Estudo do perfil de metilação do gene MMP14 em linhagens tumorais de mama

Orientadora : Profª Drª Giseli KlassenDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica. Defesa: Curitiba, 18/11/2014Inclui referênciasResumo: As metástases são um grande problema para pacientes com câncer de mama, chegando a ser a causa de 90% dos casos de morte desta neoplasia. A proteína matriz metaloprotease 14 (MMP-14) tem uma importante contribuição no desencadeamento da migração celular nos carcinomas mamários, pela sua atividade proteolítica, e também pela ativação de outras metaloproteases solúveis capazes de degradar componentes da matriz extracelular. Sabe-se que a regulação do gene MMP14 está intimamente relacionada com aspectos epigenéticos, através da metilação de uma ilha de CpG localizada na região promotora. Estudos têm demonstrado que o padrão de metilação ao longo do corpo do gene também pode apresentar um importante papel na regulação da transcrição gênica e, para tanto, o objetivo deste estudo foi verificar o papel da metilação do corpo do gene MMP14 na regulação da expressão em diferentes linhagens tumorais de mama. As linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 e MCF-7 foram avaliadas quanto a expressão do gene estudado por RT-PCR e RT-qPCR. Duas regiões que continham ilhas de CpG, uma localizada na região promotora (-161 a +186) e outra no primeiro íntron do corpo do gene (+242 a +869), foram amplificadas e sequenciadas após o tratamento com bissulfito de sódio. Os resultados obtidos mostraram que as linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2 e PMC42 expressam o gene MMP14 e que suas taxas de metilação global, de ambas as ilhas de CpG avaliadas, não passam de 15%. Por outro lado, a linhagem MCF7 foi a única que não expressou o gene MMP14, e apresentou taxas de metilação global que ultrapassam 75%, em ambas as ilhas de CpG. Assim, mostrou-se uma correlação entre a ausência de expressão e alta metilação da ilha de CpG não só da região promotora, mas também da localizada no primeiro íntron. Estes resultados também permitiram a identificação de regiões diferencialmente metiladas nas linhagens de mama para padronização da técnica de MSP-PCR. A linhagem MCF7, quando submetida ao tratamento com os compostos desmetilantes (DAC) e inibidores desacetilantes de histona (TSA), passou a expressar o gene MMP14 e reduziu suas taxas de metilação global, indicando uma estreita relação entre epigenética e regulação deste gene incluindo a região intrônica. Nas regiões desmetiladas pelos tratamentos, foi possível identificar um sítio de ligação do fator de transcrição GLI3, que pode estar auxiliando na expressão de MMP14. Concluímos que a metilação da ilha de CpG localizada no íntron do gene MMP14 parece estar atuando cooperativamente com a região promotora para promover ou silenciar a transcrição do gene. Estudos de metilação no corpo do gene são recentes e, portanto, novos dados podem contribuir para entender a importância da metilação dessas regiões de DNA nos mecanismos de tumorigênese. Palavras-chave: Câncer de mama. MMP-14. Ilha de CpG intrônica. Metilação.Abstract: Metastasis is a major problem for patients with breast cancer, being the cause of 90% of deaths from this neoplasia. The protein matrix metalloprotease 14 (MMP-14) has a major contribution in the initiation of cell migration in breast carcinomas, due to its proteolytic activity, and also by the activation of other soluble metalloproteases capable of degrading components of the extracellular matrix. It is known that the regulation of the MMP14 gene is closely related to epigenetic events by methylation of a CpG island located in the promoter region. Studies have shown that the methylation pattern along the body of the gene may also have a role in regulating gene transcription and, therefore, the aim of this study was to investigate the role of methylation in the body of MMP14 in regulating the expression of this gene in different breast tumor cell lines. The expression of the gene was evaluated by RT-PCR and RT-qPCR in the HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 and MCF-7 cell lines. Two regions containing CpG islands, one located in the promoter (-161 to +186), and another region in the first intron of the gene body (+242 to +869), were amplified and sequenced after treatment with sodium bisulfite. The results showed that the HB4aC3.6, HB4aC5.2 and PMC42 lines expressed MMP14 and their rates of global methylation of both CpG islands was no more than 15%. On the other hand, the MCF7 line was the only one that did not express the MMP14 gene and presented global methylation rates exceeding 75% in both CpG islands. This showed a correlation between the absence of high expression and methylation of the CpG island not only of the promoter region but also of the first intron. These results also allowed the identification of different methylated regions in breast cancer cell lines for the standardization of MSP-PCR. The MCF7 line, when subjected to treatment with the demethylating compound (DAC) and the inhbitors of histone deacethylating compund (TSA), expressed MMP14 and reduced its rates of global methylation, indicating a close relationship between epigenetics and regulation of this gene including the intronic region. In regions demethylated by the treatment it was possible to identify a binding site of the transcription factor GLI3, which may be promoting the expression of MMP14. We conclude that methylation of the CpG island located in the intron of the MMP14 gene seems to be working cooperatively with the promoter region to permit or silence the transcription of the gene. Studies of methylation in the body of the gene are new, and, therefore, new data can contribute to understand the importance of DNA methylation of these regions in the mechanisms of tumorigenesis. Keywords: Breast cancer. MMP-14. Intronic CpG island. Methylation

Utilização da técnica MSA-PCR para caracterizações de regiões de DNA diferencialmente metilados em pacientes com Rinite Alérgica

Orientador: Karin Braun-PradoMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : A metilação de ilhas CpG do DNA é uma importante forma de regular a expressão de genes, podendo, inclusive, colaborar com o aparecimento de doenças multifatoriais, como a rinite alérgica. Por se tratar de uma doença complexa (causas genéticas, epigenéticas e ambientais), a rinite alérgica não tem ainda um completo entendimento sobre seu funcionamento e nem formas eficazes de minimizar os efeitos colaterais de seus tratamentos, de maneira que projetos que contribuam para uma melhor compreensão da mesma são necessários. Uma das formas de caracterização do perfil de metilação é através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase realizado com Iniciadores Aleatórios Sensíveis à Metilação (MSAPPCR). Esta técnica permite a diferenciação entre padrões de metilação presentes em controles sadios e em pacientes com rinite alérgica através uma análise global do genoma. Previamente nosso grupo no laboratório de Epigenética da UFPR identificou polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) no lócus IL4-IL13 e dando continuidade ao estudo caso-controle na rinite alérgica foi utilizada a técnica de MSAP-PCR. Para padronização, inicialmente foram utilizadas amostras de DNA obtidas a partir de 20 ml de sangue periférico de oito indivíduos, quatro considerados controles e quatro considerados casos (com rinite). Após a obtenção do DNA através da técnica de fenol/clorofórmio, utilizou-se 0,8 µg de DNA para restrição enzimática com cada uma das enzimas: MspI e HpaII (isoesquizômero de MspI, sensível a metilação). Em seguida foram realizadas PCR para amplificação dos genes MLH1 e P53 para verificar a eficácia da digestão e a integridade do DNA digerido, respectivamente. Após essa etapa, procedeu-se a execução da técnica de MSAP-PCR com o uso do par de primers MGF0/MGF2 e do primer simples MLG2. Para visualização das amplificações foram realizadas corridas eletroforéticas a 200V em géis de poliacrilamida 8% por 4 horas à 4°C. Após padronização das quantidades de enzimas de restrição, tempos e temperaturas de anelamento nas PCRs, concentração de poliacrilamida e tempos de corrida nos géis, foi observada a presença de uma banda de DNA de aproximadamente 350pb, obtida na PCR com o par de primers MGF0/MGF2, metilada em duas das amostras dos DNAs controles (50%) e ausente em 100% das amostras dos DNAs dos pacientes. O fragmento de DNA encontrado na amostra controle foi purificado do gel de agarose e clonado no vetor pGEMTeasy. Os clones recombinantes foram coletados e o fragmento foi sequenciado e identificado como a proteína com os domínios PDZ/LIM. Esta proteína apresenta características de sinalização intracelular, o que poderia influenciar na formação preferencial de linfócitos Th2, promovendo as reações inflamatórias exacerbadas nos pacientes com rinite alérgica analisados

Liraglutida como um novo agente desmetilante de DNA e seu potencial como adjuvante na terapia do câncer de mama

Orientadora: Profa. Dra. Giseli KlassenCoorientadora: Profa. Dra Edneia A. S. R. CavalieriTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 27/11/2018Inclui referências: p.93-125Resumo: O câncer de mama e o diabetes são doenças com incidências crescentes em todo o mundo e compartilham entre si não só os fatores de risco mas também as vias de ativação molecular. Sabe-se que os análogos do GLP-1, fármacos utilizados no tratamento da diabetes mellitus tipo 2 (DM2) demonstraram inibição na proliferação celular em diferentes linhagens tumorais. A proposta deste trabalho foi avaliar os mecanismos moleculares da droga análoga de GLP-1, denominada liraglutida, e seus efeitos sobre o crescimento celular, migração, expressão gênica e metilação do DNA, utilizando linhagens tumorais de mama e um modelo tumoral de mama em camundongos. Os resultados mostraram que a liraglutida foi capaz de reduzir o crescimento, migração celular e formação de colônias em linhagens tumorais de mama, incluindo as linhagens mais agressivas, do tipo triplo negativas (TNG). Ao mesmo tempo, se observou o restabelecimento da expressão gênica por desmetilação da região promotora de genes como CDH1, ADAM33, ESR1 e PGR e o aumento na expressão proteica de E-caderina e ADAM33. O aumento na desmetilação, e consequente aumento na expressão genica, se deu a partir da inibição direta das enzimas DNMTs, reduzindo suas atividades e gerando uma desmetilação global do genoma nas linhagens tumorais. Os testes in vivo mostraram um papel terapêutico da liraglutida uma vez que foi capaz de diminuir significativamente o tamanho dos tumores de Ehrlich em camundongos, permitindo inclusive a redução do uso de quimioterapia sem a perda da eficácia do tratamento. A redução do volume tumoral ocorreu provavelmente pelo aumento na expressão do gene VEGF, que contribuiu para estimular necrose tumoral, e pela desmetilação dos genes CDH1 e ADAM33. Além disso, foi possível evidenciar a expressão da proteína ADAM33 nos tecidos tumorais. Esses resultados demonstraram pela primeira vez que a liraglutida é um potencial fármaco adjuvante na terapia do câncer de mama, incluindo o do tipo TNG, implicado em alterações epigenéticas em células de câncer de mamaAbstract: Breast cancer and diabetes are diseases with increasing incidence worldwide and shared risk factors and molecular pathways. In view of this, the GLP-1 analogs are very attractive drugs in the treatment of type 2 diabetes mellitus (DM2) that demonstrate cellular proliferation inhibition in different tumor lines. The aim of this work was study the analog GLP-1 liraglutide molecular mechanisms, through the cell growth, migration, gene expression and DNA methylation, in breast tumors cell lines and a breast tumor in mice. The results showed that liraglutide was able to reduce growth, colony formation and cell migration in breast cancer cell lines, including the most aggressive, the triplenegative type (TNBC). In parallel, was observed of re-establishment of gene expression by demethylation of the promoter region of genes such as CDH1, ADAM33, ESR1 and PGR and increase in protein E-cadherin and ADAM33. The increase in demethylation, and consequent increase in the genetic expression, was originated from the direct DNMTs inhibition, generating global DNA demethylation in breast cell lines. In vivo analysis was showed a therapeutic role for liraglutide that has been able to decrease the Ehrlich tumors size in mice, even allowing the chemotherapy reduction, without loss of treatment efficacy. Tumor volume reduction occurred probably by increasing VEGF gene expression, which contributed to tumor necrosis, and by the demethylation of CDH1 and ADAM33 genes. In addition, it was possible to evidence an expression of the ADAM33 protein. The results demonstrated that liraglutide is a potential adjuvant drug in breast cancer therapy, including TNBC, implicated in epigenetic changes in breast cancer cell

Supplemental Material, DS1_VET_10.1177_0300985818763711 - DNA Methylation Status of the Estrogen Receptor α Gene in Canine Mammary Tumors

<p>Supplemental Material, DS1_VET_10.1177_0300985818763711 for DNA Methylation Status of the Estrogen Receptor α Gene in Canine Mammary Tumors by Yara de Oliveira Brandão, Mariana Busato Toledo, Andressa Chequin, Thierry Grima Cristo, Renato Silva Sousa, Edneia Amancio Souza Ramos, and Giseli Klassen in Veterinary Pathology</p

Fibronectin affects transient MMP2 gene expression through DNA demethylation changes in non-invasive breast cancer cell lines.

Metastasis accounts for more than 90% of cancer deaths. Cells from primary solid tumors may invade adjacent tissues and migrate to distant sites where they establish new colonies. The tumor microenvironment is now recognized as an important participant in the signaling that induces cancer cell migration. An essential process for metastasis is extracellular matrix (ECM) degradation by metalloproteases (MMPs), which allows tumor cells to invade local tissues and to reach blood vessels. The members of this protein family include gelatinase A, or MMP-2, which is responsible for the degradation of type IV collagen, the most abundant component of the basal membrane, that separates epithelial cells in the stroma. It is known that fibronectin is capable of promoting the expression of MMP-2 in MCF7 breast cancer cells in culture. In addition, it was already shown that the MMP2 gene expression is regulated by epigenetic mechanisms. In this work, we showed that fibronectin was able to induce MMP2 expression by 30% decrease in its promoter methylation. In addition, a histone marker for an open chromatin conformation was significantly increased. These results indicate a new role for fibronectin in the communication between cancer cells and the ECM, promoting epigenetic modifications

Epigenetic changes in the <i>MMP2</i> gene promoter in MCF7 cells.

<p>A: Sequencing of the <i>MMP2</i> gene promoter. Closed and open circles represent methylated or unmethylated CpGs, respectively. On the left the number represent the sequenced clones. The 49 analyzed CpGs in the <i>MMP2</i> promoter region are shown. Mock cells are at the top, above is 5-Aza-treated, hereafter FN-treated, recultured (MCF7 FN-treated and then cultured for 48 hours without fibronectin). The global methylation percentage is also shown at the right. B: Graphical analysis of CpG methylation pattern in the <i>MMP2</i> promoter gene. The percentages of CpGs that were methylated in MCF7 mock (blue), MCF7 FN-treated (red) and MCF7 recultured (green) were shown. C: ChIP quantitative PCR analysis. Ct values were normalized between target and endogenous control (<i>MMP2</i>/<i>GAPDH</i>) and the results of mock (blue), FN-treated (red) and recultured (green) cells are shown. At the bottom the samples are separated according to the antibody used in the immunoprecipitation. Statistical comparison was performed using Student’s <i>t</i> Test. *<i>p</i><0.05.</p

<i>MMP2</i> expression after treatment in breast cancer cell lines.

<p>A: The expression of <i>MMP2</i> after treatments in MCF7 cells was shown. Mock (blue); 5-Aza-treated (white), FN-treated (red) and recultured (green). Results were expressed as mean S.E.M. and statistical comparison was performed using <i>t test</i> analysis. *<i>p</i><0.05 when compared to mock; #<i>p</i><0.05 when FN-treated compared to recultured. B: The expression of <i>MMP2</i> in MDA-MB-436 cells, mock and after FN treatment were shown. Mock (blue) and FN-treated (orange) were expressed as mean S.E.M. and statistical comparison was performed using Student’s <i>t</i> Test. **<i>p</i><0.05 when compared to mock.</p

Wound healing assay in MCF7 cells.

<p>A<b>:</b> Representative images from mock and FN-treated cells were shown. The scratched cells in a line had images obtained under un inverted optical microscopy (20X). B<b>:</b> The graphic represents % of wound-closure after 60 h in culture. Statistical comparison was performed using Student’s <i>t</i> Test. *<i>p</i><0.05.</p