Detección de mutaciones en los genes K-ras, H-ras y EGFR en muestras de plasma sanguíneo y cepillado cervical de pacientes con neoplasia intraepitelial cervical (NIC) III y cáncer de cuello uterino

Introduction: Cervical cancer is the second most important cancer in women worldwide, and the second cause of cancer death in women. It has been shown that the process of cervical carcinogenesis presents as genetic and epigenetic components as environmental issues. At present, many studies are addressed in searching for molecular markers such as mutations in oncogenes and/or tumor suppressor genes that are associated with the progression of this disease, the most studied candidate genes in cervical cancer in different populations have been H-ras, K-ras, EGFR among others. Objective: The present study identified human papilloma virus (HPV) generic and specific in DNA-free plasma and cervical smears of invasive cervical cancer patients and patients with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) III in addition to assessing genetic alterations, such as mutations in the genes H-ras, EGFR and K-ras. Methods: To do so generic HPV was detected by PCR with primers GP5+/GP6+, and specific HPV 16 and 18 in E6/E7 region; to detect mutations in codon 12 of H-ras, codons 12 and 13 of K-ras and EGFR exon 21 was conducted by direct sequencing of PCR products of these gene fragments. Results: Getting a good correlation between samples of blood plasma and cervical smears for both; the findings of HPV p=0.0374 and evaluated mutations p=0. In general, for EGFR in exon 21 mutations were not found, as for codons 12 and 13 in K-ras and codon 12 in H-ras. Conclusion: The use of DNA in plasma may be relevant to the analysis of mutations and the presences of tumor markers are not available from other samples. Introducción: El cáncer cervical es el segundo cáncer más importante en mujeres a nivel mundial y la segunda causa de muerte en mujeres por cáncer. Se ha demostrado que el proceso de carcinogénesis cervical presenta componentes tanto genéticos, epigenéticos y medio ambientales. En la actualidad, muchos estudios se encaminan en la búsqueda de marcadores moleculares como mutaciones en oncogenes y/o genes tumor supresor que se asocien con la progresión de esta entidad. Los genes candidatos más estudiados en cáncer cervical en distintas poblaciones han sido H-ras, K-ras, EGFR entre otros. Objetivos: Se identificó el virus de papiloma humano (VPH) genérico y específico en el ADN libre de plasma y de cepillado cervical de pacientes con cáncer cervical invasivo y con neoplasia intraepitelial cervical (NIC) III además de evaluar alteraciones genéticas, como mutaciones en los genes H-ras, K-ras y EGFR. Metodología: Para ello se detectó el VPH genérico mediante PCR con los iniciadores GP5+/GP6+, y específico para VPH 16 y 18 en la región E6/E7. Para detectar las mutaciones en el codón 12 de H-ras, codones 12 y 13 de K-ras y el exón 21 de EGFR se realizó mediante secuenciación directa de los productos de PCR de estos fragmentos génicos. Resultados: Obteniendo una buena correlación entre las muestras de plasma sanguíneo y los cepillados cervicales, tanto para los hallazgos de VPH p=0.0374 como para las mutaciones evaluadas p=0. En general, para EGFR en el exón 21 no se encontraron mutaciones, al igual que para los codones 12 y 13 en K-ras y codón 12 en H-ras. Conclusión: El uso del ADN presente en el plasma puede ser relevante para el análisis de mutaciones y de la presencia de marcadores tumorales cuando no se dispone de otras muestras

Detección del virus del papiloma humano (VPH) en ADN de plasma restaurado de mujeres en quienes se diagnosticaron lesiones pre-invasivas y cáncer cervical invasivo

Objective: To improve the sensitivity of Human Papillomavirus (HPV) detection in plasma from high-grade cervical neoplasia patients (CIN III) and cervical cancer (CC) evaluating any likely correlation with disease stage. Method: We subjected plasma DNA isolates from 112 patients (CIN and ICC) to a pre-PCR restoration treatment to improve detection sensitivity. HPV-specific sequences were detected by conventional PCR both in cervical scrapes and plasma DNA obtained from each patient. For every single DNA sample, both non-restored and restored isolates were PCR analyzed. Results: We detected HPV in plasma DNA isolates with significantly higher efficiency on restored plasma-DNA as compared to each non-restored equivalent, still maintaining close correlation with the clinical stage of the cases. By analyzing plasma-DNA isolates we could classify as HPV positive >50.0% of the cases that were previously known to be positive from the cervical scrape based assay. Interestingly, 100% of the cases in which subtype HPV18 was detected in cervical scrapes were also positive in plasma DNA. Conclusions: Restoration of plasma DNA from cervical cancer patients allows a more sensitive PCR-based HPV detection, maintaining the correlation to disease stage traditionally observed. Objetivo: Mejorar la sensibilidad y la detección del virus del papiloma humano (VPH) en el plasma de pacientes con neoplasias intraepiteliales de alto grado (NIEAG) y cáncer de cuello uterino (CCU) para evaluar si existe una relación con el estadío de la enfermedad. Método: Los ADN de plasma aislados de 112 pacientes (NIC y CCU) se sometieron a restauración mediante reacción de la polimerasa en cadena (siglas en inglés, PCR), para mejorar su calidad como sustrato para PCR. En cada paciente se detectaron secuencias específicas del VPH por PCR convencional, tanto en exudados cérvico-vaginales como en ADN del plasma. Por cada muestra se analizaron por PCR, cantidades equivalentes del ADN aislado, tanto no restaurado como restaurado. Resultados: Para las muestras pareadas se pudo detectar VPH en ADN de plasma de forma más eficiente en los materiales restaurados, pues se mantuvo una estrecha correlación con el estadío clínico de los casos. Mediante el análisis de ADN de plasma es posible detectar como VPH positivas más de 50% de los casos que se identificaron previamente como positivos en citología de cuello uterino. Se enfatiza el hecho que 100% de los casos en los que el subtipo VPH18 fue descubierto en exudado cérvico-vaginal también fueron positivos en el ADN de plasma. Conclusiones: El proceso de restauración de ADN de plasma de pacientes con cáncer de cuello uterino permite mejorar la detección de VPH, por PCR, y mantener la correlación con el estadío de la enfermedad

Amplificación oncogénica como marcador tumoral en un grupo de pacientes con cáncer pulmonar

Introduction: In spite of recent treatment advances, lung cancer continues to be the first world cancer related death cause; its mortality associated occupied the fifth place in Colombia in 2004. Complete surgical resection is the therapeutic option with the greatest cure probability, however it results frequently ineffective given the current incapacity in Colombia to an early detection of the disease. This study reports the characterization of a group of 30 lung cancer patients regarding the gene dose (gene copy number) found at the loci corresponding to genes EGFR (erb B1), PIK3CA and C-myc in tumor samples, and compares the results with the dose found in adjacent lung from the same patients. Methods: The gene dose of EGFR (erbB1), PIK3CA, and C-myc were measured by real time PCR in matched tumor and normal lung tissue samples. Results are expressed as the multiplicity of each gene dose with respect to a single copy reference gene. In this case the gene HHB (human hemoglobin). Antiquity of the cases ranged from 5 to 10 years. Results: An increased gene dose for EGFR and PIK3CA was a feature clearly associated to the tumor phenotype of the sample (found in 96 and 100% of the tumors respectively). Quantitative measure of this feature demonstrated for both genes a high sensitivity and specificity for tumor/normal discrimination as confirmed by the ROC analysis. On the other hand, the Spearman test showed a great correlation between EGFR and PIK3CA doses (ρ=0.75). C-myc was the gene whose dose was less consistently correlated to the tumor phenotype, however most of the patients with amplified C-myc presented distant spread of tumor cells (metastasis) at diagnosis. Conclusion: Quantitative measurement of EGFR, PIK3CA, and C-myc gene dose by real time PCR provides a method for tumor phenotype recognition in DNA samples from lung tissue. These markers can be considered at the construction of a marker panel for lung cancer detection on alternative, non-invasive clinical samples. However clinical value will depend on the use of additional molecular markers, some of which could be of epigenetic character. Introducción: A pesar de los avances terapéuticos actuales, el cáncer de pulmón sigue como la primera causa de muerte por cáncer en el mundo, ocupando Colombia el quinto lugar en mortalidad por este tipo de afección en el 2004. La resección quirúrgica total es la alternativa terapéutica con mayores probabilidades de curaciones, pero resulta poco efectiva en el país por la incapacidad actual para detectar tempranamente la enfermedad. Este trabajo informa la caracterización de un grupo de 30 pacientes con cáncer de pulmón con referencia a la dosis génica hallada en los loci correspondientes a los genes EGFR (erb B1), PIK3CA y C-myc en muestras tumorales, comparada con la dosis encontrada en el tejido normal adyacente de los mismos enfermos. Métodos: La dosis génica se midió en cada caso por PCR en tiempo real sobre ADN aislado de tejido tumoral y normal preservado en parafina de cada paciente. Los resultados se expresan como el número de veces que la dosis de cada gen sobrepasa la dosis de un gen de referencia, en este caso el HHB (hemoglobina humana β). El rango de antigüedad de los casos fue de 5 a 10 años. Resultados: Una dosis génica incrementada para los genes EGFR, PIK3CA demostró ser una característica claramente asociada con el fenotipo tumoral (96% y 100% de los tumores respectivamente). La medición cuantitativa de dicho fenómeno demostró en ambos casos gran sensibilidad y especificidad para la discriminación tumor/normal como lo confirma el análisis ROC. Por otro lado, la amplificación simultánea de ambos genes en el mismo paciente fue un hecho observado con alta frecuencia (Spearman=0.75). La dosis de C-myc mostró una asociación menos consistente con el carácter tumoral, sin embargo todos los pacientes con C-myc amplificado presentaron dispersión distante de células tumorales (metástasis). Conclusión: La detección cuantitativa del estado de amplificación de los genes EGFR, PIK3CA y C-myc por PCR en tiempo real provee un medio sensible para reconocer el fenotipo tumoral en muestras de ADN extraído de tejido pulmonar. Estos marcadores podrían considerarse en el desarrollo de sistemas de detección (paneles) orientados a muestras clínicas alternativas como el plasma sanguíneo. Sin embargo, la definición de un panel de marcadores con valor clínico requiere el estudio de marcadores adicionales entre los cuales podrían incluirse algunos de tipo epigenético

Seroprevalencia de citomegalovirus en donantes de órganos y receptores de trasplante renal, Colombia, 2010-2014

Introduction: Cytomegalovirus infections have gained high importance for individuals that have received organ transplants given the clinical implications this may have in immunocompromised patients. Objective: To describe the seroprevalence of cytomegalovirus in organ donors and recipients of kidney transplants nationwide from the six regions established by the Red Nacional de Donación y Trasplante. Materials and methods: We conducted a descriptive retrospective study that included 1,813 organ donors and 3,313 recipients of kidney transplants, and we calculated IgM and IgG seroprevalence for cytomegalovirus. IgG prevalence was stratified according to sex, age group, and region, and the results were analyzed in each donor-recipient pair and classified according to the risk. Statistical packages IBM SPSS®, Statistics 22, and Epi Info 7 were utilized. Results: IgG prevalence for cytomegalivirus was 86.8% in donors and 91.0% in kidney transplant recipients with statistical significance observed for age, geographical location, and between donors and recipients. We analyzed 1,764 pairs of donors and recipients, of which 91.4% were categorized as having intermediate risk. Conclusions: The results of this study showed high cytomegalovirus infection rates in Colombia. Given the risk, categorization of patients undergoing transplants, measures should be adopted by medical teams to minimize risks.Introducción. La infección por citomegalovirus ha cobrado gran importancia en los receptores de trasplantes debido a las implicaciones clínicas que puede tener en pacientes inmunocomprometidos.Objetivo. Describir la seroprevalencia del citomegalovirus en donantes de órganos y receptores de trasplante renal a nivel nacional seleccionados de las seis regionales en que está dividido el país según las áreas de actuación de la Red Nacional de Donación y Trasplante.Materiales y métodos. Se hizo un estudio descriptivo y retrospectivo que incluyó 1.813 donantes de órganos y 3.313 personas receptoras de trasplante renal, y se calculó la seroprevalencia general de IgM e IgG para citomegalovirus. La prevalencia de IgG se estratificó por sexo, grupos de edad y regional, se analizó el resultado en cada pareja de donante y receptor, y se estratificó el riesgo. Se utilizaron los paquetes estadísticos IBM SPSS®, Statistics 22, y Epi-Info 7.Resultados. La prevalencia de IgG para citomegalovirus fue de 86,2 % en donantes y de 91,0 % en receptores de trasplante renal, con diferencias estadísticamente significativas por edad, por criterio geográfico y según su calidad de donantes o receptores. Se analizaron 1.764 parejas de donante y receptor, de las cuales 91,4 % se clasificó como de riesgo intermedio.Conclusiones. Los resultados del presente estudio evidenciaron que las tasas de infección por citomegalovirus fueron altas y que la categorización del riesgo de los receptores de trasplante señala la necesidad de que los equipos médicos tratantes tomen medidas para minimizar los riesgos

Detection of Genes Mutations in the K-RAS, H-RAS and EGFR in Samples of Blood Plasma and Cervical Smears for Patients with Cervical Intraepithelial Neoplasia III and Cervical Cancer

Introduction: Cervical cancer is the second most important cancer in women worldwide, and the second cause of cancer death in women. It has been shown that the process of cervical carcinogenesis presents as genetic and epigenetic components as environmental issues. At present, many studies are addressed in searching for molecular markers such as mutations in oncogenes and/or tumor suppressor genes that are associated with the progression of this disease, the most studied candidate genes in cervical cancer in different populations have been H-ras, K-ras, EGFR among others. Objective: The present study identified human papilloma virus (HPV) generic and specific in DNA-free plasma and cervical smears of invasive cervical cancer patients and patients with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) III in addition to assessing genetic alterations, such as mutations in the genes H-ras, EGFR and K-ras. Methods: To do so generic HPV was detected by PCR with primers GP5+/GP6+, and specific HPV 16 and 18 in E6/E7 region; to detect mutations in codon 12 of H-ras, codons 12 and 13 of K-ras and EGFR exon 21 was conducted by direct sequencing of PCR products of these gene fragments. Results: Getting a good correlation between samples of blood plasma and cervical smears for both; the findings of HPV p=0.0374 and evaluated mutations p=0. In general, for EGFR in exon 21 mutations were not found, as for codons 12 and 13 in K-ras and codon 12 in H-ras. Conclusion: The use of DNA in plasma may be relevant to the analysis of mutations and the presences of tumor markers are not available from other samples.Introducción: El cáncer cervical es el segundo cáncer más importante en mujeres a nivel mundial y la segunda causa de muerte en mujeres por cáncer. Se ha demostrado que el proceso de carcinogénesis cervical presenta componentes tanto genéticos, epigenéticos y medio ambientales. En la actualidad, muchos estudios se encaminan en la búsqueda de marcadores moleculares como mutaciones en oncogenes y/o genes tumor supresor que se asocien con la progresión de esta entidad. Los genes candidatos más estudiados en cáncer cervical en distintas poblaciones han sido H-ras, K-ras, EGFR entre otros. Objetivos: Se identificó el virus de papiloma humano (VPH) genérico y específico en el ADN libre de plasma y de cepillado cervical de pacientes con cáncer cervical invasivo y con neoplasia intraepitelial cervical (NIC) III además de evaluar alteraciones genéticas, como mutaciones en los genes H-ras, K-ras y EGFR. Metodología: Para ello se detectó el VPH genérico mediante PCR con los iniciadores GP5+/GP6+, y específico para VPH 16 y 18 en la región E6/E7. Para detectar las mutaciones en el codón 12 de H-ras, codones 12 y 13 de K-Ras y el exón 21 de EGFR se realizó mediante secuenciación directa de los productos de PCR de estos fragmentos génicos. Resultados: Obteniendo una buena correlación entre las muestras de plasma sanguíneo y los cepillados cervicales, tanto para los hallazgos de VPH p=0.0374 como para las mutaciones evaluadas p=0. En general, para EGFR en el exón 21 no se encontraron mutaciones, al igual que para los codones 12 y 13 en K-ras y codón 12 en H-ras. Conclusión: El uso del ADN presente en el plasma puede ser relevante para el análisis de mutaciones y de la presencia de marcadores tumorales cuando no se dispone de otras muestras