Denial of Reward in the Neonate Shapes Sociability and Serotonergic Activity in the Adult Rat

BACKGROUND: Manipulations of the early environment are linked to long-lasting alterations of emotionality and social capabilities. Denial of rewarding mother-pup interactions in early life of rats could serve as model for child neglect. Negative consequences for social competence in later life, accompanied by changes in the serotonergic system would be expected. In contrast, rewarding mother-pup contact should promote adequate social abilities. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Male Wistar rats trained in a T-maze during postnatal days 10-13 under denial (DER) or permission (RER) of maternal contact were tested for play behavior in adolescence and for coping with defeat in adulthood. We estimated serotonin (5-HT) levels in the brain under basal conditions and following defeat, as well as serotonin receptor 1A (5-HT1A) and serotonin transporter (SERT) expression. DER rats exhibited increased aggressive-like play behavior in adolescence (i.e. increased nape attacks, p<0.0001) and selected a proactive coping style during defeat in adulthood (higher sum of proactive behaviors: number of attacks, flights, rearings and defensive upright posture; p = 0.011, p<0.05 vs RER, non-handled-NH). In adulthood, they had lower 5-HT levels in both the prefrontal cortex (p<0.05 vs RER) and the amygdala (p<0.05 vs NH), increased 5-HT levels following defeat (PFC p<0.0001) and decreased serotonin turnover (amygdala p = 0.008). The number of 5-HT1A immunopositive cells in the CA1 hippocampal area was increased (p<0.05 DER, vs RER, NH); SERT levels in the amygdala were elevated (p<0.05 vs RER, NH), but were lower in the prefrontal cortex (p<0.05 vs NH). CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: Denial of expected maternal reward early in life negatively affects sociability and the serotonergic system in a complex manner. We propose that our animal model could contribute to the identification of the neurobiological correlates of early neglect effects on social behavior and coping with challenges, but also in parallel with the effects of a rewarding early-life environment

Επίδραση πρώιμων στρεσσογόνων εμπειριών στον αναπτυσσόμενο και ενήλικο εγκέφαλο του επίμυ

Early experiences affect brain development and thus adult brain function and behavior. Based on the aforementioned we developed an novel animal model of early life experiences in which during postnatal days 10–13 (PND 10–13) rat pups were exposed to a T-maze, one arm of which lead to the mother. One group of animals was allowed contact with the mother (rewarded—receiving expected reward (RER)), whereas the other was denied the expected reward (DER). The general aim of the present study was the investigation of the effects of our neonatal model in the developing and adult rat brain.The serotonergic system is known as an important modulator of coping ability and, in general, emotional balance in both normal and pathological states, such as depression and anxiety, for which females are more vulnerable. Since experiences during critical periods, such as the neonatal and adolescence, play a critical role in determining adult stress-coping behavior we designed anexperimental protocol, which included a neonatal experience and a social stress during adolescence. Thus in the present work we used female rats and determined 5-HT, 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA), and 5-hydroxytryptamine receptor type 1A (5-HT1A), as well as its transporter (5-HTT) levels in the prefrontal cortex (PFC) and the amygdala (AMY). Our study revealed that in both the PFC and AMY, adult RER animals had higher basal 5-HT levels. Furthermore, in the AMY of this group of animals, higher levels of 5-HT1A receptors were detected by Western blot analysis. In adulthood rats were exposed to the Forced Swimming Test/Stress (FST/S). RER animals not exposed to the adolescent stress exhibited longer immobility time (an index of “depressive-like” behavior or of a passive coping strategy) during both the first and second day of FST. Corticosterone levels following the FST fell faster in the DER animals. Adolescent stress affected the responses to the adult FSS only in the DER animals, which had decreased 5-HT in the AMY and increased immobility time on both days of the FST, compared with the DER not stressed in adolescence. The phenotype of the DER animals is in line with the “match-mismatch” hypothesis, which states that if two events during critical periods of life “match” in being mildly stressful, their interaction can be adaptive.Exposure to the DER experience for the first time, on postnatal day 10 (PND10), was stressful for the pups, as assessed by increased corticosterone levels, and was accompanied by enhanced activation of the amygdala, as assessed by c-Fos immunohistochemistry. Re-exposure to the same experience on days 11-13 led to adaptation. Corticosterone levels of the RER pups did not differ on the first and last days of training (PND10 and 13 respectively), while on PND11 and 12 they were lower than those of the CTR. The RER experience did not lead to activation of the amygdala. Females exposed as neonates to the DER or RER experience, and controls were tested as adults in the open field task (OF), the elevated plus maze (EPM), the novel object recognition test (NOR) and cued and contextual fear conditioning (FC). No group differences were found in the EPM, while in the OF, female DER animals, showed increased rearings, compared to the controls. In the FC, the RER had increased memory for context fear compared to the CTR.Although early experiences affect laterality of the mature brain, there are no reports on their immediate neurochemical effects during neonatal life, which could provide evidence as to the mechanisms leading to the lateralized brain. In order to address this issue, we determined the differential protein expression profile of the left and right hippocampus of 13-day-old rat control (CTR) pups, as well as following exposure to an early experience involving either receipt (RER) or denial (DER) of the expected reward of maternal contact. Proteomic analysis was performed by 2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by mass spectroscopy. The majority of proteins found to be differentially expressed either between the three experimental groups (DER, RER, CTR) or between the left and right hemisphere were cytoskeletal (34%), enzymes of energy metabolism (32%), and heat shock proteins (17%). In all three groups more proteins were up-regulated in the left compared to the right hippocampus. Tubulins were found to be most often up-regulated, always in the left hippocampus. The differential expression of b-tubulin, b-actin, dihydropyrimidinase like protein 1, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Heat Shock protein 70 revealed by the proteomic analysis was in general confirmed by Western blots. Exposure to the early experience affected brain asymmetry: In the RER pups the ratio of proteins up-regulated in the left hippocampus to those in the right was 1.8, while the respective ratio was 3.6 in the CTR and 3.4 in the DER. Our results could contribute to the elucidation of the cellular mechanisms mediating the effects of early experiences on the vulnerability for psychopathology, since proteins shown in our study to be differentially expressed (e.g. tubulins, dihydropyrimidinase like proteins, 14-3-3 protein, GFAP, ATP synthase, a-internexin) have also been identified in proteomic analyses of post-mortem brains from psychiatric patients.Οι πρώιμες εμπειρίες είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την ανάπτυξη του εγκεφάλου και κατ’επέκταση τη μετέπειτα συμπεριφορά και λειτουργία του ενήλικου οργανισμού. Βασιζόμενοι στα παραπάνω αναπτύξαμε ένα μοντέλο πρώιμων εμπειριών όπου κατά τη 10η ως τη 13η μεταγεννητική ημέρα, νεογνά επίμυων εκτίθενται σε ένα λαβύρινθο σχήματος Τ και εκπαιδεύονται είτε σε συνθήκες συνεχόμενης ματαίωσης [παρεμπόδιση επαφής με τη μητέρα (που βρίσκεται στο άκρο ενός από τους δύο βραχίονες του λαβύρινθου) στο τέλος κάθε δοκιμασίας- denied the expected reward (DER)] είτε σε συνθήκες συνεχόμενης ενίσχυσης [(επαφή με τη μητέρα στο τέλος κάθε δοκιμασίας- (receiving expected reward (RER)]. Ο γενικός στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης των δύο αυτών πρώιμων εμπειριών τόσο στον αναπτυσσόμενο όσο και στον ενήλικο εγκέφαλο των επίμυων μέσα από μια σειρά πειραματικών διαδικασιών.Το σεροτονεργικό σύστημα κατέχει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της συμπεριφοράς (ικανότητα αντιμετώπισης ποικίλων καταστάσεων) ιδιαίτερα δε του συναισθήματος τόσο υπό φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις όπως είναι π.χ. η κατάθλιψη, ασθένεια για την οποία οι θηλυκοί οργανισμοί είναι περισσότερο ευάλωτοι. Η νεογνική και εφηβική ηλικία, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην μετέπειτα απάντηση-συμπεριφορά του ενηλίκου οργανισμού σε καταστάσεις στρες. Έτσι χρησιμοποιώντας ένα καινούριο πειραματικό πρωτόκολλο, το οποίο περιελάμβανε την έκθεση στις πρώιμες εμπειρίες του μοντέλου μας καθώς και την έκθεση στο εφηβικό στρες της κοινωνικής απομόνωσης, προσδιορίσαμε τα επίπεδα της σεροτονίνης 5-HT, του μεταβολίτη της (5-ΗΙΑΑ) καθώς επίσης και τα επίπεδα του υποδοχέα 5-ΗΤ1Α και μεταφορέα της (5-HTT) στον ιππόκαμπο, στην αμυγδαλή και στον προμετωπιαίο φλοιό. Υπό βασικές συνθήκες δείχτηκε ότι τα ενήλικα RER ζώα είχαν υψηλότερα επίπεδα 5-ΗΤ στον προμετωπιαίο φλοιό και στην αμυγδαλή. Ακόμη, μέσω της ανοσοαποτύπωσης κατά Western (Western blot) βρέθηκε ότι η ομάδα των RER ζώων είχε υψηλότερα επίπεδα υποδοχέα 5-ΗΤ1Α στην περιοχή της αμυγδαλής. Κατά την ενήλικη ζωή τα ζώα εκτέθηκαν και στη δοκιμασία-στρες της εξαναγκασμένης κολύμβησης [Forced Swimming Test/Stress (FST/S)]. Η ομάδα των RER ενήλικων ζώων που δεν εκτέθηκαν στο εφηβικό στρες της κοινωνικής απομόνωσης παρουσίασαν υψηλότερους χρόνους ακινησίας (δείκτης καταθλιπτικόμορφης συμπεριφοράς ή παθητικής στρατηγικής) στη δοκιμασία της εξαναγκασμένης κολύμβησης (κατά την 1η και 2η μέρα της δοκιμασίας). Η ομάδα των DER ζώων εμφάνισε μια πιο «σωστή» επαγόμενη από το στρες, απάντηση της κορτικοστερόνης, επιδεικνύοντας μια πιο γρήγορη πτώση των επιπέδων της μετά από την έκθεση στο στρες της εξαναγκασμένης κολύμβησης. Μόνο η ομάδα των DER πειραματόζωων επηρεάστηκε από το εφηβικό στρες παρουσιάζοντας μειωμένα επίπεδα 5-HT στην αμυγδαλή και αυξημένους χρόνους ακινησίας (κατά την 1η και 2η μέρα της εξαναγκασμένης κολύμβησης), σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα των DER ζώων που δεν εκτέθηκαν κατά την εφηβεία στο στρες της κοινωνικής απομόνωσης. Ο φαινότυπος των DER ζώων βρίσκεται σε συμφωνία με την υπόθεση «ταιριάσματος- μη ταιριάσματος», κατά την οποία αν δύο εμπειρίες κατά τη διάρκεια των κρίσιμων περιόδων της ζωής «ταιριάζουν» μεταξύ τους, υπό την έννοια του να χαρακτηρίζονται ως σχετικά ήπιες και όχι έντονα στρεσογόνες, τότε η αλληλεπίδρασή τους μπορεί να προσδίδει στον οργανισμό μια αυξημένη ικανότητα προσαρμογής απέναντι σε στρεσογόνες καταστάσεις.Η πρώτη έκθεση των νεογνών στην νεογνική DER εμπειρία (10η μεταγεννητική μέρα) οδήγησε στην αύξηση των επιπέδων της κορτικοστερόνης τους και συνοδεύτηκε από αυξημένη ενεργοποίηση της αμυγδαλής τους (ανοσοϊστοχημική μελέτη για το αντιγόνο c-Fos, 10η μεταγεννητική ημέρα). Ωστόσο, αυτά τα υψηλά επίπεδα κορτικοστερόνης που εμφάνισαν τα DER νεογνά επίμυων τη 10η μεταγεννητική ημέρα δε διατηρήθηκαν κατά τις επόμενες μεταγεννητικές μέρες της εκπαίδευσης, γεγονός που υποδηλώνει προσαρμογή του συστήματος μετά την πρώτη έκθεσή τους σε αυτή την εμπειρία. Όχι μόνο στα DER, αλλά και στα RER νεογνά επίμυος τα επίπεδα της κορτικοστερόνης κατά τις μεταγεννητικές μέρες 11 και 12 ήταν χαμηλότερα σε σχέση με αυτά της ομάδας ελέγχου. Ως ενήλικοι οι θηλυκοί DER επίμυς επέδειξαν αυξημένους αριθμούς ορθώσεων στα πίσω άκρα (rearings), σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου στη δοκιμασία του ανοικτού πεδίου (ΟP-Open Field) . Στους ενήλικους θηλυκούς επίμυς η εμπειρία της νεογνικής εκπαίδευσης δεν είχε ως αποτέλεσμα κάποια στατιστικά σημαντική αλλαγή στα βασικά επίπεδα της κορτικοστερόνης μεταξύ των τριών πειραματικών ομάδων (CTR, DER, RER) ούτε και μετά τη δοκιμασία της εξαρτημένης μάθησης φόβου. Όσον αφορά τη συμπεριφορά, οι θηλυκοί CTR επίμυς είχαν χαμηλότερους χρόνους παγώματος σε σύγκριση με τους χρόνους παγώματος που παρουσίασε η ομάδα των RER θηλυκών (δοκιμασία της ανάκλησης βάσει πλαισίου του εξαρτημένου φόβου) και δεν παρουσίασαν καμία στατιστικά σημαντική διαφορά στη συμπεριφορά «παγώματος» κατά τη διάρκεια των 5 δοκιμασιών στη δοκιμασία της ανάκλησης βάσει στοιχείων του εξαρτημένου φόβου.Αν και η πρώιμες εμπειρίες φαίνεται να επηρεάζουν την ασυμμετρία του ώριμου εγκεφάλου, δεν υπάρχουν βιβλιογραφικές αναφορές που να αφορούν στις άμεσες νευροχημικές επιπτώσεις τους κατά τη νεογνική ηλικία. Για το σκοπό αυτό, προσδιορίσαμε κάνοντας χρήση πρωτεωμικής ανάλυσης, τα διαφορετικά προφίλ πρωτεϊνικής έκφρασης του αριστερού και δεξιού ιππόκαμπου σε νεογνά επίμυων ηλικίας 13 ημερών που είχαν υποστεί την νεογνική εμπειρία της εκπαίδευσης υπό συνεχόμενη ματαίωση (DER) ή ανταμοιβή (RER), αλλά και της ομάδας ελέγχου (CTR).Οι πρωτεΐνες των οποίων τα επίπεδα έκφρασης διέφεραν είτε μεταξύ των τριών πειραματικών ομάδων (DER, RER, CTR) είτε μεταξύ του δεξιού και του αριστερού ιπποκάμπου ανήκουν κατά κύριο λόγο σε τρεις μεγάλες λειτουργικές ομάδες πρωτεϊνών: κυτταροσκελετικές (34%), πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον διάμεσο μεταβολισμό (32%) και στην αποτοξίνωση στις οποίες περιλαμβάνονται οι πρωτεϊνες-συνοδοί και οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ (17%). Και στις τρεις πειραματικές μας ομάδες βρέθηκε ότι περισσότερες πρωτεΐνες υπερεκφράζονταν στον αριστερό ιππόκαμπο σε σχέση με το δεξιό. Οι περισσότερες διαφορές που αναδείχτηκαν μέσα από την πρωτεωμική ανάλυση και αφορούσαν τα επίπεδα έκφρασης της β-τουμπουλίνης (β-tubulin), της β-ακτίνης (β-actin), της ινώδους όξινης πρωτεΐνης της γλοίας (GFAP), της ομοιάζουσας με τη διυδροπυριμιδινάση-1 πρωτεΐνης (dihydropyrimidinase like protein 1, DRP1) και της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 (heatshock protein 70, HSP70) επιβεβαιώθηκαν και μέσα από τα πειράματα της ανοσοαποτύπωσης κατά Western. Φαίνεται πως η έκθεση σε μια πρώιμη εμπειρία επηρέασε την ασυμμετρία του εγκεφάλου: Στην ομάδα των RER νεογνών επίμυων ο λόγος των υπερεκφραζόμενων πρωτεϊνών στον αριστερό σε σχέση με τον δεξιό ιππόκαμπο ήταν περίπου στο μισό (18/10 = 1.8) του λόγου που εμφάνισαν η ομάδα των CTR (ο αντίστοιχος λόγος ήταν 3.6) και η ομάδα των DER (3.4 αντιστοίχως). Τα αποτελέσματα μας ίσως να μπορούν να συνεισφέρουν στη προσπάθεια διαλεύκανσης των κυτταρικών μηχανισμών που διαμεσολαβούν τις επιπτώσεις των πρώιμων εμπειριών στην ευαλωτότητα για την εμφάνιση κάποιας ψυχοπαθολογίας, μιας και τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης κάποιων πρωτεϊνών που παρουσιάζονται στην εν λόγω μελέτη (παραδείγματος χάρη τουμπουλίνες, πρωτεΐνες ομοιάζουσες με τις διυδροπυριμιδινάσες, πρωτεΐνη 14-3-3, ινώδης όξινη πρωτεΐνη της γλοίας ,συνθάση του ATP,α-ιντερνεξίνη) έχουν επίσης ταυτοποιηθεί σε πρωτεωμικές αναλύσεις από νεκροτομικό υλικό (εγκέφαλοι) ατόμων που πάσχουν από κάποιο ψυχιατρικό νόσημα

Effects of an early experience of reward through maternal contact or its denial on laterality of protein expression in the developing rat hippocampus.

Laterality is a basic characteristic of the brain which is detectable early in life. Although early experiences affect laterality of the mature brain, there are no reports on their immediate neurochemical effects during neonatal life, which could provide evidence as to the mechanisms leading to the lateralized brain. In order to address this issue, we determined the differential protein expression profile of the left and right hippocampus of 13-day-old rat control (CTR) pups, as well as following exposure to an early experience involving either receipt (RER) or denial (DER) of the expected reward of maternal contact. Proteomic analysis was performed by 2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by mass spectroscopy. The majority of proteins found to be differentially expressed either between the three experimental groups (DER, RER, CTR) or between the left and right hemisphere were cytoskeletal (34%), enzymes of energy metabolism (32%), and heat shock proteins (17%). In all three groups more proteins were up-regulated in the left compared to the right hippocampus. Tubulins were found to be most often up-regulated, always in the left hippocampus. The differential expression of β-tubulin, β-actin, dihydropyrimidinase like protein 1, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Heat Shock protein 70 revealed by the proteomic analysis was in general confirmed by Western blots. Exposure to the early experience affected brain asymmetry: In the RER pups the ratio of proteins up-regulated in the left hippocampus to those in the right was 1.8, while the respective ratio was 3.6 in the CTR and 3.4 in the DER. Our results could contribute to the elucidation of the cellular mechanisms mediating the effects of early experiences on the vulnerability for psychopathology, since proteins shown in our study to be differentially expressed (e.g. tubulins, dihydropyrimidinase like proteins, 14-3-3 protein, GFAP, ATP synthase, α-internexin) have also been identified in proteomic analyses of post-mortem brains from psychiatric patients

Effect of different early life experiences on basal and stress induced (resident-intruder test) levels of serotonin (5HT) and the ratio, 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA)/5-HT, as a measure of serotonin turnover in the prefrontal cortex (A) and amygdala (B).

<p>Bars represent means ± S.E.M of amount of monoamines (ng) per mg of tissue. Post-hoc tests on two-way ANOVA, #, p<0.05 DER, RER≠NH at basal condition; *, p<0.05, RER≠DER, post-hoc, §, p<0.05, Basal≠Resident-Intruder, one-way ANOVA.</p

Effect of different early life experiences on proactive-aggressive (A) and on reactive (passive-submissive) (B) behaviors during the defeat phase (10 min) of the resident-intruder test in adulthood.

<p>A. Bars on the left part of the graph depict means ± S.E.M. of the number of attacks, flight escapes, rearings during defeat, as well as means ± S.E.M. of total number of the sum of proactive behaviors. Bars on the right part of the graph (separated by a dashed line) represent means ± S.E.M. of duration of upright defensive behavior. B. Bars on the graph depict means ± S.E.M. of duration of anogenital sniffing, full submission and freezing during defeat, as well as means ± S.E.M. of total duration of the sum of submissive behaviors. #, p<0.05, DER, RER≠NH; *, p<0.05, RER≠DER, post-hoc, one-way ANOVA.</p

Effect of different early life experiences on 5HT1A receptor protein levels in the hippocampus of adult rats, as depicted by immunohistochemistry.

<p>A. Bars represent means ± SEM of immunopositive cells (average of 3 optical fields per area in each sample, n = 6 samples per group). #, p<0.05, DER, RER≠NH; *, p<0.05, RER≠DER, post-hoc, one-way ANOVA. B. Photomicrographs depicting results of immunohistochemistry. Arrows point to immunopositive cells representative of those included in the counting. Scale bar: 50 µM.</p

Behaviors during resident-intruder test.

<p>Adapted from Gardner et al, 2005 <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0033793#pone.0033793-Gardner1" target="_blank">[97]</a>.</p

Effect of different early life experience (DER vs RER) in comparison to no experience (NH) during the neonatal period on play-fighting behavior in adolescence.

<p>Data in the left part of the graph are means ± S.E.M. of number of nape attacks, pinning and supine behaviors and on the right means ± S.E.M. of duration of general exploration during the 10 min of interaction. #, p<0.05, DER,RER≠NH; *, p<0.05, RER≠DER, post-hoc, one-way ANOVA.</p

Deciphering the Contributions of CRH Receptors in the Brain and Pituitary to Stress-Induced Inhibition of the Reproductive Axis

Based on pharmacological studies, corticotropin-releasing hormone (CRH) and its receptors play a leading role in the inhibition of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis during acute stress. To further study the effects of CRH receptor signaling on the HPG axis, we generated and/or employed male mice lacking CRH receptor type 1 (CRHR1) or type 2 (CRHR2) in gonadotropin-releasing hormone neurons, GABAergic neurons, or in all central neurons and glia. The deletion of CRHRs revealed a preserved decrease of plasma luteinizing hormone (LH) in response to either psychophysical or immunological stress. However, under basal conditions, central infusion of CRH into mice lacking CRHR1 in all central neurons and glia, or application of CRH to pituitary cultures from mice lacking CRHR2, failed to suppress LH release, unlike in controls. Our results, taken together with those of the earlier pharmacological studies, suggest that inhibition of the male HPG axis during acute stress is mediated by other factors along with CRH, and that CRH suppresses the HPG axis at the central and pituitary levels via CRHR1 and CRHR2, respectively

Proteins (10) with higher levels in the Right Hippocampus (RH) compared to those in the Left Hippocampus (LH) of the RER.

<p>Proteins (10) with higher levels in the Right Hippocampus (RH) compared to those in the Left Hippocampus (LH) of the RER.</p