Inactivation of Cerebral Cavernous Malformation Genes Results in Accumulation of von Willebrand Factor and Redistribution of Weibel-Palade Bodies in Endothelial Cells

Cerebral cavernous malformations are slow-flow thrombi-containing vessels induced by two-step inactivation of the CCM1, CCM2 or CCM3 gene within endothelial cells. They predispose to intracerebral bleedings and focal neurological deficits. Our understanding of the cellular and molecular mechanisms that trigger endothelial dysfunction in cavernous malformations is still incomplete. To model both, hereditary and sporadic CCM disease, blood outgrowth endothelial cells (BOECs) with a heterozygous CCM1 germline mutation and immortalized wild-type human umbilical vein endothelial cells were subjected to CRISPR/Cas9-mediated CCM1 gene disruption. CCM1−/− BOECs demonstrated alterations in cell morphology, actin cytoskeleton dynamics, tube formation, and expression of the transcription factors KLF2 and KLF4. Furthermore, high VWF immunoreactivity was observed in CCM1−/− BOECs, in immortalized umbilical vein endothelial cells upon CRISPR/Cas9-induced inactivation of either CCM1, CCM2 or CCM3 as well as in CCM tissue samples of familial cases. Observer-independent high-content imaging revealed a striking reduction of perinuclear Weibel-Palade bodies in unstimulated CCM1−/− BOECs which was observed in CCM1+/− BOECs only after stimulation with PMA or histamine. Our results demonstrate that CRISPR/Cas9 genome editing is a powerful tool to model different aspects of CCM disease in vitro and that CCM1 inactivation induces high-level expression of VWF and redistribution of Weibel-Palade bodies within endothelial cells

A two-hit mechanism causes cerebral cavernous malformations: complete inactivation of CCM1, CCM2 or CCM3 in affected endothelial cells

Cavernous vascular malformations occur with a frequency of 1:200 and can cause recurrent headaches, seizures and hemorrhagic stroke if located in the brain. Familial cerebral cavernous malformations (CCMs) have been associated with germline mutations in CCM1/KRIT1, CCM2 or CCM3/PDCD10. For each of the three CCM genes, we here show complete localized loss of either CCM1, CCM2 or CCM3 protein expression depending on the inherited mutation. Cavernous but not adjacent normal or reactive endothelial cells of known germline mutation carriers displayed immunohistochemical negativity only for the corresponding CCM protein but not for the two others. In addition to proving loss of function at the protein level, our data are the first to demonstrate endothelial cell mosaicism within cavernous tissues and provide clear pathogenetic evidence that the endothelial cell is the cell of disease origin

Increased expression of EphA7 correlates with adverse outcome in primary and recurrent glioblastoma multiforme patients

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Malignant gliomas are lethal cancers, highly dependent on angiogenesis and treatment options and prognosis still remain poor for patients with recurrent glioblastoma multiforme (GBM). Ephs and ephrins have many well-defined functions during embryonic development of central nervous system such as axon mapping, neural crest cell migration, hindbrain segmentation and synapse formation as well as physiological and abnormal angiogenesis. Accumulating evidence indicates that Eph and ephrins are frequently overexpressed in different tumor types including GBM. However, their role in tumorigenesis remains controversial, as both tumor growth promoter and suppressor potential have been ascribed to Eph and ephrins while the function of EphA7 in GBM pathogenesis remains largely unknown.</p> <p>Methods</p> <p>In this study, we investigated the immunohistochemical expression of EphA7 in a series of 32 primary and recurrent GBM and correlated it with clinical pathological parameters and patient outcome. In addition, intratumor microvascular density (MVD) was quantified by immunostaining for endothelial cell marker von Willebrand factor (vWF).</p> <p>Results</p> <p>Overexpression of EphA7 protein was predictive of the adverse outcome in GBM patients, independent of MVD expression (p = 0.02). Moreover, high density of MVD as well as higher EphA7 expression predicted the disease outcome more accurately than EphA7 variable alone (p = 0.01). There was no correlation between MVD and overall survival or recurrence-free survival (p > 0.05). However, a statistically significant correlation between lower MVD and tumor recurrence was observed (p = 0.003).</p> <p>Conclusion</p> <p>The immunohistochemical assessment of tissue EphA7 provides important prognostic information in GBM and would justify its use as surrogate marker to screen patients for tyrosine kinase inhibitor therapy.</p

„Glioblastoma in a dish“ – Die Etablierung eines Mausmodells für das sekundäre Glioblastom

Bei dem Glioblastoma multiforme handelt es sich um den häufigsten primären Hirntumor. Es handelt sich um einen sehr malignen Tumor, der Menschen in mittlerem Alter betrifft und sich durch eine infauste Prognose auszeichnet. Trotz einer Kombination aus Operation, Radiatio und verschiedenen Ansätzen der Chemotherapie, versterben die meisten Pateinten bereits im ersten Jahr nach Diagnosestellung. Es wird zwischen primären und sekundären Glioblastomen unterschieden. Das primäre Glioblastom entwickelt sich völlig neu (de novo). Es gibt weder radiologische, noch histologische Hinweise auf einen vorausgegangenen weniger malignen Tumor. Häufige Mutationen sind EGFR-Amplifikation, Deletion des p16INK4a und LOH (loss of heterozygosity) von 10q. Im Gegensatz dazu, entwickelt sich das sekundäre Gliobastom durch Progression eines niedriggradigen oder anaplastischen Astrozytoms. Bereits in den niedrigmalignen Vorläuferläsionen kommt es häufig zu einem Verlust des Tumorsuppressors p53. Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 45 Jahren. Das Glioblastom ist bevorzugt in den Großhirnhemisphären, insbesondere frontotemporal, lokalisiert. Makroskopisch zeichnen sich diese Tumoren durch eine bunte Schnittfläche aus. Charakteristisch sind gelbliche Nekrosen, Blutungen, grau-weiß aussehendes Tumorgewebe und diffuses infiltrierendes Wachstum. Rein histologisch können beide Tumorentitäten nicht voneinander unterschieden werden. Um den Ursprung des Tumors und dessen Tumorbiologie sowie Infiltration und Migration besser verstehen zu können und um neue therapeutische Strategien zu entwickeln, werden gute Mausmodelle benötigt. In der Vergangenheit gab es einige gute Ansätze zur Entwicklung eines solchen Modells. Leider gelang es keinem Modell das infitrative Wachstum im Gehirn nachzuempfinden, welches für die Läsion so charakterisch ist. Desweiteren gibt es Unstimmigkeiten in der wissenschaftlichen Gemeinschaft bezüglich der Ursprungszellen des Glioblastoms. Es konnte bisher nicht herausgefunden werden, ob es sich bei diesen Zellen um differenzierte Astroyzten oder aber neurale Progenitoren handelt. Holland et al. entwickelten ein vielversprechendes Glioblastom-Modell durch Gentransfer und eine daraus resultierende Überexpression von K-Ras uns Akt in neuralen Progenitoren. Des Weiteren publizierten Lassman et al. ein Modell mit differenzierten Astroyzten, die durch eine Überexpression von c-Myc einen undifferenzierten Phänotyp zeigten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Glioblastom-Modells mit differenzierten Astrozyten jedoch ohne eine Überexpression von K-Ras, da dieses eine für das Glioblastoma multiforme eher untypische Mutation darstellt. Diese Arbeit konzentrierte sich somit auf die Verwendung von p53-knockout Astrozyten. Diese wurden aus neugebornenen p53-knockout Mäusen gewonnen und kultiviert. Die kultivierten Astrozyten wurden mit einem Überstand von kultivierten und vorher transfizierten Phoenix-Zellen infiziert. Bei den Phoenix-Zellen handelt es sich um eine Zelllinie, die nach einer Transfektion mit bestimmten Plasmiden fähig ist, einen Retrovirus zu produzieren, der widerum für die Infektion anderer muriner Zellen zur Verfügung steht. Somit konnten in dieser Arbeit 3 verschiedene Zelllinien generiert werden: p53-knockout Astrozyten, die Akt, Myc oder Akt und Myc überexprimierten. Durch die Überexpression von Akt konnten die Zellen immortalisiert werden. Myc-überexprimierende Astrozyten zeigten ein rapides Zellwachstum und einen undifferenzierten Phänotyp. Verschiedene Passagen der Kulturen wurden immunhistochemisch gegen Ki67, GFAP und neurale Marker für Progenitoren wie Olig2, Nestin, Musashi-1 und CD133 gefärbt. Es kam zu einem Verlust des GFAP und einer positiven Immunhistochemie für die neuralen Marker der Progenitoren in späten Passagen. Mit Hilfe eines RNA Protection Assay (RPA) konnte auf RNA-Ebene bewiesen werden, dass es sich bei den Kulturen um reine Astrozytenkulturen handelt, die auch im Verlauf späterer Passagen keine neuronalen Marker, wie Synaptophysin, Calbindin oder Neurofilament exprimierten. Im Verlauf der Arbeit injizierten wir stereotaktisch Myc und Akt überxprimierende p53 knockout-Astrozyten (p53MA) in das rechte Striatum von Bl6- und RAG2-/- Mäusen. Nach 21 Tagen wurden die Hirne der Tiere entnommen und Kryostatschnitte angefertigt. Durch eine HE-Färbung konnte das Tumorwachstum nachgewiesen werden. Zusätzlich wurden die Schnitte immunhistochemisch gegen CD4, CD8 und Mac-1 gefärbt. Es konnte keine Infiltration von Zellen des Immunsystems nachgewiesen werden

Entwicklung eines Mausmodells für die intrazerebrale Induktion einer zerebralen Immunreaktion

Bei der chronisch entzündlichen Autoimmunerkrankung des ZNS, der Multiplen Sklerose, zeigen sich fokal inflammatorische, demyelinisierende Läsionen der weißen Substanz, welche u.a. T-Zellen gegen das körpereigene MOG aufweisen. Klinisch äußert sich die Erkrankung durch verschiedene Symptome wie z.B. Gleichgewichtsstörungen, Lähmungen oder allgemein kognitive Defizite. Die Ätiologie der MS ist weitgehend ungeklärt. Die EAE ist ein Tiermodell für die MS, anhand welcher die Pathogenese der Erkrankung erforscht wird. So wird den Versuchstieren eine Emulsion bestehend aus MOG und CFA subkutan z.B. über den Flanken injiziert. Zur Verstärkung der Immunantwort kann zusätzlich Ptx verabreicht werden, welches die Permeabilität der BHS erhöht. Die MOG-haltige Emulsion führt zu einer Immunreaktion bei welcher u.a. naive CD4+T-Zellen aktiviert werden und zu Th1- bzw. Th17-Zellen differenzieren. IL-12 bewirkt dabei die Differenzierung der naiven T-Zellen zu Th1-Zellen, IL-23 zu Th-17 Zellen. Diese MOG-spezifischen T-Zellen können in das ZNS einwandern und dort Myelinscheiden der Neurone zerstören. Die Entzündung findet v.a. im Kleinhirn und Rückenmark statt und äußert sich bei den Tieren in Form von Gleichgewichtsstörungen und Lähmungen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Induktion einer EAE insoweit abgewandelt, dass die Immunreaktion nur auf die ZNS-Ebene begrenzt wurde. Hierzu wurde den Versuchstieren mit Hilfe einer stereotaktischen Vorrichtung eine MOG-haltige Emulsion direkt in das Kleinhirnmarklager appliziert. Das Volumen der Emulsion wurde auf 3 µl/ Tier und die MOG-Konzentration auf 37 mg/ml begrenzt. So wurde sichergestellt, dass trotz der geringen Emulsionsmenge genügend MOG-Antigen zur Induktion einer Immunreaktion vorhanden war. Um die Immunantwort auf das ZNS zu begrenzen, musste das periphere Immunsystem „ausgeschaltet“ werden. Dazu verwendeten wir bei dem Experiment die transgene CA-Mauslinie, bei welcher die Untereinheiten des IL-12, p40 und p35, spezifisch nur in den Astrozyten unter transkriptioneller Kontrolle des GFAP-Promotors exprimiert werden. Die p40 Untereinheit ist außerdem ein Teil von IL-23, weshalb bei der CA-Mauslinie die beiden Interleukine 12 und 23 lediglich im ZNS synthetisiert werden können. Dadurch können die naiven T-Zellen im peripheren Immunsystem nicht aktiviert werden. Insgesamt wurden 88 Mäuse der CA-Tierlinie stereotaktisch am Kleinhirn operiert. Zur Negativkontrolle wurden 14 Mäuse der C57Bl/6-Linie, 17 Mäuse der IL-12p40-/--Linie und 3 Mäuse der MyD88-/-- Linie operiert. Die klinische Symptomatik der Versuchstiere wurde nach einem EAE-Score beurteilt. Bei langer Beobachtungszeit von maximal 42 Tagen entwickelten nahezu alle Tiere der CA-Linie eine Ataxie sowie häufig ein Kreisen. Diese Symptomatik als Zeichen der stattgefundenen Immunreaktion zu werten ist jedoch schwierig, da die Tiere der CA-Linie auf Grund der transgenen IL-12 Expression ab etwa der 12. Lebenswoche eine spontane Inflammation entwickeln. Einige der Tiere wurden über 30 Tage beobachtet, so dass es wahrscheinlich war, dass sie im Verlauf eine spontane Ataxie entwickeln würden. Darüber hinaus kann der operative Eingriff am Kleinhirn zu einer Verstärkung bzw. zu einem früheren Auftreten der Symptomatik geführt haben. Dauerhafte Lähmungen waren hingegen nicht zu verzeichnen. In den histomorphologischen sowie immunhistochemischen Untersuchungen sahen wir deutliche Entzündungszeichen wie Gewebeauflockerung sowie eine sowohl diffuse als auch lokale, die Injektionsstelle umgebende, Infiltration durch CD4+-, CD8+-, CD45+-Lymphozyten und Makrophagen. In der FACS-Analyse ließen sich nur wenige spezifisch aktivierte T-Zellen nachweisen. Insgesamt konnte bei 0,2-3% der Th1- und Th17-Zellen eine IFN-γ bzw. IL-17 Produktion nachgewiesen werden. In der peripher induzierten EAE lassen sich in frischen Läsionen ebenfalls ähnlich wenige MOG-spezifisch aktivierte CD4+-T-Zellen nachweisen. Zusammenfassend ist die Induktion einer zerebralen Immunreaktion prinzipiell möglich, es zeigt sich jedoch eine deutlich schwächere Immunreaktion im Vergleich zu einer peripher induzierten EAE. Eine Möglichkeit zum Nachweis MOG-spezifisch aktivierter T-Zellen wäre ein adoptiver Transfer. Hierzu extrahiert man die immunisierten T-Lymphozyten (Th1- und/oder Th17-Zellen) nach der Induktion aus den Versuchstieren und verabreicht diese einer Wildtyp-Maus. Würde es infolgedessen bei den Tieren zu EAE-Symptomen kommen, wäre eine spezifische T-Zellaktivierung sicher nachgewiesen. Im Großen und Ganzen kann das Verständnis der zerebralen Immunreaktion entscheidend für eine richtungsweisende Therapie bei autoimmunen ZNS-Erkrankungen wie der MS sein

Die membrangebundenen Matrixmetalloproteinasen und ihre Bedeutung für die Astrozytenmigration

Trotz einer Vielzahl von Therapieansätzen ist die Prognose der Astrozytome nach wie vor ungünstig, da durch die diffuse Infiltration der Tumorzellen in das Hirnparenchym eine Resektion unmöglich ist. Auch Chemotherapeutika und Radiotherapie zeigen insbesondere auf das infiltrative Wachstum der Tumore nur wenig Wirkung, sodass neue Therapien entwickelt werden müssen, um das Überleben der Patienten zu verlängern. Membrangebundene Matrixmetalloproteinasen (MT-MMPs) sind Endopeptidasen, die Invasivitäts- und Migrationsfördernde Eigenschaften besitzen und in Astrozytomen verstärkt exprimiert werden. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, die Rolle der MT-MMPs in der Pathophysiologie der Astrozytome zu untersuchen. Für die Untersuchung wurden primäre murine Tp53-defiziente Astrozyten (Tp53-/-) retoviral mit einem der sechs humanen MT-MMP transduziert und die Expression der mRNA und der Proteine der MT-MMPs gemessen. Zur Beurteilung der Wirkung der unterschiedlichen MT-MMP wurden ein Scratch- sowie Matrigel-Invasions-Assay angewendet. Weiterhin wurde ein neuer organotypischer Migrations- und Inasionsassay auf Grundlage von Rückenmark aus dem Schwein etabliert (OPoSSM (organotypic porcine spinal slice migration)-Assay). Die Astrozyten zeigten in dem Scratch-Assay eine stark erhöhte Migration, wogegen der Matrigel-Invasions-Assay ergebnislos blieb. Denn die Astrozyten starben auf der Membran des Assays ab. Das neu etablierte OPoSSM-Assay stellte sich im Vergleich zu Standardassays (Scratch-Assay, Matrigel-Invasions-Assay) als eine besonders kostengünstige, effektive und physiologische Methode heraus. In Semidünnschnitten und der konfokalen Mikroskopie konnte dargestellt werden, dass die Astrozyten in den Rückenmarksschnitten untereinander zu Einzelketten verknüpft an der Basallamina von Gefäßen wandern und dreidimensional in alle Ebenen des Rückenmarkschnittes eindringen. Die Migrationsfähigkeit der Astrozyten wurde in Bezug auf die Infiltrationstiefe und die Gesamtkettenanzahl durch alle MT-MMPs erhöht, wobei MT4- und MT6-MMP die stärksten Pro-Migratoren waren

Einfluss von TIMP-3 auf den Verlauf der experimentellen allergischen Enzephalomyelitis

Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Effekte des Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases (TIMP-3) auf den Verlauf der experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (EAE) untersucht, die als ein Tiermodell für die Multiple Sklerose (MS) eingesetzt wird. Das TIMP-3-Protein gilt als ein potenter Inhibitor von Matrix-Metallproteinasen und reguliert neben der Angiogenese die apoptotische Kaskade. Es wurden aktiv und passiv induzierte EAE-Experimente mit TIMP-3-defizienten (TIMP-3-/--) und Wildtyp- (WT-)Mäusen durchgeführt. Im akuten Stadium der EAE konnten klinisch keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Tierlinien nachgewiesen werden. Es zeigte sich eine signifikant gestörte Remission der klinischen Symptome bei TIMP-3-/--Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (*p≤0,05). Histopathologische Untersuchungen zeigten im späten Stadium der EAE die persistierenden, nahezu komplett demyelinisierten Herde im Rückenmark der TIMP-3-/--Mäuse. Das Ausmaß der Remyelinisierung wurde mit einem Proliferationsassay für proliferierende oligodendrogliale Vorläuferzellen (Progenitoren) untersucht. Bei TIMP-3-/--Mäusen ergab sich eine reduzierte intra- und periläsionale Dichte dieser Zellen. Diese spielen eine entscheidende Rolle bei der effizienten Remyelinisierung. Außerdem zeigte sich übereinstimmend mit morphologischen Untersuchungen eine gesteigerte Expression von ADAM-17 und Caspase-3 auf mRNA-Ebene im Rückenmark von TIMP-3-/--Mäusen. Die TNF-ELISA-Untersuchung von Proteinextrakten aus dem Rückenmark ergab höhere Konzentrationen von löslichem TNF bei TIMP-3-/--Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen, welcher über den Tumor Necrosis Factor Receptor 1 (TNFR1) eine oligodendrogliale Apoptose induziert. Parallel wiesen die TIMP-3-/--Mäuse im Rückenmark geringe Mengen des membranösen TNF auf, der über den Tumor Necrosis Factor Receptor 2 (TNFR2) die Proliferation oligodendroglialer Progenitoren stimuliert. Diese Ergebnisse zeigen, dass TIMP-3 für die Remyelinisierung im Rückenmark bei der EAE wichtig ist. Die fehlende Remission in TIMP-3-/--Mäusen geht dabei mit einer veränderten TNF Aktivierung einher, die möglicherweise zur gestörten Remyelinisierung mit beiträgt, indem sie die Dichte an oligodendroglialen Vorläuferzellen beeinflusst. Diese Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis der Remyelinisierung bei und kann möglicherweise zu neuen therapeutischen Ansätzen für Patienten mit MS führen