Az alacsonyhőmérsékleti stressz hatására indukálódó regulátor gének vizsgálata búzában = Studying regulatory genes induced at low temperature in wheat

A Cbf gének olyan transzkripciós faktorokat kódolnak, melyek más gének expresszióját szabályozva vesznek részt a növények alacsonyhőmérsékleti stressz-toleranciájának kialakításában. Kutatásaink során két rendszerben, kétféle metodikával azonosítottuk, melyek azok a Cbf gének, amelyek a fagyállóság kialakításában részt vesznek a gabonafélékben. A hexaploid kenyérbúzában génexpressziós kísérletekkel (Northern analízis és Real Time RT-PCR) a Cbf14, Cbf15 és a Cbf16 géneket azonosítottuk, míg a diploid alakorban egy újonnan létrehozott térképezési populáció fagytesztjével a Cbf12, Cbf14 és a Cbf15 gének szerepét igazoltuk. A speciális genetikai anyagon végzett kísérletek lehetővé tették, hogy bizonyítsuk, ezek a gének a fagyállóságot meghatározó Fr-A2 génlókusznak (QTL) megfelelő helyen lokalizálhatók. E regulátorok szerepét a gének transzformációjával tervezzük direkt módon is bizonyítani. | Cbf genes encode cold-induced transcription factors that are involved in the development of plant frost tolerance and cold acclimation. In the current project we have identified the Cbf genes which are involved in the low-temperature stress tolerance in cereals by two independent ways. Studying the expression of these genes by Northern method and Real Time RT-PCR in bred wheat we have proved the role of genes Cbf14, Cbf15 and Cbf16, while the frost tolerance test of a novel einkorn mapping population highlighted the involvement of Cbf12, Cbf14 and Cbf15 genes. Using special genetic stocks we have also proved that these genes are localised under the frost tolerance locus Fr-A2. We plan to verify the involvement of these genes in the regulation of frost tolerance by transformation in the future

Key Molecular and Metabolic Processes Used for Genetic Engineering to Improve Freezing Tolerance in Cereals

It has been estimated recently that cereals are harvested on 700 million hectares (Mha) worldwide (Dunwell, 2014), and also that, due to low temperature damage, worldwide losses in crop production amount to about US$2 billion each year (Sanghera et al., 2011). In spite of the urgent need for more cold- or frost-tolerant cereal varieties, classical breeding programmes have shown limited progress in improving freezing tolerance (Thomashow, 1999). This lack of success is due mainly to the fact that the physiological process, i.e. the cold acclimation that leads to the development of freezing tolerance, is quite a complex quantitative trait. However, the deeper insight provided by different ‘omics’ technologies has made possible knowledge-based engineering of more stress-resistant plants; while the recent developments in cereal transformation methodology offer the technology to realize these aims. Since many recently published book chapters and reviews summarize our current knowledge on plant abiotic stress tolerance, this chapter focuses particularly on freezing tolerance, especially in cereals

Az antioxidánsok és a poli(ADP-ribóz) polimeráz szerepe a gabonafélék abiotikus stresszek által indukált öregedésében = Role of antioxidants and poly(ADP-ribose) polymerase in senescence of cereals induced by abiotic stresses

Az OTKA pályázat keretében azt vizsgáltuk, hogy a különböző antioxidánsok és a poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) milyen szerepet töltenek be az abiotikus stresszek által előidézett öregedési folyamatokban. Egy hidegtűrő és egy hidegérzékeny kukoricagenotípust különböző abiotikus stresszhatásoknak (extrém hőmérsékletek, ozmotikus stressz) kitéve jelentős különbségeket találtunk a glutation és prekurzorai összmennyiségében és redox állapotában, valamint a thioredoxin h szintjében. Ha e két kukoricagenotípusban a sötétben történő neveléssel idéztük elő az öregedést, a glutation koncentrációjában és oxidáltságánk fokában, valamint a PARP gén expressziójában és a fehérje mennyiségében nagy eltéréseket figyeltünk meg a normál megvilágításban nevelt növényekhez képest. Búza kromoszóma szubsztitúciós vonalakat felhasználva megállapítottuk, hogy azok a gének, melyek a glutation szintézisét és redox állapotát az ozmotikus és a hőstressz során befolyásolják, az 5A kromoszómán találhatók. Transzkriptom-analízissel ki tudtuk mutatni, hogy ez a kromoszóma az antioxidánsok közül a glutation S-transzferáz génjének hideg-indukálta expressziós változásaira is hatással van. Az antioxidánsok és a PARP stresszválaszban és a stressz által előidézett öregedésben betöltött szerepére további bizonyítékokat szereztünk, amikor e vegyületeket olyan növényekben tanulmányoztuk, melyeket különböző gátlószerekkel és növekedésszabályozókkal kezeltünk. | The role of the different antioxidants and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in the senescence induced by different abiotic stresses was investigated. Subjecting a chilling-tolerant and a chilling-sensitive maize genotype to various abiotic stresses (extreme temperatures, osmotic stress), a great difference was found in the total amount and redox state of glutathione and its precursors and in the concentration of thioredoxin h. If the senescence of these two maize genotypes was induced by cultivation in the continuous dark, a great difference was found in the concentration and redox state of glutathione, in the expression of PARP gene and in the amount of PARP protein compared to the plants grown under normal illumination. Using wheat chromosome substitution lines it was found, that the genes affecting the glutathione synthesis and its redox state during the osmotic and heat stresses are localised on the chromosome 5A. It was shown by transcript profiling that this chromosome also influences from the antioxidants? genes the cold-induced expression changes of the glutathione S-transferase gene. Further evidence for the role of antioxidants and PARP in the stress response and stress-induced senescence was obtained by investigation of these compounds in plants treated with different inhibitors and growth regulators

Az antioxidánsok és a poli(ADP-ribóz) polimeráz szerepe a gabonafélék abiotikus stresszek által indukált öregedésében = Role of antioxidants and poly(ADP-ribose) polymerase in senescence of cereals induced by abiotic stresses

Az OTKA pályázat keretében azt vizsgáltuk, hogy a különböző antioxidánsok és a poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) milyen szerepet töltenek be az abiotikus stresszek által előidézett öregedési folyamatokban. Egy hidegtűrő és egy hidegérzékeny kukoricagenotípust különböző abiotikus stresszhatásoknak (extrém hőmérsékletek, ozmotikus stressz) kitéve jelentős különbségeket találtunk a glutation és prekurzorai összmennyiségében és redox állapotában, valamint a thioredoxin h szintjében. Ha e két kukoricagenotípusban a sötétben történő neveléssel idéztük elő az öregedést, a glutation koncentrációjában és oxidáltságánk fokában, valamint a PARP gén expressziójában és a fehérje mennyiségében nagy eltéréseket figyeltünk meg a normál megvilágításban nevelt növényekhez képest. Búza kromoszóma szubsztitúciós vonalakat felhasználva megállapítottuk, hogy azok a gének, melyek a glutation szintézisét és redox állapotát az ozmotikus és a hőstressz során befolyásolják, az 5A kromoszómán találhatók. Transzkriptom-analízissel ki tudtuk mutatni, hogy ez a kromoszóma az antioxidánsok közül a glutation S-transzferáz génjének hideg-indukálta expressziós változásaira is hatással van. Az antioxidánsok és a PARP stresszválaszban és a stressz által előidézett öregedésben betöltött szerepére további bizonyítékokat szereztünk, amikor e vegyületeket olyan növényekben tanulmányoztuk, melyeket különböző gátlószerekkel és növekedésszabályozókkal kezeltünk. | The role of the different antioxidants and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in the senescence induced by different abiotic stresses was investigated. Subjecting a chilling-tolerant and a chilling-sensitive maize genotype to various abiotic stresses (extreme temperatures, osmotic stress), a great difference was found in the total amount and redox state of glutathione and its precursors and in the concentration of thioredoxin h. If the senescence of these two maize genotypes was induced by cultivation in the continuous dark, a great difference was found in the concentration and redox state of glutathione, in the expression of PARP gene and in the amount of PARP protein compared to the plants grown under normal illumination. Using wheat chromosome substitution lines it was found, that the genes affecting the glutathione synthesis and its redox state during the osmotic and heat stresses are localised on the chromosome 5A. It was shown by transcript profiling that this chromosome also influences from the antioxidants? genes the cold-induced expression changes of the glutathione S-transferase gene. Further evidence for the role of antioxidants and PARP in the stress response and stress-induced senescence was obtained by investigation of these compounds in plants treated with different inhibitors and growth regulators

A búza fagyállóságban szerepet játszó Cbf gének szerepének bizonyítása transzformációval = Proving the role of Cbf genes in wheat frost tolerance by transformation

A gabonafélék genomja sok CBF gént kódol. Nemrég mutattuk ki, hogy ezek közül melyek játszanak fontos szerepet a búza fagyállóságának kialakításában. A pályázatban direkt módon, transzformációval kívántuk bizonyítani e kulcsfontosságú transzkripciós faktorok szerepét. Búzából izolált génekkel Arabidopsis-t, búzát és árpát transzformáltunk; az ehhez készített konstrukciókban a beépített gént, annak folyamatos túltermelését biztosító szabályozó elem (u.n. konstitutív promóter) vezérelte. Meghatároztuk az előállított transzgénikus vonalakban a beépült gének számát, és igazoltuk azok működését. A gének hatását, a megnövekedett stressz-toleranciát kétféle fagyteszttel vizsgáltuk. Az első során - a természetes viszonyokat szimulálandó - hideg-edzést alkalmaztunk a fagyteszt előtt. A második típusú tesztben ilyet nem alkalmaztunk, mert a transzgén állandóan működött, így feltételezésünk szerint nem volt szükség hideg-indukcióra ahhoz, hogy a hatását kifejtse, azaz a fagyállóságot fokozza. Mindkét típusú fagyteszttel sikerült mindhárom növényfaj esetében olyan transzgénikus vonalakat azonosítanunk, amelyekben a fagyállóság szintje megnőtt a bevitt gén hatására. Mivel a bevitt gének más gének működést befolyásoló ún. transzkripciós faktort kódolnak, ezért vizsgáltuk az általuk szabályozott gének működését is. E kísérletek eredményei is a tanulmányozott CBF gének fagytűrés kialakításában betöltött szerepét igazolták. | Cereal genome encodes numerous CBF genes. Recently we have identified the ones that are involved in the regulation of frost tolerance. Based on these results, this project was aimed at proving directly their function by transformation methods. Arabidopsis, barley and wheat plants were transformed, with constructions that ensured the constitutive expression of the transformed CBF genes. The insertions of the transgenes were proved, the copy number estimated, and their functionality were verified in each transgenic lines developed. The effectiveness of the genes was tested in freezing tests. One type of test was applied with cold hardening period while the other was applied without it. The efficiency of the transgenes was proved in both test types for each plant species, i.e. transgenic Arabidopsis, barley and wheat lines with increased frost tolerance level were indeed identified. Since CBF genes code for transcription factors, the expression patterns of several downstream genes were also recorded. These experiments also proved the effectiveness of the candidate CBF genes in the regulation of cereal frost tolerance

Identification, Structural and Functional Characterization of Dormancy Regulator Genes in Apricot (Prunus armeniaca L.)

In the present study, we identified and characterized the apricot (Prunus armeniaca L.) homologs of three dormancy-related genes, namely the ParCBF1 (C-repeat binding factor), ParDAM5 (dormancy-associated MADS-BOX) and ParDAM6 genes. All highly conserved structural motifs and the 3D model of the DNA-binding domain indicate an unimpaired DNA-binding ability of ParCBF1. A phylogenetic analysis showed that ParCBF1 was most likely homologous to Prunus mume and Prunus dulcis CBF1. ParDAM5 also contained all characteristic domains of the type II (MIKCC) subfamily of MADS-box transcription factors. The homology modeling of protein domains and a phylogenetic analysis of ParDAM5 suggest its functional integrity. The amino acid positions or small motifs that are diagnostic characteristics of DAM5 and DAM6 were determined. For ParDAM6, only a small part of the cDNA was sequenced, which was sufficient for the quantification of gene expression. The expression of ParCBF1 showed close association with decreasing ambient temperatures in autumn and winter. The expression levels of ParDAM5 and ParDAM6 changed according to CBF1 expression rates and the fulfillment of cultivar chilling requirements (CR). The concomitant decrease of gene expression with endodormancy release is consistent with a role of ParDAM5 and ParDAM6 genes in dormancy induction and maintenance. Cultivars with higher CR and delayed flowering time showed higher expression levels of ParDAM5 and ParDAM6 toward the end of endodormancy. Differences in the timing of anther developmental stages between early- and late-flowering cultivars and two dormant seasons confirmed the genetically and environmentally controlled mechanisms of dormancy release in apricot generative buds. These results support that the newly identified apricot gene homologs have a crucial role in dormancy-associated physiological mechanisms

Circadian and Light Regulated Expression of CBFs and their Upstream Signalling Genes in Barley

Abstract: CBF (C-repeat binding factor) transcription factors show high expression levels in response to cold; moreover, they play a key regulatory role in cold acclimation processes. Recently, however, more and more information has led to the conclusion that, apart from cold, light—including its spectra—also has a crucial role in regulating CBF expression. Earlier, studies established that the expression patterns of some of these regulatory genes follow circadian rhythms. To understand more of this complex acclimation process, we studied the expression patterns of the signal transducing pathways, including signal perception, the circadian clock and phospholipid signalling pathways, upstream of the CBF gene regulatory hub. To exclude the confounding effect of cold, experiments were carried out at 22 �C. Our results show that the expression of genes implicated in the phospholipid signalling pathway follow a circadian rhythm. We demonstrated that, from among the tested CBF genes expressed in Hordeum vulgare (Hv) under our conditions, only the members of the HvCBF4-phylogenetic subgroup showed a circadian pattern. We found that the HvCBF4-subgroup genes were expressed late in the afternoon or early in the night. We also determined the expression changes under supplemental far-red illumination and established that the transcript accumulation had appeared four hours earlier and more intensely in several cases. Based on our results, we propose a model to illustrate the effect of the circadian clock and the quality of the light on the elements of signalling pathways upstream of the HvCBFs, thus integrating the complex regulation of the early cellular responses, which finally lead to an elevated abiotic stress tolerance

Overexpression of Two Upstream Phospholipid Signaling Genes Improves Cold Stress Response and Hypoxia Tolerance, but Leads to Developmental Abnormalities in Barley

Phosphatidylinositol transfer protein (PITP) and phosphatidylinositol 4 kinase (PI4K) are upstream regulatory elements of the phospholipid signaling pathway. PITP and PI4K over expressing transgenic barley lines were developed and studied. We revealed that the over expression of the PITP and PI4K genes increased stress tolerance during hypoxic cold stress, but not during salinity stress, and differences were also found in the level of frost tolerance. On the other hand, we ralised that the over expression of these upstream signaling elements led to more phenotypic abnormalities than in other transgenic studies working with effector genes or even transcription factors. We hypothesize that this high level of abnormalities are the consequence of the modulation of a very upstream signal transduction pathway elements