Propriétés mécaniques et fonctionnelles des cellules épithéliales respiratoires exposées à une toxine bactérienne : l’adénylate cyclase

The increase in respiratory infections involving virulent factors of bacterial origin has become a major public health issue. A better knowledge of the cell respiratory response in the course of the initial cell invasion by bacterial toxins is important from the pathophysiological and therapeutical point of views.The purpose of this work is to decipher the cellular and molecular mechanisms involved in the exposition of respiratory epithelial cells to the adenylate cyclase toxin (CyaA) produced by Bordetella pertussis which is the whooping cough agent. We have chosen this toxin for its multiple capacities of penetrating a wide range of eukaryotic cells. Indeed, this toxin enables direct translocation of its catalytic domain across the plasma membrane of target cells using the endogen calmoduline to increase the cAMP rate at supraphysiological levels. However, the effects of these changes on mechano-chemical signaling (mechanotransduction) pathways remain largely unknown while it affects cellular functions and cell integrity. So, we perform an evaluation of cellular functions as well as mechanical and adhesion properties of respiratory epithelial cells exposed to CyaA toxin in order to detect some critical modifications in the mechanotransduction processes.In a preliminary study aiming at defining physiopathological concentrations of CyaA toxin used in our experiments, we determined the cell viability degree for 3 concentrations of CyaA toxin (0.5; 5 and 10 nM). We found that the smallest concentration (0.5 nM) did not affect cell viability whereas inducing supraphysiological cAMP levels in less than one hour.Then, we assessed the effects of CyaA toxin on cell migration and repair phenomenon, on ciliary beating and on cell permeability of epithelial cells representative of the different levels of the respiratory tract. The toxin induces a decrease in cell migration and repair, an increase in cell permeability suggesting a weakening of lateral cell-cell junctions.Immunostaining was performed on intracellular and interfacial structures of alveolar epithelial cells exposed to the 3 concentrations of CyaA toxin. Results show that CyaA toxin is able to induce cytoskeleton remodeling and a decrease in the number of focal adhesions. Finally, a refined analysis of mechanical properties and adhesion parameters was performed on the same cells by 2 techniques of micro/nanomanipulation modified to permit at the same time, an evaluation of cell adhesion and cell rigidity (Atomic Force Microscopy with indentation and force spectroscopy to characterize the number of bond during adhesion reinforcement and multiscale Magnetic Twisting Cytometry). To evaluate the role of cAMP on cellular and molecular changes, we tested the enzymatically inactive form of CyaA toxin called CyaAE5 which could not permit to increase the intracellular cAMP rate.The AFM experiments have revealed that the main effect of CyaA toxin is to decrease the number of associated integrin-ligand bounds (meaning an alteration of clustering) while, at the smallest concentration of CyaA toxin, we observe an increase in cell rigidity with an individual bound reinforcement, a result consistent with MTC results. Nevertheless, CyaE5 does not exhibit such cellular effects. On the whole, these results suggest that CyaA toxin affects the mechanotransduction pathways of cells exposed to the toxin, a result which is in agreement with the expected effects of cAMP increase (notably cytoskeleton remodeling, lateral junction alteration and inhibition of Rac1 expression) what brings a new vision of the cytotoxicity induced by the adenylate cyclase toxin.La recrudescence des infections respiratoires impliquant des facteurs virulents d’origine bactérienne est devenue un problème majeur de santé publique. Mieux caractériser la réponse des cellules respiratoires dans la phase initiale d’exposition à des toxines bactériennes est important sur les plans physiopathologiques et thérapeutiques. Le but de ce travail est de décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués lors de l’exposition des cellules épithéliales respiratoires à l’adénylate cyclase (CyaA), une toxine produite par Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche. CyaA a été choisie car elle dispose de multiples moyens qui lui permettent d’envahir un grand nombre de cellules eucaryotes. Elle est notamment capable de transloquer son domaine catalytique directement dans la cellule cible puis d’utiliser la calmoduline endogène pour augmenter le taux d’AMPc à des niveaux supraphysiologiques. Cependant l’effet de ces changements sur la signalisation mécano-chimique (mécanotransduction) a été très peu décrit alors qu’elle affecte les fonctions et l’intégrité cellulaires. Nous proposons donc d’évaluer les fonctions cellulaires et les propriétés mécaniques et d’adhésion des cellules épithéliales respiratoires exposées à CyaA dans le but de déceler des modifications fondamentales dans les processus de mécanotransduction.Nous avons tout d’abord mené une étude préliminaire visant à définir les concentrations physiopathologiques de CyaA utilisées dans nos expériences. Nous avons ainsi déterminé le degré de viabilité cellulaire en fonction de 3 concentrations de CyaA (0.5 ; 5 ; 10 nM), ce qui a montré que la concentration 0.5 nM n’affectait pas la viabilité cellulaire tout en induisant des niveaux supraphysiologiques d’AMPc en moins d’une heure.Nous avons ensuite cherché à évaluer les effets de CyaA sur la migration et la réparation cellulaires, le battement ciliaire et la perméabilité cellulaire de cellules épithéliales représentatives des différents niveaux de l’arbre aérien. CyaA induit une diminution de la migration et de la réparation cellulaires, ainsi qu’une augmentation de la perméabilité cellulaire traduisant un affaiblissement des jonctions latérales.Une étude en immunoflorescence a ensuite été conduite sur les structures intracellulaires et interfaciales des cellules épithéliales alvéolaires exposées aux 3 concentrations de CyaA. Cette étude a montré que CyaA est capable d’induire un remodelage du cytosquelette d’actine ainsi qu’une diminution du nombre des adhérences focales. Enfin, une analyse complète des propriétés mécaniques et des paramètres d’adhésion a été conduite sur les mêmes cellules au moyen de 2 techniques de micro/nanomanipulation revisitées pour permettre à la fois l’évaluation des liens multiples et de la rigidité cellulaire (Microscopie à Force Atomique (AFM) avec indentation et Magnétocytométrie (MTC)). Pour évaluer le rôle de l’AMPc sur les changements observés, les cellules épithéliales respiratoires ont été testées avec la forme active de CyaA et la forme enzymatiquement inactive de la toxine : CyaAE5, qui ne permet pas de synthétiser l’AMPc.Les expériences AFM ont révélé que le principal effet de CyaA est de diminuer le nombre de liens intégrine-ligand associés (une altération du clustering) alors qu’à la plus faible concentration de CyaA, nous observons une augmentation de la rigidité cellulaire, accompagnée d’un renforcement des liens individuels, évolutions confirmées par les résultats MTC. CyaAE5 ne parvient pas à produire ces mêmes effets.L’ensemble des résultats suggère que CyaA affecte de façon précoce la mécanotransduction des cellules exposées et ceci en cohérence avec les effets attendus de l’augmentation d’AMPc (remodelage du CSQ, altération des jonctions latérales, inhibition de l’expression de Rac1), ce qui apporte une nouvelle vision de la cytotoxicité induite par l’adénylate cyclase

Mechanical and functionnal properties of respiratory epithelial cells exposed to a bacterial toxine : the adenylate cyclase

La recrudescence des infections respiratoires impliquant des facteurs virulents d’origine bactérienne est devenue un problème majeur de santé publique. Mieux caractériser la réponse des cellules respiratoires dans la phase initiale d’exposition à des toxines bactériennes est important sur les plans physiopathologiques et thérapeutiques. Le but de ce travail est de décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués lors de l’exposition des cellules épithéliales respiratoires à l’adénylate cyclase (CyaA), une toxine produite par Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche. CyaA a été choisie car elle dispose de multiples moyens qui lui permettent d’envahir un grand nombre de cellules eucaryotes. Elle est notamment capable de transloquer son domaine catalytique directement dans la cellule cible puis d’utiliser la calmoduline endogène pour augmenter le taux d’AMPc à des niveaux supraphysiologiques. Cependant l’effet de ces changements sur la signalisation mécano-chimique (mécanotransduction) a été très peu décrit alors qu’elle affecte les fonctions et l’intégrité cellulaires. Nous proposons donc d’évaluer les fonctions cellulaires et les propriétés mécaniques et d’adhésion des cellules épithéliales respiratoires exposées à CyaA dans le but de déceler des modifications fondamentales dans les processus de mécanotransduction.Nous avons tout d’abord mené une étude préliminaire visant à définir les concentrations physiopathologiques de CyaA utilisées dans nos expériences. Nous avons ainsi déterminé le degré de viabilité cellulaire en fonction de 3 concentrations de CyaA (0.5 ; 5 ; 10 nM), ce qui a montré que la concentration 0.5 nM n’affectait pas la viabilité cellulaire tout en induisant des niveaux supraphysiologiques d’AMPc en moins d’une heure.Nous avons ensuite cherché à évaluer les effets de CyaA sur la migration et la réparation cellulaires, le battement ciliaire et la perméabilité cellulaire de cellules épithéliales représentatives des différents niveaux de l’arbre aérien. CyaA induit une diminution de la migration et de la réparation cellulaires, ainsi qu’une augmentation de la perméabilité cellulaire traduisant un affaiblissement des jonctions latérales.Une étude en immunoflorescence a ensuite été conduite sur les structures intracellulaires et interfaciales des cellules épithéliales alvéolaires exposées aux 3 concentrations de CyaA. Cette étude a montré que CyaA est capable d’induire un remodelage du cytosquelette d’actine ainsi qu’une diminution du nombre des adhérences focales. Enfin, une analyse complète des propriétés mécaniques et des paramètres d’adhésion a été conduite sur les mêmes cellules au moyen de 2 techniques de micro/nanomanipulation revisitées pour permettre à la fois l’évaluation des liens multiples et de la rigidité cellulaire (Microscopie à Force Atomique (AFM) avec indentation et Magnétocytométrie (MTC)). Pour évaluer le rôle de l’AMPc sur les changements observés, les cellules épithéliales respiratoires ont été testées avec la forme active de CyaA et la forme enzymatiquement inactive de la toxine : CyaAE5, qui ne permet pas de synthétiser l’AMPc.Les expériences AFM ont révélé que le principal effet de CyaA est de diminuer le nombre de liens intégrine-ligand associés (une altération du clustering) alors qu’à la plus faible concentration de CyaA, nous observons une augmentation de la rigidité cellulaire, accompagnée d’un renforcement des liens individuels, évolutions confirmées par les résultats MTC. CyaAE5 ne parvient pas à produire ces mêmes effets.L’ensemble des résultats suggère que CyaA affecte de façon précoce la mécanotransduction des cellules exposées et ceci en cohérence avec les effets attendus de l’augmentation d’AMPc (remodelage du CSQ, altération des jonctions latérales, inhibition de l’expression de Rac1), ce qui apporte une nouvelle vision de la cytotoxicité induite par l’adénylate cyclase.The increase in respiratory infections involving virulent factors of bacterial origin has become a major public health issue. A better knowledge of the cell respiratory response in the course of the initial cell invasion by bacterial toxins is important from the pathophysiological and therapeutical point of views.The purpose of this work is to decipher the cellular and molecular mechanisms involved in the exposition of respiratory epithelial cells to the adenylate cyclase toxin (CyaA) produced by Bordetella pertussis which is the whooping cough agent. We have chosen this toxin for its multiple capacities of penetrating a wide range of eukaryotic cells. Indeed, this toxin enables direct translocation of its catalytic domain across the plasma membrane of target cells using the endogen calmoduline to increase the cAMP rate at supraphysiological levels. However, the effects of these changes on mechano-chemical signaling (mechanotransduction) pathways remain largely unknown while it affects cellular functions and cell integrity. So, we perform an evaluation of cellular functions as well as mechanical and adhesion properties of respiratory epithelial cells exposed to CyaA toxin in order to detect some critical modifications in the mechanotransduction processes.In a preliminary study aiming at defining physiopathological concentrations of CyaA toxin used in our experiments, we determined the cell viability degree for 3 concentrations of CyaA toxin (0.5; 5 and 10 nM). We found that the smallest concentration (0.5 nM) did not affect cell viability whereas inducing supraphysiological cAMP levels in less than one hour.Then, we assessed the effects of CyaA toxin on cell migration and repair phenomenon, on ciliary beating and on cell permeability of epithelial cells representative of the different levels of the respiratory tract. The toxin induces a decrease in cell migration and repair, an increase in cell permeability suggesting a weakening of lateral cell-cell junctions.Immunostaining was performed on intracellular and interfacial structures of alveolar epithelial cells exposed to the 3 concentrations of CyaA toxin. Results show that CyaA toxin is able to induce cytoskeleton remodeling and a decrease in the number of focal adhesions. Finally, a refined analysis of mechanical properties and adhesion parameters was performed on the same cells by 2 techniques of micro/nanomanipulation modified to permit at the same time, an evaluation of cell adhesion and cell rigidity (Atomic Force Microscopy with indentation and force spectroscopy to characterize the number of bond during adhesion reinforcement and multiscale Magnetic Twisting Cytometry). To evaluate the role of cAMP on cellular and molecular changes, we tested the enzymatically inactive form of CyaA toxin called CyaAE5 which could not permit to increase the intracellular cAMP rate.The AFM experiments have revealed that the main effect of CyaA toxin is to decrease the number of associated integrin-ligand bounds (meaning an alteration of clustering) while, at the smallest concentration of CyaA toxin, we observe an increase in cell rigidity with an individual bound reinforcement, a result consistent with MTC results. Nevertheless, CyaE5 does not exhibit such cellular effects. On the whole, these results suggest that CyaA toxin affects the mechanotransduction pathways of cells exposed to the toxin, a result which is in agreement with the expected effects of cAMP increase (notably cytoskeleton remodeling, lateral junction alteration and inhibition of Rac1 expression) what brings a new vision of the cytotoxicity induced by the adenylate cyclase toxin

High resolution microfluidic assay and probabilistic modeling reveal cooperation between T cells in tumor killing

International audienceCytotoxic T cells are important components of natural anti-tumor immunity and are harnessed in tumor immunotherapies. Immune responses to tumors and immune therapy outcomes largely vary among individuals, but very few studies examine the contribution of intrinsic behavior of the T cells to this heterogeneity. Here we show the development of a microfluidic-based in vitro method to track the outcome of antigen-specific T cell activity on many individual cancer spheroids simultaneously at high spatiotemporal resolution, which we call Multiscale Immuno-Oncology on-Chip System (MIOCS). By combining parallel measurements of T cell behaviors and tumor fates with probabilistic modeling, we establish that the first recruited T cells initiate a positive feedback loop to accelerate further recruitment to the spheroid. We also provide evidence that cooperation between T cells on the spheroid during the killing phase facilitates tumor destruction. Thus, we propose that both T cell accumulation and killing function rely on collective behaviors rather than simply reflecting the sum of individual T cell activities, and the possibility to track many replicates of immune cell-tumor interactions with the level of detail our system provides may contribute to our understanding of immune response heterogeneity

Functional and structural consequences of epithelial cell invasion by Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin

International audienceBordetella pertussis, the causative agent of whopping cough, produces an adenylate cyclase toxin (CyaA) that plays a key role in the host colonization by targeting innate immune cells which express CD11b/CD18, the cellular receptor of CyaA. CyaA is also able to invade non-phagocytic cells, via a unique entry pathway consisting in a direct translocation of its catalytic domain across the cytoplasmic membrane of the cells. Within the cells, CyaA is activated by calmodulin to produce high levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and alter cellular physiology. In this study, we explored the effects of CyaA toxin on the cellular and molecular structure remodeling of A549 alveolar epithelial cells. Using classical imaging techniques, biochemical and functional tests, as well as advanced cell mechanics method, we quantify the structural and functional consequences of the massive increase of intracellular cyclic AMP induced by the toxin: cell shape rounding associated to adhesion weakening process, actin structure remodeling for the cortical and dense components, increase in cytoskeleton stiffness, and inhibition of migration and repair. We also show that, at low concentrations (0.5 nM), CyaA could significantly impair the migration and wound healing capacities of the intoxicated alveolar epithelial cells. As such concentrations might be reached locally during B. pertussis infection, our results suggest that the CyaA, beyond its major role in disabling innate immune cells, might also contribute to the local alteration of the epithelial barrier of the respiratory tract, a hallmark of pertussis

Perfluorocarbon induces alveolar epithelial cell response through structural and mechanical remodeling

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FcRn-Dependent Transcytosis of Monoclonal Antibody in Human Nasal Epithelial Cells In Vitro: A Prerequisite for a New Delivery Route for Therapy?

Monoclonal antibodies (mAbs) are promising therapies to treat airway chronic inflammatory disease (asthma or nasal polyps). To date, no study has specifically assessed, in vitro, the potential function of neonatal Fc receptor (FcRn) in IgG transcytosis through the human nasal airway epithelium. The objective of this study was to report the in vitro expression and function of FcRn in nasal human epithelium. FcRn expression was studied in an air–liquid interface (ALI) primary culture model of human nasal epithelial cells (HNEC) from polyps. FcRn expression was characterized by quantitative RT-PCR, western blot, and immunolabeling. The ability of HNECs to support mAb transcytosis via FcRn was assessed by transcytosis assay. This study demonstrates the expression of FcRn mRNA and protein in HNEC. We report a high expression of FcRn in the cytosol of ciliated, mucus, and basal cells by immunohistochemistry with a higher level of FcRn proteins in differentiated HNEC. We also proved in vitro transepithelial delivery of an IgG1 therapeutic mAb with a dose–response curve. This is the first time that FcRn expression and mAb transcytosis has been shown in a model of human nasal respiratory epithelium in vitro. This study is a prerequisite for FcRn-dependent nasal administration of mAbs

Pathogenesis of chronic rhinosinusitis with nasal polyps: role of IL-6 in airway epithelial cell dysfunction

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