High-Level Expression of Recombinant Bovine Lactoferrin in Pichia pastoris with Antimicrobial Activity

In this study, bovine lactoferrin (bLf), an iron-binding glycoprotein considered an important nutraceutical protein because of its several properties, was expressed in Pichia pastoris KM71-H under AOX1 promoter control, using pJ902 as the recombinant plasmid. Dot blotting analysis revealed the expression of recombinant bovine lactoferrin (rbLf) in Pichia pastoris. After Bach fermentation and purification by molecular exclusion, we obtained an expression yield of 3.5 g/L of rbLf. rbLf and predominantly pepsin-digested rbLf (rbLfcin) demonstrated antibacterial activity against Escherichia coli (E. coli) BL21DE3, Staphylococcus aureus (S. aureus) FRI137, and, in a smaller percentage, Pseudomonas aeruginosa (Ps. Aeruginosa) ATCC 27833. The successful expression and characterization of functional rbLf expressed in Pichia pastoris opens a prospect for the development of natural antimicrobial agents produced recombinantly

Análisis morfológico de la diversidad del pasto navajita [Bouteloua gracilis (Willd. ex kunth) lag. ex steud.], en Chihuahua, México

An efficient morphologic characterization of plants includes evaluation of forage traits. The objective was to analyze morphologic diversity in native populations of blue grama grass [Bouteloua gracilis (Willd. ex Kunth) Lag. ex Steud.] in Chihuahua. In 2006, 173 ecotypes were collected in Chihuahua and transplanted in La Campana Experimental Site. Ecotypes were evaluated through morphological traits and their population structure was defined. Principal component and cluster analysis were used for data analysis. The three first principal components explained 57.3 % of total variation. The PC1, PC2 and PC3 explained 35.3 %, 12.4 % and 9.52 % of the global variation, respectively. Most important variables for PC1 were forage yield, stem density, and plant height, for PC2 were spikelet width, inflorescence length and spikelet number, and for PC3, stem diameter, leaf width and spikelet length. The PC1 included variables related to growth capacity. The PC2 grouped variables associated to propagation and dispersion. The PC3 included variables related to biomass accumulation. Also, four groups were obtained from the 145 established ecotypes. Groups 1, II, III, and IV included 59, 24, 19, and 43 ecotypes, respectively. A high morphological diversity was observed and ecotypes with high forage potential were detected according to their morphological trails. Genetic variability in blue grama grass from Chihuahua is readily available and specimens having excellent forage characteristics could be used in range improvements programs.Una eficiente caracterización morfológica de plantas es el empleo de descriptores forrajeros seleccionados. El objetivo fue analizar la diversidad morfológica de poblaciones nativas del pasto navajita [Bouteloua gracilis (Willd. ex Kunth) Lag. ex Steud.]. En el año 2006 se recolectaron 173 ecotipos de navajita en Chihuahua, y se trasplantaron en el Sitio Experimental La Campana. Los ecotipos establecidos se calificaron mediante descriptores morfológicos y se definió su estructura poblacional. Los datos se analizaron por medio de componentes principales (CP) y conglomerados jerárquicos. Los tres primeros componentes explicaron 57.3 % de la variación total obtenida. El CP1 explicó 35.3 %, el CP2 12.4 % y el CP3 9.52 % de la variación global. Para el CP1 las variables más importantes fueron rendimiento de forraje, densidad de tallos y altura de forraje, para el CP2, grosor de espigas, longitud de inflorescencia y número de espigas y en el CP3, diámetro de tallo, ancho de lámina de hoja y longitud de espiga. El CP1 agrupó variables relacionadas con capacidad de crecimiento. El CP2 incluyó variables que reflejan rasgos de dispersión y propagación. El CP3 reunió variables relacionadas con la asignación de biomasa. Además, se obtuvieron cuatro grupos que integraron a los 145 ecotipos establecidos. El grupo I, II, III y IV integraron 59, 24, 19 y 43 ecotipos, respectivamente. Se presentó alta variabilidad morfológica y se detectaron ecotipos con alto potencial forrajero de acuerdo a su diversidad morfológica. Se dispone de variabilidad morfológica de pasto navajita con atributos forrajeros sobresalientes para ser incluidos en programas de mejoramiento de pastizales

Diagnóstico rápido y efectivo de brucelosis bovina en sangre, mediante una reacción en cadena de la polimerasa doble

Brucellosis is a major infectious disease of cattle. It is also an international trade barrier for the import and export of dairy and beef products. In Mexico, bovine brucellosis is diagnosed using the card, rivanol, and complement fixation serological tests. Molecular methods such as polymerase chain reaction (PCR) are rapid, specific diagnostic tools for brucellosis. This research developed a duplex PCR assay for the diagnosis of brucellosis in cattle blood samples, using the omp2 and BSCP31 genes. Fifty three (53) blood samples with rivanol titers of 1:400, and 60 serologically-negative samples were used. The optimum concentrations of both primers and magnesium chloride for specific fragment amplifications were 100 nM and 0.5 mM, respectively. The analytical sensitivity of duplex PCR was 100 fg/μ,,,,l DNA, while the optimum amplification concentration was 1 ng/μ,,,,l DNA. Analytical specificity was 100%. Diagnostic sensitivity and specificity were 96.3% and 100%, respectively. The results of this study provide evidence for the routine use of duplex PCR in the diagnosis of bovine brucellosis directly on blood samples, as a highly safe, sensitive, specific method.La brucelosis es una de las enfermedades infecciosas más importantes del ganado y representa una barrera para la importación y exportación de productos lácteos y cárnicos. En México, el diagnóstico se realiza mediante las pruebas serológicas de tarjeta, rivanol y fijación del complemento. Los métodos moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), son herramientas rápidas y especí­ficas para el diagnóstico de la enfermedad. En el presente trabajo se desarrolló el diagnóstico de brucelosis por PCR doble, a partir de muestras de sangre, utilizando los genes omp2 y BSCP31. Para este estudio se utilizaron 53 muestras de sangre con tí­tulos de rivanol de 1:400 y 60 muestras con resultados negativos a las pruebas serológicas. Las concentraciones óptimas de iniciadores y cloruro de magnesio para lograr la amplificación especí­fica de los dos fragmentos, fueron de 100 nM y 0.5 mM respectivamente. La sensibilidad analí­tica alcanzada para la PCR doble fue de 100 fg/μ,,,,l de ADN, mientras que la concentración óptima de amplificación fue de 1 ng/μ,,,,l de ADN. La especificidad analí­tica obtenida fue del 100 %, mientras que la sensibilidad y la especificidad diagnóstica fueron del 96.3 % y 100 % respectivamente. Los resultados de este estudio aportan evidencia para el uso rutinario de la PCR doble para el diagnóstico de la brucelosis bovina directamente de muestras de sangre, ya que es un método altamente seguro, sensible y especí­fico

Chloroplasts: The Future of Large-Scale Protein Production

Chloroplast engineering has matured considerably in recent years. It is emerging as a promising tool to address the challenges related to food security, drug production, and sustainable energy posed by an ever-growing world population. Chloroplasts have proven their potential by efficiently expressing transgenes, encapsulating recombinant proteins, and protecting them from cellular machinery, making it possible to obtain highly functional proteins. This quality has also been exploited by interfering RNA technology. In addition to the practical attributes offered by chloroplast transformation, such as the elimination of position effects, polycistronic expression, and massive protein production, the technique represents an advance in biosafety terms; however, even if its great biotechnological potential, crops that have efficiently transformed are still a proof of concept. Despite efforts, other essential crops have remained recalcitrant to chloroplast transformation, which has limited their expansion. In this chapter, we address the most recent advances in this area and the challenges that must be solved to extend the transformation to other crops and become the de facto tool in plant biotechnology

Método para la extracción de ADN cloroplastídico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares

La manipulación genética del genoma de cloroplasto esta a la vanguardia en investigación biotecnológica. El pasto B. gracilis es  un modelo para el estudio de estrés hídrico y oxidativo, capacidades relacionadas al cloroplasto. Es necesario tener un método que facilite  la obtención de ADN de buena calidad, particularmente cuando se refiere al ADN de cloroplasto de B. gracilis. La implementación de  un método para la extracción de cpADN se logró probando diferentes  estrategias de extracción de cpADN reportados en la literatura y  combinando las etapas más apropiadas para B. gracilis. La  incorporación de un paso adicional del lavado con CTAB permitió la   recuperación de cpDNA enriquecido, el cual se puede utilizar en el desarrollo de hermanitas moleculares. Debido la implementación de  un protocolo de extracción también fue posible obtener una cantidad  considerable de cpADN de B. gracilis. El cpADN fue digerido con  varias enzimas de restricción y los fragmentos resultantes fueron analizados por Southern blot con las sondas de los genes de rADN 16S y 23S. Abstract   Genetic manipulation of the chloroplast genome is at the forefront  of biotechnology research. B. gracilis is a model for the study  of water stress and oxidative capacities related to the  chloroplast. It is requires a method to facilitate the obtaining of  good quality DNA, particularly when it comes to chloroplast   DNA of B. gracilis. The implementation of a method for extracting  cpDNA was achieved by assaying different strategies cpDNA  extraction reported in the literature and combining the most  appropriate stage for B. gracilis for cpDNA extraction. The  incorporation of an additional step of washing with CTAB after  lysis of chloroplasts, allowed the recovery of enriched cpDNA which can be used in the development of molecular tools. Due  to the implementation of an extraction protocol was also possible   to obtain a considerable amount of B. gracilis cpDNA. The cpDNA  was digested with several restriction enzymes and the resulting  fragments were analyzed by Southern blot with probes of genes rADN 16S and 23S