активности гриппа А/WSN/33 (H1N1) в культуре клеток А549

Objectives. To evaluate the effect of cellular genes FLT4, Nup98, and Nup205 on the reproduction of the influenza A virus in A549 human lung cancer cell line.Methods. The work was carried out using the equipment of the center for collective use of the I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera (Russia). The virus-containing fluid was collected within three days from the moment of transfection and infection and the intensity of viral reproduction was assessed by viral titration and hemagglutination reaction. The viral RNA concentration was determined by real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). To calculate statistically significant differences between groups, the nonparametric Mann–Whitney test was used.Results. In cells treated with small interfering RNAs (siRNAs) targeted at FLT4, Nup98, and Nup205 genes, a significant decrease in their expression and indicators of viral reproduction (virus titer, hemagglutinating activity, viral RNA concentration) was observed at a multiplicity of infection (MOI) = 0.1. Additionally, it was found that a decrease in the expression of target genes using siRNA does not lead to a significant decrease in cell survival. The viral titer in cells treated with siRNA FLT4.2, Nup98.1, and Nup205 on the first day was lower by an average of 1.0 lg, and on the second and third days, by 2.2–2.3 lg, compared to cells treated with nonspecific siRNA. During real-time RT-PCR, a significant decrease in the concentration of viral RNA was observed with siRNA Nup98.1 (up to 190 times) and Nup205 (up to 30 times) on the first day, 26 and 29 times on the second day, and 6 and 30 times on the third day, respectively. For FLT4.2 siRNA, the number of viral RNA copies decreased by 23, 18, and 16 times on the first, second, and third days. Similar results were obtained when determining the hemagglutinating activity of the virus. The hemagglutinating activity on the third day most strongly decreased in cells treated with siRNA Nup205 and FLT4.2 (16 times). In cells treated with siRNA FLT4.1, Nup98.1, and Nup98.2, hemagglutinating activity decreased by 8 times.Conclusions. In the present study, three cellular genes (FLT4, Nup98, and Nup205) were identified—the decrease in the expression of which effectively suppresses viral reproduction— and the original siRNA sequences were obtained. The results obtained are important for creating therapeutic and prophylactic medication, whose action is based on the RNA interference mechanism.Цели. Оценка влияния подавления экспрессии клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 на динамику репродукции вируса гриппа А в культуре легочных клеток человека А549.Методы. Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного пользования Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им И.И. Мечникова (Россия). Вируссодержащую жидкость отбирали в течение трех дней с момента трансфекции и заражения и оценивали интенсивность вирусной репродукции методами титрования по цитопатическому действию и в реакции гемагглютинации. Концентрацию вирусной РНК определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Для вычисления статистически значимых различий между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.Результаты. В клетках, обработанных малыми интерферирующими РНК (миРНК) к генам FLT4, Nup98 и Nup205, отмечалось достоверное подавление экспрессии целевых генов и показателей вирусной репродукции (титр вируса, гемагглютинирующая активность, концентрация вирусной РНК) при коэффициенте множественности заражения, равном 0.1. Дополнительно было установлено, что подавление экспрессии целевых генов с помощью миРНК не приводит к значительному снижению выживаемости клеток. Вирусный титр в клетках, обработанных миРНК FLT4.2, Nup98.1 и Nup205, на первые сутки был меньше в среднем на 1.0 lg, а на вторые и третьи – на 2.2–2.3 lg, по сравнению с клетками, обработанными неспецифической миРНК. При проведении ОТ-ПЦР-РВ отмечено достоверное уменьшение концентрации вирусной РНК с миРНК Nup98.1 (до 190 раз) и Nup205 (до 30 раз) на первые сутки, в 26 и в 29 раз на вторые и в 6 и 30 раз на третьи сутки, соответственно. Для миРНК FLT4.2 количество копий вирусной РНК уменьшилось в 23, 18 и 16 раз на первые, вторые и третьи сутки. Схожие результаты были получены при определении гемагглютинирующей активности вируса. Наиболее сильно, в 16 раз, гемагглютинирующая активность на третьи сутки снизилась в клетках, обработанных миРНК Nup205 и FLT4.2. В клетках, обработанных миРНК FLT4.1, Nup98.1 и Nup98.2, гемагглютинирующая активность уменьшилась в 8 раз.Выводы. В ходе исследования были выявлены три клеточных гена (FLT4, Nup98 и Nup205), подавление экспрессии которых позволяет эффективно уменьшить вирусную репродукцию, а также получены оригинальные последовательности миРНК. Полученные результаты имеют важное значение для создания терапевтических и профилактических препаратов, чье действие основано на механизме РНК-интерференции

ПОКАЗАНИЯ И ВЫБОР ТЕХНОЛОГИИ ПРОТЕЗИРОВАНИЯ БРЮШНОЙ СТЕНКИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫХ ВЕНТРАЛЬНЫХ ГРЫЖ

The absolute indication for primary covering a laparotomic wound with a synthetic prosthesis is complicated anatomic and functional insufficiency. There are relative indications for this surgery, such as old age, III–IV degree of obesity, repeated laparotomy in location of the same scar, covering a laparostoma in patients treated with programmed sanation of the abdominal cavity and laparotomy in patients treated with radiology or chemotherapy methods. Lowering of functional activity of ribosomal genes is a reason of the anterior abdominal cavity weakness, its progress causes lowering in skin and aponeuroses composition I–III types of collagen. We examined the speed of growing and differentiation of connective tissue after implantation endoprosthesis made of lavsan, polypropylene, polyvinylidene fluoride, polytetrafluoride ethylene. It was proved that the polyvinylidene fluoride mesh had the best biocompatibility. The progress of wound implantation process could be predicted by dynamics of cytokine profile, temperature, leukocyte and exudative reactions of a patient. The best insensitiveness to infection belonged to a standard polypropylene endoprosthesis, it could be used for covering a hernia defect in patients with strangulated hernias. The fact that urine poured into the operation wound during urinary system surgery combined with lateral hernias of abdomen was not a contraindication for endoprosthesis.Абсолютным показанием для первичного закрытия лапаротомной раны синтетическим протезом является анатомо-функциональная недостаточность брюшной стенки тяжелой степени. Относительными показаниями выступают пожилой и старческий возраст больных, ожирение III–IV степени, повторные лапаротомии по старому операционному рубцу, закрытие лапаростомы у больных, лечившихся программированными санациями брюшной полости, лапаротомии на фоне лучевой и (или) химиотерапии у онкологических больных. В основе развития слабости брюшной стенки лежит снижение функциональной активности рибосомных генов, которое вызывает снижение соотношения коллагенов I–III типов в коже и апоневрозе. При изучении скорости созревания соединительной ткани и ее дифференцировки после имплантации лавсанового, полипропиленового, поливинилиденфторидного и политетрафторэтиленового эндопротезов установлено, что наибольшей биосовместимостью обладают поливинилиденфторидные сетки. Прогнозировать течение раневого имплантационного процесса необходимо по динамике цитокинового профиля, температурной, лейкоцитарной и экссудативной реакций пациента. Наибольшей устойчивостью к действию инфекционных факторов обладает стандартный полипропиленовый эндопротез, который следует применять для закрытия грыжевого дефекта у больных с ущемленными вентральными грыжами. При урологических операциях в сочетании с протезированием передней брюшной стенки попадание мочи в операционную рану не является противопоказанием для эндопротезирования

Mild neurological dysfunction as a marker of cognitive and behavioral disorders in children

В статье рассматриваются признаки легкой неврологической дисфункции и их связи с основными показателями психомоторного развития у детей низкого риска развития заболеваний в возрасте от 2 до 4 лет.The aim of this study is to detect minor neurological dysfunction (MND) signs and their association with the main parameters of neurodeve-lopment in low-risk children at the ages of 2.5-4 years

Virus-inhibitory activity of the antigen complex of opportunistic pathogenic bacteria against SARS-CoV-2

Introduction. The antigen complex of opportunistic pathogenic bacteria (ACOPB) has a protective effect against avian influenza viruses, herpes virus type 2, and other viruses that cause acute respiratory viral infections. In the context of the COVID-19 pandemic, an important task is to find out whether ACOPB has a protective effect against SARS-CoV-2. The purpose of the study was to evaluate in vitro the ACOPB virus-inhibitory activity against the Dubrovka laboratory strain of SARS-CoV-2. Materials and methods. The study was performed using Vero cell line CCL-81, human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), mouse monoclonal anti-idiotypic antibodies structurally mimicking biological effects of human interferons (IFNs), the Dubrovka laboratory strain of SARS-CoV-2. The infectivity of the virus was assessed by two methods: by virus titration using cell cultures and the limiting dilution method when the results are assessed by a cytopathic effect; the second method was a plaque assay. The in vitro virus inhibition test was performed using the cell culture susceptible to SARS-CoV-2; the mixture containing a specific dose of the virus and a two-fold dilution of ACOPB was transferred to the cell culture after the ACOPB medication had interacted with the virus at 4C for 2 hours. The ACOPB virus-inhibitory activity against SARS-CoV-2 was assessed by the functional activity of / and IFN receptors (RIFN) in human PBMCs induced in vitro by ACOPB and the ACOPB mixture with the specific dose of SARS-CoV-2. The RIFN expression level was measured by the indirect membrane immunofluorescence test. Results. Hemagglutination assay using chicken, mouse, guinea pig, and human red blood cells was performed for detection of the SARS-CoV-2 inhibitory protein. The lysate of Vero CCL-81 cells infected with SARS-CoV-2 Dubrovka demonstrated the highest hemagglutination activity with guinea pig red blood cells and low titers of hemagglutination in the virus-containing fluid. The virus inhibition test in the Vero CCL-81 cell culture demonstrated that ACOPB inhibited 10 doses of SARS-CoV-2 Dubrovka with the titer 1 : 32, providing 100% protection of the cell culture for 8 days (the monitoring period). ACOPB induced / and RIFN expression on membranes of human PBMCs in in vitro cultures and decreased RIFN / and expression after its interaction with SARS-CoV-2 Dubrovka. Conclusion. The experimental studies including the virus inhibition test in the cell culture susceptible to SARS-CoV-2 Dubrovka and the indirect membrane immunofluorescence assay using monoclonal anti-idiotypic antibodies mimicking IFN-like properties demonstrated that ACOPB had both an immunomodulatory and a virus-inhibitory effect

Получение полых полуфабрикатов изделий из медных сплавов электротехнического назначения способом винтовой прокатки

The article proposes a process for obtaining semi-finished products in the form of pipes made of copper alloys for electrical applications using the screw rolling method. The paper presents the results of experimental piercing and rolling of pipe samples made of Cu–0.75Cr copper alloy billets with a diameter of 45 mm. The 43.5×10.0 mm samples obtained after piercing using a two-roll screw rolling mill had exact geometrical dimensions: outer diameter deviation at the front end was up to 1 %, at the back end – up to 2.4 %; relative variation in wall thickness at the front end was 0.3÷0.5 %, at the rear end – 0.5÷1.0 %. Then pierced pipe samples were rolled using a three-roll radial-shear rolling (RSR) mini mill with a different total degree of reduction – samples were obtained with an outer diameter of 30, 25 and 18 mm. The reduction process was analyzed from the point of view of internal hole stability and deformation. In case of 30 % relative reduction of the outer diameter, rolling without a mandrel is accompanied by wall thickening. In this case, inner diameter deviations are within acceptable limits. The experiments on obtaining samples from the Cu–0.75Cr alloy by screw piercing and reduction in the RSR mill show that this scheme can be implemented in principle in industry. At the same time it is necessary to define more exactly deformation parameters (degree of deformation, choice of reduction scheme) to obtain a quality product. Various options for heat treatment (HT) of the obtained pipe samples and the effect of the HT method on electrical conductivity and hardness are considered. Samples after piercing had a conductivity of 59.3 % IACS. The maximum electrical conductivity of 76.7 % IACS was obtained on samples after quenching from a temperature of 1020 °C and aging at 450 °C for 3 h. The results of the work show the fundamental possibility of obtaining semi-finished products from copper alloys for electrical purposes using the screw rolling method.Предложен способ получения полуфабрикатов в виде труб из медных сплавов электротехнического назначения методом винтовой прокатки. Представлены результаты экспериментальной прошивки и прокатки образцов труб из заготовок медного сплава Cu–0,75Cr диаметром 45 мм. Полученные образцы размером 43,5×10,0 мм после прошивки в двухвалковом стане винтовой прокатки имели точные геометрические размеры: отклонение по наружному диаметру на переднем конце – до 1 %, на заднем конце – до 2,4 %, относительная поперечная разностенность на переднем конце составила 0,3÷0,5 %, на заднем конце – 0,5÷1,0 %. Далее прошитые образцы труб были прокатаны на трехвалковом министане радиально-сдвиговой прокатки (РСП) с разной суммарной степенью обжатия – получены образцы с наружным диаметром 30, 25 и 18 мм. Процесс редуцирования проанализирован с точки зрения стабильности и формоизменения внутреннего отверстия. При относительном обжатии наружного диаметра на 30 % прокатка без оправки сопровождается увеличением толщины стенки. При этом отклонения внутреннего диаметра находятся в допустимых пределах. Проведенные эксперименты по получению образцов из сплава Cu–0,75Cr способом винтовой прошивки и редуцирования в стане РСП показывают, что данная схема может быть принципиально реализована в промышленности. В то же время для получения качественного продукта необходимо уточнение параметров деформации (степени деформации, выбора схемы редуцирования). Рассмотрены различные варианты термообработки (ТО) полученных образцов труб и влияние способа ТО на электропроводность и твердость. Образцы после прошивки имели электропроводность 59,3 % IACS. Максимальная электропроводность 76,7 % IACS получена на образцах после закалки с температуры 1020 °С и старения при 450 °С в течение 3 ч. Результаты работы показывают принципиальную возможность получения полуфабрикатов изделий из медных сплавов электротехнического назначения способом винтовой прокатки

Limited Cheese Intake Paradigm Replaces Patterns of Behavioral Disorders in Experimental PTSD: Focus on Resveratrol Supplementation

Currently, the efficacy of drug therapy for post-traumatic stress disorder or PTSD leaves much to be desired, making nutraceutical support a promising avenue for treatment. Recent research has identified the protective effects of resveratrol in PTSD. Here, we tested the behavioral and neurobiological effects of combining cheese consumption with resveratrol supplements in an experimental PTSD model. Using the elevated plus maze test, we observed that cheese intake resulted in a shift from anxiety-like behavior to depressive behavior, evident in increased freezing acts. However, no significant changes in the anxiety index value were observed. Interestingly, supplementation with cheese and resveratrol only led to the elimination of freezing behavior in half of the PTSD rats. We further segregated the rats into two groups based on freezing behavior: Freezing+ and Freezing0 phenotypes. Resveratrol ameliorated the abnormalities in Monoamine Oxidize -A and Brain-Derived Neurotrophic Factor gene expression in the hippocampus, but only in the Freezing0 rats. Moreover, a negative correlation was found between the number of freezing acts and the levels of Monoamine Oxidize-A and Brain-Derived Neurotrophic Factor mRNAs in the hippocampus. The study results show promise for resveratrol supplementation in PTSD treatment. Further research is warranted to better understand the underlying mechanisms and optimize the potential benefits of resveratrol supplementation for PTSD. © 2023 by the authors.23-15-20040; Russian Science Foundation, RSFThis work was supported by the Russian Scientific Foundation, Regional grant, Chelyabinsk Region (#23-15-20040)