Recherche et validation de biomarqueurs de troubles neurologiques dans les fluides biologiques

The diagnosis of inborn errors of dopamine and serotonin metabolism relies on the quantification of biomarkers in cerebrospinal fluid. Because of the high complexity of performing this assay, only a few laboratories in the world can realize it. The present thesis aims at proposing convenient methods for the quantification of these molecules and at understanding their stability in cerebrospinal fluid. First, we studied the stability of a key biomarker in the diagnosis of these illnesses, specifically tetrahydrobiopterin. Indeed, the latter is inclined to spontaneous autoxidation, which may cause bias in the measured cerebrospinal concentrations. Second, we described and validated two novel methods for the quantification of dopamine and serotonin metabolites in cerebrospinal fluid. Both are based on high-performance liquid chromatography coupled whether to fluorescence detection or to tandem mass spectrometry. Finally, we observed an enhancement of electrospray ionisation signal when using small concentrations of phosphate. The nature and pH of the buffer used in the mobile phase highly influences the signal increase. After proposing and testing several hypotheses, it has been shown that this phenomenon relies on reducing alkalin ion adducts.Le diagnostic des erreurs innées du métabolisme de la dopamine et de la sérotonine repose sur la quantification de biomarqueurs dans le liquide céphalorachidien, qui, du fait de sa complexité, n'est réalisable que dans quelques laboratoires dans le monde. La présente thèse a pour but de proposer des méthodes plus accessibles pour le dosage de ces molécules et de mieux comprendre leur stabilité dans le liquide céphalorachidien. Dans un premier temps, nous avons étudié la stabilité d'un biomarqueur clé dans le diagnostic de ces pathologies, à savoir la tétrahydrobioptérine. En effet, cette dernière est encline à une auto-oxydation spontanée ce qui peut engendrer un biais lors de son dosage dans le liquide céphalorachidien. Dans un second temps, nous avons décrit et validé deux méthodes de chromatographie liquide à haute performance pour le dosage des métabolites de la dopamine et de la sérotonine : la première avec une détection par fluorescence et la seconde avec une détection par spectrométrie de masse en tandem. Enfin, nous avons observé le phénomène d'amélioration du signal d'ionisation par electrospray avec de faibles concentrations de phosphate. La nature et le pH du tampon utilisé dans la phase mobile détermine l'intensité de cette amélioration du signal. Après avoir proposé et vérifié plusieurs hypothèses permettant d'expliquer ce phénomène, nous avons mis en évidence le fait qu'il s'agit d'un dessalage avec une diminution des adduits alcalins

Search and validation for neurological diseases'biomarkers in biological fluids

Le diagnostic des erreurs innées du métabolisme de la dopamine et de la sérotonine repose sur la quantification de biomarqueurs dans le liquide céphalorachidien, qui, du fait de sa complexité, n'est réalisable que dans quelques laboratoires dans le monde. La présente thèse a pour but de proposer des méthodes plus accessibles pour le dosage de ces molécules et de mieux comprendre leur stabilité dans le liquide céphalorachidien. Dans un premier temps, nous avons étudié la stabilité d'un biomarqueur clé dans le diagnostic de ces pathologies, à savoir la tétrahydrobioptérine. En effet, cette dernière est encline à une auto-oxydation spontanée ce qui peut engendrer un biais lors de son dosage dans le liquide céphalorachidien. Dans un second temps, nous avons décrit et validé deux méthodes de chromatographie liquide à haute performance pour le dosage des métabolites de la dopamine et de la sérotonine : la première avec une détection par fluorescence et la seconde avec une détection par spectrométrie de masse en tandem. Enfin, nous avons observé le phénomène d'amélioration du signal d'ionisation par electrospray avec de faibles concentrations de phosphate. La nature et le pH du tampon utilisé dans la phase mobile détermine l'intensité de cette amélioration du signal. Après avoir proposé et vérifié plusieurs hypothèses permettant d'expliquer ce phénomène, nous avons mis en évidence le fait qu'il s'agit d'un dessalage avec une diminution des adduits alcalins.The diagnosis of inborn errors of dopamine and serotonin metabolism relies on the quantification of biomarkers in cerebrospinal fluid. Because of the high complexity of performing this assay, only a few laboratories in the world can realize it. The present thesis aims at proposing convenient methods for the quantification of these molecules and at understanding their stability in cerebrospinal fluid. First, we studied the stability of a key biomarker in the diagnosis of these illnesses, specifically tetrahydrobiopterin. Indeed, the latter is inclined to spontaneous autoxidation, which may cause bias in the measured cerebrospinal concentrations. Second, we described and validated two novel methods for the quantification of dopamine and serotonin metabolites in cerebrospinal fluid. Both are based on high-performance liquid chromatography coupled whether to fluorescence detection or to tandem mass spectrometry. Finally, we observed an enhancement of electrospray ionisation signal when using small concentrations of phosphate. The nature and pH of the buffer used in the mobile phase highly influences the signal increase. After proposing and testing several hypotheses, it has been shown that this phenomenon relies on reducing alkalin ion adducts

Autoxidation Kinetics of Tetrahydrobiopterin—Giving Quinonoid Dihydrobiopterin the Consideration It Deserves

In humans, tetrahydrobiopterin (H4Bip) is the cofactor of several essential hydroxylation reactions which dysfunction cause very serious diseases at any age. Hence, the determination of pterins in biological media is of outmost importance in the diagnosis and monitoring of H4Bip deficiency. More than half a century after the discovery of the physiological role of H4Bip and the recent advent of gene therapy for dopamine and serotonin disorders linked to H4Bip deficiency, the quantification of quinonoid dihydrobiopterin (qH2Bip), the transient intermediate of H4Bip, has not been considered yet. This is mainly due to its short half-life, which goes from 0.9 to 5 min according to previous studies. Based on our recent disclosure of the specific MS/MS transition of qH2Bip, here, we developed an efficient HPLC-MS/MS method to achieve the separation of qH2Bip from H4Bip and other oxidation products in less than 3.5 min. The application of this method to the investigation of H4Bip autoxidation kinetics clearly shows that qH2Bip’s half-life is much longer than previously reported, and mostly longer than that of H4Bip, irrespective of the considered experimental conditions. These findings definitely confirm that an accurate method of H4Bip analysis should include the quantification of qH2Bip

Multianalytical Approach for Deciphering the Specific MS/MS Transition and Overcoming the Challenge of the Separation of a Transient Intermediate, Quinonoid Dihydrobiopterin

Despite recent technological developments in analytical chemistry, separation and direct characterization of transient intermediates remain an analytical challenge. Among these, separation and direct characterization of quinonoid dihydrobiopterin (qH2Bip), a transient intermediate of tetrahydrobiopterin (H4Bip)-dependent hydroxylation reactions, essential in living organisms, with important and varied human pathophysiological impacts, are a clear illustration. H4Bip regeneration may be impaired by competitive nonenzymatic autoxidation reactions, such as isomerization of qH2Bip into a more stable 7,8-H2Bip (H2Bip) isomer, and subsequent nonenzymatic oxidation reactions. The quinonoid qH2Bip intermediate thus plays a key role in H4Bip-dependent hydroxylation reactions. However, only a few experimental results have indirectly confirmed this finding while revealing the difficulty of isolating qH2Bip from H4Bip-containing solutions. As a result, no current H4Bip assay method allows this isomer to be quantified even by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (MS/MS). Here, we report isolation, structural characterization, and abundance of qH2Bip formed upon H4Bip autoxidation using three methods integrated into MS/MS. First, we characterized the structure of the two observed H2B isomers using IR photodissociation spectroscopy in conjunction with quantum chemical calculations. Then, we used differential ion mobility spectrometry to fully separate all oxidized forms of H4Bip including qH2Bip. These data are consistent and show that qH2Bip can also be unambiguously identified thanks to its specific MS/MS transition. This finding paves the way for the quantification of qH2Bip with MS/MS methods. Most importantly, the half-life value of this intermediate is nearly equivalent to that of H4Bip (tens of minutes), suggesting that an accurate method of H4Bip analysis should include the quantification of qH2Bip

Dispositif Intégré pour l'Analyse par Décharges Électriques et la Miniaturisation de l’Émission photonique

International audienceAu travers de nombreuses collaborations qui perdurent avec le temps, l’ICP et le LPGP proposent dans ce projet émergent de combiner décharges plasma, microfluidique et analyse par spectrométrie de masse. Un dispositif microfluidique sera conçu avec une première partie constituée d’un diluteur de gaz rares. Dans un second module ces gaz seront vecteurisés pour être distribués dans une matrice de microcanaux contenant des solénoïdes. Ces derniers seront alimentés par du courant alternatif nécessaire à la création de microplasmas. Les émissions produites par ces plasmas seront étudiées comme sources de lumière et caractérisées optiquement avant d’envisager pour la suite de ce projet l’intégration de cavités générant de la lumière cohérente et monochromatique. Le deuxième volet de ce projet consistera à réaliser des études de réactivité dans ces microplasmas en y introduisant des molécules (formaldéhyde, ammoniac, eau) pouvant servir de précurseurs conduisant aux molécules plus complexes qui sont à l’origine des briques de la vie (acides aminés). L’analyse des étapes de cette réactivité sera réalisée en couplant la puce microfluidique à des spectromètres de masse FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) compacts. Cet ensemble permettra des analyses de COV (composés organiques volatils) en temps réel. Ce projet PALM constituera le socle nécessaire à la demande de financement d’un projet de type ANR ou ERC d’ici trois ans. En effet, on sait que les plasmas sont capables d’augmenter drastiquement les rendements des réactions et l’activité catalytique, ce sont là d’autres perspectives possibles du projet DIADEME