Functional characterization of tumour-derived exosomes in the zebrafish xenograft model

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Os exossomas, são as vesículas extracelulares mais pequenas que se conhece, com diâmetros entre 30 e 150 nm, compostos por uma bicamada fosfolipídica que pode conter ácidos nucleicos, proteínas, enzimas, lípidos, citoquinas, entre outras moléculas, podendo portanto, representar em parte o genótipo e fenótipo das suas células de origem. Uma das principais funções dos exossomas é o seu papel como intermediários na comunicação célula-a-célula, suportando a progressão do cancro através da reprogramação do microambiente tumoral. Para tal, os exossomas desempenham diferentes papéis, incluindo modulação de permeabilidade vascular, educação de células estromais, assim como a ‘educação’ e recrutamento de células derivadas da medula óssea. Sabe-se que estas vesículas preparam um microambiente favorável em futuros locais metastáticos, antes da chegada das células tumorais, os chamados ‘nichos pré-metastáticos’. Além disso, estudos recentes demonstram que o padrão de biodistribuição de exossomas tumorais em modelos murinos está diretamente correlacionado com o local da formação de microambientes pró-metastáticos e, consequentemente, com o perfil de disseminação metastática dos tumores em questão. Sabe-se ainda que este padrão de biodistribuição, ou organotropismo, dos exossomas derivados de tumores pode ser explicado, em parte, pelo seu perfil de composição de integrinas membranares. Desta forma, argumenta-se que a caracterização dos exossomas em circulação pode servir de ferramenta para prever a propensão para doença metastática, assim como, determinar para que órgão a doença poderá metastizar no futuro. Por ser possível obter estes exossomas a partir de fluidos corporais, como o plasma sanguíneo, os exossomas têm potencial como fonte não invasiva para a obtenção de biomarcadores de cancro. Além de estudos de caracterização de conteúdo molecular, tendo em vista a grande complexidade das possíveis interações de exossomas tumorais com o organismo do hospedeiro, faz-se indispensável a aplicação de estudos in vivo, tais como os envolvendo roedores. Apesar de muito informativos, estes modelos requerem uma quantidade significativa de exossomas, dificultando e/ou impedindo a realização de ensaios in vivo a partir de fontes limitadas de exossomas, tal como plasma sanguíneo de doentes oncológicos. Tendo em conta a correlação direta entre a biodistribuição exossomal e o organotropismo tumoral, o desenvolvimento de ensaios in vivo que permitam identificar a biosdistribuição exossomal, são de grande importância para a caracterização do perfil das doenças oncológicas. Para tal, neste projeto propusemo-nos a testar a aplicabilidade de modelos de pequena escala, tal como o de peixe-zebra (Danio rerio), para estudos in vivo da atividade biológica de exossomas derivados de tumores. O peixe-zebra é um modelo já muito utilizado em investigação biomédica, apresentando uma grande semelhança genética aos humanos (70% de todos os genes associados a doenças humanas têm homólogos funcionais em peixe-zebra), sendo vários os sistemas e órgãos notavelmente semelhantes aos dos humanos. Além disso, a vasculatura embriónária e os genes e cascatas de sinalização moleculares que controlam a hematopoiese são altamente conservados entre peixes e mamíferos. A semelhança da hematopoiese entre peixe-zebra e mamíferos vai para além da conservação de genes, partilhando também todos os tipos de células sanguíneas que são geradas de células estaminais de linhagens em comum. Para além disto, o peixe-zebra apresenta vantagens técnicas e funcionais muito relevantes frente a modelos de roedores, tendo menor custo de manutenção do que os modelos murinos e permitindo um maior número de indivíduos por experiência. Além disso, a transparência dos peixes-zebra em fase larval permite a visualização não intrusiva de órgãos e processos biológicos in vivo, ao contrário dos modelos murinos adultos, nos quais tais aspectos só podem ser observados a partir de ensaios ex vivo. Para ser possível efetuar qualquer estudo com exossomas neste novo modelo, foi necessária a estandardização da dose de exossomas a injetar nas larvas de peixe-zebra. Neste sentido, isolámos e testámos diferentes doses de exossomas de algumas linhas de células tumorais murinas: cancro do pâncreas, parental e metastática (nomeadamente, PAN02 e PAN02-H3) e também de melanoma (B16-F10). Em ratinho, PAN02 e PAN02-H3 são altamente metastáticas para fígado e B16-F10 para os pulmões. Como controlo não tumoral, isolámos exossomas a partir da cultura de pâncreas de ratinhos saudáveis. O padrão é injetar 5 a 10 ug de proteína exossomal em ratinhos, os quais têm cerca de 25 g de massa corporal. Sendo a larva de peixe-zebra um modelo muito menor, com aproximadamente 1 mg de massa corporal, tentámos reduzir esta dose de injeção em pelo menos 1000 vezes, de microgramas para nanogramas. Testámos injetar doses num intervalo entre 0.5 a 50 ng, em larvas de peixe-zebra às 48 horas pós fertilização. Concluímos que a dose recomendável para ser possível visualizar sinal exossomal, sem este estar saturado, seria a dose de 5 ng por larva. Observámos que o sinal mais significativo de exossomas apresentou-se sempre na zona caudal das larvas, transversalmente a todos os tipos de exossomas injetados. Esta região é denominada por tecido hematopoiético caudal (caudal hematopoietic tissue, CHT), local transitório onde ocorre a hematopoiese na larva e o órgão análogo ao fígado fetal dos mamíferos. Por isso, neste trabalho, focámo-nos principalmente na análise do CHT, subdividindo esta região em dois quadrantes (Q), Q7 e Q8. No Q7 foi possível observar diferenças significativas no número de células que incorporaram exossomas, sendo este número maior nos exossomas PAN02 do que nos B16-F10. De forma a tentar estudar melhor o organotropismo destes exossomas, testámos também exossomas com biodistribuição semelhante a PAN02, derivados de cancro colorectal (CT26-FL3), altamente metastático para fígado. Além disso, testámos exossomas derivados de Lewis Lung Carcinoma (LLC), para comparar estes com os resultados dos B16-F10, ambos tumores altamente metastáticos para o pulmão. Nestas últimas experiências os resultados obtidos não apresentaram diferenças significativas na zona do CHT entre os diferentes tipos de exossomas tumorais injetados. No entanto, observámos, consistentemente, que a afinidade dos exossomas derivados de pâncreas saudáveis (Normal Pan) com os tecidos na região do CHT era mais reduzida do que todos os exossomas tumorais testados. Este resultado permitiu-nos concluir que a retenção dos exossomas naquele local não era exclusivamente mecânica e que existe algum tipo de interação entre os exossomas tumorais e o tecido hematopoiético caudal das larvas de peixe-zebra. Este padrão de biodistribuição relaciona-se com o que foi observado em ratinho, onde os exossomas têm um papel na comunicação entre as células tumorais e as células derivadas da medula óssea (bone marrow derived cells, BMDCs), as quais desempenham um papel preponderante para o desenvolvimento de fenótipos pró-metastáticos. Além disso, medimos no modelo de peixe-zebra a incorporação de exossomas por células mielóides, frequentemente envolvidas nos efeitos in vivo de exossomas tumorais, como os macrófagos. Através de resultados preliminares, pudemos observar que uma parte da população de células, cerca de 5-15%, que incorporaram exossomas eram células mielóides. Neste trabalho, testámos também diferentes doses de exossomas isolados a partir de plasma de pacientes de cancro de pâncreas, no modelo de peixe-zebra. A dose determinada anteriormente para exossomas isolados a partir de culturas celulares, 5 ng, não foi suficiente para obter um sinal exossomal. Desta forma, a dose teve de ser aumentada para 30 ng por individuo. Apesar da necessidade do aumento da dose em 6 vezes, esta ainda é mais de 166 vezes menor do que a utilizada em modelos murinos. Nos dados preliminares obtidos, não foi possível observar diferenças significativas entre exossomas do plasma do controlo saudável e do paciente estudado. Além do limitado número de indivíduos aqui avaliados, a elevada variabilidade da origem dos exossomas presentes no plasma, dificulta a análise dos exossomas derivados do tumor do paciente, já que cerca de 80% dos exossomas destas amostras são de origem não tumoral. A nossa hipótese é que a utilização do modelo animal de peixe-zebra, possa possibilitar a medição da atividade biológica de exossomas tumorais e auxiliar na localização e detecção precoce do risco de doença metastática em pacientes oncológicos. Além disso, acreditamos que este novo modelo experimental possa servir de complemento aos estudos feitos em modelos murinos, permitindo que se façam estudos utilizando uma quantidade de amostra exossomal significativamente menor por indivíduo.It has been recently shown that the pattern of biodistribution of tumour-derived exosomes in murine models is directly related to the metastatic distribution profile of the same exosome-producing tumour cells. Although very informative, this model requires significant amounts of exosomes for complete in vivo experiments, which is an important limiting factor due to the small quantity of exosomes obtainable from each patient sample. In this work, we tested whether it is possible to use the zebrafish model for in vivo studies of the biological activity of tumour-derived exosomes, through the analysis of their biodistribution. We tested exosomes derived from several tumour cell lines, with different organotropisms and found that these exosomes have a special affinity for the caudal hematopoietic tissue (CHT) of the larvae, which parallels the mammalian bone marrow. Importantly, in mammal animal models, bone marrow cells play a major role in pro-metastatic phenotypes. This large accumulation in the CHT was not detected using exosomes from non-tumour cells, suggesting that this CHT affinity is not based on a mechanical phenomenon. Furthermore, we tested in the zebrafish model whether exosomes are taken up by myeloid cells, like the macrophages, which are frequently involved in the in vivo effects of exosomes and observed that ~15% of the cells that take-up exosomes are from this lineage. Finally, we were able to standardize the injection dose of exosomes derived from tumour cells and plasma of pancreatic cancer patients for in vivo zebrafish biodistribution assays. Our hypothesis is that the use of small scale models, like zebrafish, to perform in vivo studies, can enable the measurement of the biological activity of tumour-derived exosomes and help to localize and detect the risk of metastatic disease in oncologic patients early

Práticas de gestão de projetos em organizações privadas portuguesas

Dissertação de mestrado em Engenharia IndustrialA Gestão de Projetos é uma temática que se tem revelado como algo imprescindível ou até mesmo indispensável para a maioria das organizações. Com uma economia competitiva, e com projetos cada vez mais complexos e exigentes, é importante planear e controlar os mesmos da melhor forma, visto que o número de derrapagens nos prazos e orçamentos é elevado. Para além de uma boa gestão dos orçamentos, durações e recursos, é importante avaliar a aplicabilidade das mais variadas ferramentas e técnicas em todas as fases de um projeto, tais como iniciação, planeamento, execução, monitorização e controlo, e encerramento. Os projetos são únicos e cada organização tem a sua estratégia, pelo que a escolha das ferramentas e técnicas deve ser apropriada e adequada para que se possam obter mais benefícios, e cumprir com os objetivos propostos. Esta investigação visa apresentar quais as práticas mais e menos utilizadas pelas Organizações Privadas Portuguesas, a nível de ferramentas e técnicas de Gestão de Projetos, e identificar as diferenças relacionadas com as características pessoais dos respondentes e com os diferentes contextos organizacionais, nomeadamente dimensão, setor de atividade e posicionamento estratégico.The Project Management is a subject that is shown as something crucial for most organizations. With a competitive economy, and increasingly complex and demanding projects, it is important to plan and control them in the best way, since the number of slippage in the deadlines and budgets is high. In addition to good management of budgets, resources and durations, it is important to evaluate the applicability of various tools and techniques in all phases of a project, such as initiation, planning, execution, monitoring and control, and closure. The designs are unique and each organization has its own strategy, so the choice of tools and techniques must be appropriate and adequate to enable them to get more benefits, and meet those goals. This research aims to present practices which are most and least used by Portuguese Private Organizations, the level of tools and techniques of Project Management, and identify the differences related to the personal characteristics of the respondents and the different organizational contexts, including size, activity sector and strategic positioning

Project management practices in private Portuguese organizations

Organizations are experiencing increasing pressure that is amplified by the current economic crises we are facing, where innovation, cost reduction, resource optimization, quality and customer satisfaction are increasingly even more important issues. Likewise, project management appears as a subject that has been growing over the years helping organizations to meet their goals, through the implementation of their projects, following good practices that are documented in various standards and methodologies. This research focuses on such practices. The goal was to find which are the most used project management tools and techniques in Portuguese Private Organizations and what factors influence their use

Detection and localization of early- and late-stage cancers using platelet RNA

Cancer patients benefit from early tumor detection since treatment outcomes are more favorable for less advanced cancers. Platelets are involved in cancer progression and are considered a promising biosource for cancer detection, as they alter their RNA content upon local and systemic cues. We show that tumor-educated platelet (TEP) RNA-based blood tests enable the detection of 18 cancer types. With 99% specificity in asymptomatic controls, thromboSeq correctly detected the presence of cancer in two-thirds of 1,096 blood samples from stage I–IV cancer patients and in half of 352 stage I–III tumors. Symptomatic controls, including inflammatory and cardiovascular diseases, and benign tumors had increased false-positive test results with an average specificity of 78%. Moreover, thromboSeq determined the tumor site of origin in five different tumor types correctly in over 80% of the cancer patients. These results highlight the potential properties of TEP-derived RNA panels to supplement current approaches for blood-based cancer screening

Circulating platelets as liquid biopsy sources for cancer detection

Nucleic acids and proteins are shed into the bloodstream by tumor cells and can be exploited as biomarkers for the detection of cancer. In addition, cancer detection biomarkers can also be nontumor-derived, having their origin in other organs and cell types. Hence, liquid biopsies provide a source of direct tumor cell-derived biomolecules and indirect nontumor-derived surrogate markers that circulate in body fluids or are taken up by circulating peripheral blood cells. The capacity of platelets to take up proteins and nucleic acids and alter their megakaryocyte-derived transcripts and proteins in response to external signals makes them one of the richest liquid biopsy biosources. Platelets are the second most abundant cell type in peripheral blood and are routinely isolated through well-established and fast methods in clinical diagnostics but their value as a source of cancer biomarkers is relatively recent. Platelets do not have a nucleus but have a functional spliceosome and protein translation machinery, to process RNA transcripts. Platelets emerge as important repositories of potential cancer biomarkers, including several types of RNAs (mRNA, miRNA, circRNA, lncRNA, and mitochondrial RNA) and proteins, and several preclinical studies have highlighted their potential as a liquid biopsy source for detecting various types and stages of cancer. Here, we address the usability of platelets as a liquid biopsy for the detection of cancer. We describe several studies that support the use of platelet biomarkers in cancer diagnostics and discuss what is still lacking for their implementation into the clinic

The Analysis of Platelet-Derived circRNA Repertoire as Potential Diagnostic Biomarker for Non-Small Cell Lung Cancer

Tumor-educated Platelets (TEPs) have emerged as rich biosources of cancer-related RNA profiles in liquid biopsies applicable for cancer detection. Although human blood platelets have been found to be enriched in circular RNA (circRNA), no studies have investigated the potential of circRNA as platelet-derived biomarkers for cancer. In this proof-of-concept study, we examine whether the circRNA signature of blood platelets can be used as a liquid biopsy biomarker for the detection of non-small cell lung cancer (NSCLC). We analyzed the total RNA, extracted from the platelet samples collected from NSCLC patients and asymptomatic individuals, using RNA sequencing (RNA-Seq). Identification and quantification of known and novel circRNAs were performed using the accurate CircRNA finder suite (ACFS), followed by the differential transcript expression analysis using a modified version of our thromboSeq software. Out of 4732 detected circRNAs, we identified 411 circRNAs that are significantly (p-value < 0.05) differentially expressed between asymptomatic individuals and NSCLC patients. Using the false discovery rate (FDR) of 0.05 as cutoff, we selected the nuclear receptor-interacting protein 1 (NRIP1) circRNA (circNRIP1) as a potential biomarker candidate for further validation by reverse transcription–quantitative PCR (RT-qPCR). This analysis was performed on an independent cohort of platelet samples. The RT-qPCR results confirmed the RNA-Seq data analysis, with significant downregulation of circNRIP1 in platelets derived from NSCLC patients. Our findings suggest that circRNAs found in blood platelets may hold diagnostic biomarkers potential for the detection of NSCLC using liquid biopsies.Marie SkłodowskaCurie Grant Agreement No. 765492.Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (Grant #CCA2017-2-16)

Combinatorial Blood Platelets-Derived circRNA and mRNA Signature for Early-Stage Lung Cancer Detection

Despite the diversity of liquid biopsy transcriptomic repertoire, numerous studies often exploit only a single RNA type signature for diagnostic biomarker potential. This frequently results in insufficient sensitivity and specificity necessary to reach diagnostic utility. Combinatorial biomarker approaches may offer a more reliable diagnosis. Here, we investigated the synergistic contributions of circRNA and mRNA signatures derived from blood platelets as biomarkers for lung cancer detection. We developed a comprehensive bioinformatics pipeline permitting an analysis of platelet-circRNA and mRNA derived from non-cancer individuals and lung cancer patients. An optimal selected signature is then used to generate the predictive classification model using machine learning algorithm. Using an individual signature of 21 circRNA and 28 mRNA, the predictive models reached an area under the curve (AUC) of 0.88 and 0.81, respectively. Importantly, combinatorial analysis including both types of RNAs resulted in an 8-target signature (6 mRNA and 2 circRNA), enhancing the differentiation of lung cancer from controls (AUC of 0.92). Additionally, we identified five biomarkers potentially specific for early-stage detection of lung cancer. Our proof-of-concept study presents the first multi-analyte-based approach for the analysis of platelets-derived biomarkers, providing a potential combinatorial diagnostic signature for lung cancer detection

Familial chylomicronemia syndrome in Portugal

Familial chylomicronemia syndrome (FCS) is a rare autosomal recessive disorder of lipoprotein metabolism. It is characterized by marked elevation of triglyceride and chylomicron levels, lipaemic plasma, recurrent pancreatitis, eruptive xanthoma, hepatosplenomegaly, andliapemiaretinalis. All genes associated with FCS (LPL, APOC2, APOA5, LMF1 and GPHBP1) have an effect on the activity of lipoprotein lipase (LPL). The aim of this study is to present all cases with FCS clinical diagnosis, studied in our laboratory.N/

Tumor-educated platelet blood tests for Non-Small Cell Lung Cancer detection and management

Abstract Liquid biopsy approaches offer a promising technology for early and minimally invasive cancer detection. Tumor-educated platelets (TEPs) have emerged as a promising liquid biopsy biosource for the detection of various cancer types. In this study, we processed and analyzed the TEPs collected from 466 Non-small Cell Lung Carcinoma (NSCLC) patients and 410 asymptomatic individuals (controls) using the previously established thromboSeq protocol. We developed a novel particle-swarm optimization machine learning algorithm which enabled the selection of an 881 RNA biomarker panel (AUC 0.88). Herein we propose and validate in an independent cohort of samples (n = 558) two approaches for blood samples testing: one with high sensitivity (95% NSCLC detected) and another with high specificity (94% controls detected). Our data explain how TEP-derived spliced RNAs may serve as a biomarker for minimally-invasive clinical blood tests, complement existing imaging tests, and assist the detection and management of lung cancer patients