Mikrobiota spontano fermentiranih kobasica od mesa divljači

In the present study, the microbiota of three wild boar (WB1, WB2, WB3) and three deer meat (DS1, DS2, DS3) sausage types was characterised, with focus on lactic acid bacteria. The sausage samples were collected in triplicates (n=105) from each of the sausage producers at day zero (0), after 4, 7, 10, 20 days and at the end of the ripening period (20 or 40 days). Dominant LAB isolates collected from sausages were identified as Le. mesenteroides (n=259), Lb. sakei (n=190) and E. casseliflavus (n=106). However, high throughput amplicon sequencing revealed lactobacilli, mainly Lb. sakei and Lb. curvatus, as the predominant species, with 20.55 % of sequences at the beginning of fermentation and 70.48 % in mature sausages. It seems that the isolation of LAB on selective media favored the growth of Le. mesenteroides, since its predominance was also observed in the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of bulk colonies collected from De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) plates, indicating insufficient selectivity of the used media. On the other hand, HTS can also be biased due to DNA isolation (cell lysis) and polymerase chain reaction (PCR) analysis, which can favour certain microbial population. Regarding bacterial diversity during sausage production, the number of operational taxonomic units (OTUs) was highest at day 0 and day 4, followed by a decrease toward the later phases of fermentation and ripening, which might be explained by the decrease of pH and available water for microbial growth (aw). Measured alpha diversity parameters (Shannon's index and Pielou evenness) were significantly higher in wild boar meat sausages compared to deer meat at day 4 (p<0.01) and day 7 (p<0.05), which might be linked to a different lifestyles, type of diet and feeding habits of wild boar and deer. With fermentation time, the abundance of undesired and potentially harmful microbiota decreased indicating the microbial stability and safety of final products. However, 33 % of ready-to-eat sausages can be considered as inappropriate for human consumption, due to the elevated cell counts of Enterobacteriaceae (DS2, WB3) as well as E. coli, coliforms and presumptive B. cereus (WB3). To select strains suitable to be used as indigenous starter cultures, 1326 LAB isolates were collected from sausages. Isolates were grouped based on their rep-PCR patterns, and 57 representatives were selected and screened for safety issues and technological potential, as well as probiotic potential. Around half of the tested representatives (56.14 %) was safe for application in food, of which 53.12 % showed good acidification activity (pH<4) and variable other technological traits. Based on the results of safety and technological characterization, 2 Lb. sakei strains (MRS_296 and C_7d_13) were selected and applied simultaneously in meat batter as indigenous starter cultures. Although respective strains were originally grouped in the same cluster, they exhibited different technological traits. The majority (86.49 %) of isolates recovered from inoculated batch had rep-PCR patterns that corresponded to the patterns of respective starter cultures, suggesting that applied strains were able to establish themselves from day zero and prevailed through the production. However, considering that rep-PCR patterns of MRS_296 and C_7d_13 were not possible to differentiate, it is not possible to say whether both strains survived, or only a single one, and if, which one. It seems that the inoculation of native starter cultures suppressed the growth of Enterobacteriaceae, coliforms and L. monocyogenes. The pH values were significantly lower throughout the production in the inoculated batch (p<0.05) than in control. The tyramine content was 67.18 % lower in the ready-to-eat inoculated batch compared to the control. Such results suggest the efficiency of applied starter cultures as well as highlighting their potential of its use in future.Trajne, spontano fermentirane kobasice od mesa divljači se proizvode na malim obiteljskim gospodarstvima, prateći tradicionalne recepture i postupke. Zbog toga su prepoznate i cijenjene kao autohtoni, odnosno, tradicionalni proizvodi specifičnih senzornih osobina. Međutim, budući da se proizvode bez upotrebe starter kultura i to često u varijabilnim uvjetima, fermentacija ovisi o metaboličkoj aktivnosti prirodno prisutnih populacija bakterija mliječne kiseline (BMK) te stoga mikrobiološka sigurnost krajnjeg proizvoda može biti kompromitirana. Također, na mikrobiološku (zdravstvenu) sigurnost gotovih kobasica od mesa divljači utječu mnogi faktori povezani s načinom odstrijela divljači i daljnje obrade mesa. Da bi se osigurala potrebna kvaliteta gotovih proizvoda, potrebno je u potpunosti kontrolirati čitav proizvodni proces, a jedan od načina je upotreba detaljno karakteriziranih starter kultura u njihovoj proizvodnji. Budući da komercijalne starter kulture nisu jednako efikasne u svim tipovima proizvoda, tendencija je aplikacija autohtonih startera, a upravo spontano fermentirani proizvodi koji nisu termički obrađeni predstavljaju izvor velikog broja različitih bakterijskih sojeva, naročito BMK. Dok je mikrobiota mnogih drugih tradicionalnih fermentiranih proizvoda detaljno istražena i karakterizirana, dostupna literatura o takvim saznanjima o kobasicama od mesa divljači je vrlo limitirana. Stoga je prvi korak ovog istraživanja bio karakterizirati prirodno prisutnu mikrobiotu ovakvih kobasica, te nakon toga prikupiti i detaljno karakterizirati sojeve BMK s ciljem selekcije onih bakterijskih sojeva prikladnih za daljnje korištenje kao starter kultura. Mikrobna raznolikost tri tipa kobasica od mesa divlje svinja (WB1, WB2, WB3) i tri od mesa jelena (DS1, DS2, DS3) je istražena koristeći metode ovisne i neovisne o uzgoju. Uzorci kobasica su prikupljeni u triplikatima tijekom različitih faza proizvodnje (n=105). Izdvajanjem BMK na selektivnim mikrobiološkim medijima tijekom različitih faza zrenja I fermentacije (0, 4, 7, 10, 20 ili/i 40 dana) te molekularno-biološkom identifikacijom prikupljenih izolata, Leuconostoc mesenteroides je prepoznat kao dominanta vrsta BMK (28,24 %), a sljedili su ga Lactobacillus sakei (20,72 %) i Enterococcus casseliflavus (11,55 %). Le. mesenteroides je izoliran i identificiran u velikoj mjeri na LamVab (52,31 %) i De Man, Rogosa i Sharpe agaru (MRS) (40,89 %) mikrobiološkim podlogama, od kojih se naročito LamVab smatra selektivnima za laktobacile, što upućuje na zaključak da su navedeni mediji favorizirali rast leukonostoka. Ovaj zaključak podupiru rezultati analize DNA u denaturirajućem gradijentnom gelu poliakrilamida (DGGE) konzorcija prikupljenih sa MRS medija, budući da su potvrdili dominaciju Le. mesenteroides na ovom mediju. Osim za izdvajanje i prikupljanje BMK, različiti selektivni mediji su korišteni za detekciju i određivanje vijabilnog broja (cfu/g) ostalih ciljanih mikrobnih skupina, uključujući mikrobiotu kvarenja i potecijalne patogene. Ovakav je pristup omogućio procjenu mikrobiološke ispravnosti gotovih kobasica, budući da su propisani referentni intervali temeljeni na uzgoju i određivanju broja naraslih kolonija. Utvrđeno je da ukupno 33,33 % kobasica predstavljaju rizik za konzumaciju zbog povećanog broja bakterija porodice Enterobacteriaceae (DS2, WB3), kao i E. coli, koliformnih bakterija i hemolitičkih bakterija iz grupe B. cereus (WB3). S druge strane, analizom podataka dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije (engl. next generation sequencing; NGS) koristeći Miseq platformu (Illumina), dobivena je šira slika o zastupljenosti različitih mikobnih zajednica, budući da je izdvojena i analizirana ukupna bakterijska DNA prisutna u kobasicama, dakle, analiza nije ograničena samo na ciljane mikrobne skupine. Općenito, najveća mikrobna raznolikost je zabilježena u samom početku proizvodnje kobasica (0. i 4. dan) nakon čega opada prema kasnijim fazama fermentacije i zrenja. Zabilježeni pad raznolikosti se može objasniti kao rezultat pada pH vrijednosti, smanjenja dostupne vode za rast bakterija (aw) i antagonizmom prirodno prisutnih BMK. Iako je općenito raznolikost ostala ujednačena kod oba tipa kobasica kada su uspoređeni isti vremenski intervali, Shannonov index i ujednačenost po Pielou su ukazali na veću razinu raznolikosti bakterijskih populacija u 4. i 7. danu kod kobasica od mesa divlje svinje (WB) nego kod kobasica od mesa jelena (DS), što je vjerojatno povezano s različitim načinom života i prehrane ovih životinja. Zajedno s trendom pada ukupne bakterijske raznolikosti tijekom fermentacije i zrenja, zabilježen je i pad neželjenih mikroorganizama, s iznimkom bakterija iz roda Stenotrophomonas i Pseudomonas čiji pad nije zabilježen. Ova je metodologija također omogućila detaljniji uvid u strukturu prisutnih zajednica BMK, pri čemu su primijećena neslaganja s rezultatima dobivenima klasičnim metodama (ovisnima o uzgoju). Analizom NGS podataka vrste roda Lactobacillus su identificirane kao dominantne, i to vrste Lb. sakei (40,32 %), Lb. curvatus (40,29 %) i Lb. plantarum (1,31 %), dok su ostale BMK detektirane u malom broju. Iako se sekvenciranje sljedeće generacije pokazalo kao pouzdan pristup za in situ karakterizaciju mikrobiote prisutne u trajnim kobasicama od divljači, izolacija i prikupljanje BMK na selektivnim podlogama je nužna za prikupljanje kolekcije vijabilnih sojeva. U ovom istraživanju je prikupljeno ukupno 917 izolata na mikrobiološkim medijima selektivnima za BMK. Međutim, BMK su također prikupljene i iz drugih trajnih tradicionalnih kobasica od mesa divlje svinje i jelena te su uključene u ovo istraživanje, tako da je ukupno prikupljeno 1326 izolata. Svi izolati su identificirani koristeći molekularno-biološke metode (rod i vrsta specifični PCR, sekvenciranje po Sangeru) te su genotipizirani pomoću rep-PCR metode koristeći GTG5 početnicu. Obrasci dobiveni repPCR metodom su pokazali visoku razlučivost između sojeva i omogućili njihovo grupiranje. Izabrano je 57 reprezentativnih sojeva koji su uključeni u daljnje analize s ciljem selekcije odgovarajućih starter kultura. Prvenstveno, istražena je sigurnost njihove upotrebe u hrani (rezistencija na antibiotike, prisutstvo gena koji kodiraju za biogene amine i virulente faktore, hemolitička aktivnost) te su istražene njihove tehnološke karakteristike (sposobnost brze acidifikacije, lipolitička, proteolitička i peptidazna aktivnost) kao i antimikrobna aktivnost. Među reprezentativnim predstavnicima, izabrano je 19 bakterijskih sojeva za koje je istražena sposobnost preživljavanja u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog (GI) trakta. Rezultati su pokazali da je približno polovica reprezentativnih predstavnika (56,14 %) sigurna za primjenu u hrani, od kojih je 53,12 % pokazalo dobru sposobnost acidifikacije, odnosno, snizili su pH mesnog medija s početnih pH=5.8 na pH< 4 nakon 24 sata inkubacije. Velika većina reprezentativnih predstavnika koji su smatrani sigurnima je pokazala lipoličku (96.87 %) i proteolitičku aktivnost na mediju s obranim mlijekom (93.75 %), međutim samo je njih 9.37 % pokazalo sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina. Njihova je peptidazna aktivnost varirala između 203.50±0.00 i 5942.20±0.14 µM pNA. Iako je većina reprezentativnih predstavnika (n=57) u vijabilnom obliku pokazala antagonističku (antimikrobnu) aktivnost prema testiranim indikatorskim bakterijama, kada je testiranje provedeno korištenjem njihovih neutraliziranih supernatanata (slobodnih od bakterijskih stanica), antimikrobna aktivnost je zabilježena za 4 soja i to prema Listeria innocua ATCC 33090. Ovakav rezultat indicira da spomenuti sojevi mogu imati sposobnost produkcije bakteriocina. Jedan je soj (E. durans A_4d_1) pokazao sposobnost preživljavanja u simuliranih uvjetima GI trakta, naročito u uvjetima tankog crijeva koji su bili pogubni za ostale sojeve, zbog čega se može smatrati potencijalnim probiotičkim sojem. Temeljem rezultata sigurnosne i tehnološke karakterizacije, 2 soja Lb. sakei (MRS_296 and C_7d_13) su odabrana za primjenu u kobasicama kao starter kulture. Ovi sojevi se smatraju sigurnima za primjenu u hrani, budući da nisu bili hemolitički aktivni, nisu pokazali rezistenciju prema testiranim antibioticima te nije detektirano prisutstvo gena koji kodiraju za produkciju biogenih amina. Iako su ova dva soja originalno bila grupirana u isti klaster, pokazali su različite tehnološke karakteristike. MRS_296 je pokazao brzu sposobnost acidifikacije mesnog supstrata, što je najvažniji preduvjet svake starter kulture. Iako niti jedan od izabranih sojeva nije pokazao sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina, kod MRS_296 je detektirana proteolitička aktivnost na mediju s obranim mlijekom. Soj C_7d_13, nije pokazao dobru sposobnost acidifikacije, ali je pokazao zadovoljavajuću lipolitičku i peptidaznu aktivnost, svojstva koja su nedostajala kod MRS_296. Oba soja su pokazala antimikrobno djelovanje prema velikom broju testiranih bakterija. Izabrane autohtone starter kulture su dodane u mesnu smjesu za pripremu kobasica (15 kg) s brojem vijabilnih stanica od 9,34 og cfu/g (MRS_296) i 9,30 log cfu/g (C_7d_13) dok je neinokulirana smjesa služila kao kontrola. Kako bi se pratilo preživljavanje dodanih startera u kobasicama, izolati su izdvojeni na medijima selektivnima za BMK, prikupljeni i genotipizirani pomoću rep-PCR reakcije. Rep-PCR metodom je bilo moguće usporediti obrasce dodanih startera s obrascima prikupljenih sojeva, odnosno, bilo je moguće na ovaj način pratiti preživljavanje starter kultura. Velika većina sojeva (86,49 %) izoliranih iz kobasica s dodanim starterima je imala rep-PCR obrasce koji odgovaraju obrascima dodanih startera, što pokazuje da su dodani starteri preživjeli tijekom čitavog procesa proizvodnje kobasica. Međutim, budući da nije moguće razlikovati rep-PCR obrasce između MRS_296 i C_7d_13, nije moguće zaključiti da li su oba soja preživjela. Rezultati potpune mikrobiološke analize ukazuju na efikasnost primjenjenih starter kultura, odnosno, pokazuju da je primjenom startera kontroliran rast enterobakterija, koliformnih bakterija i L. monocyogenes kod inokulirane grupe (šarže), u kojoj su pH vrijednost i koncentracija tiramina bili značajno (p<0,05) niži, u odnosu na neinokuliranu kontrolu. Ovo istraživanje pruža uvid u in situ raznolikost i brojnost prirodno prisutnih mikrobnih populacija kobasica od mesa divljači, što doprinosi kompletnijem razumijevanju sastava i dinamike mikroorganizama kod ovakvog tipa proizvoda. Kao jedan od ključnih koraka za NGS, optimizirana je izolacija DNA iz uzoraka kobasica te je etablirana zbirka definiranih sojeva koji imaju potencijal za buduću uporabu kao starter i/ili bioprotektivne kulture. Također, kroz ovo istraživanje dobivena je efikasna starter kultura koja se sastoji od dva autohtona soja Lb. sakei, a koja se može primijeniti za proizvodnju visoko kvalitetnih kobasica od mesa divljači u tradicionalnoj ili industrijskoj proizvodnji

Mikrobiota spontano fermentiranih kobasica od mesa divljači

In the present study, the microbiota of three wild boar (WB1, WB2, WB3) and three deer meat (DS1, DS2, DS3) sausage types was characterised, with focus on lactic acid bacteria. The sausage samples were collected in triplicates (n=105) from each of the sausage producers at day zero (0), after 4, 7, 10, 20 days and at the end of the ripening period (20 or 40 days). Dominant LAB isolates collected from sausages were identified as Le. mesenteroides (n=259), Lb. sakei (n=190) and E. casseliflavus (n=106). However, high throughput amplicon sequencing revealed lactobacilli, mainly Lb. sakei and Lb. curvatus, as the predominant species, with 20.55 % of sequences at the beginning of fermentation and 70.48 % in mature sausages. It seems that the isolation of LAB on selective media favored the growth of Le. mesenteroides, since its predominance was also observed in the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of bulk colonies collected from De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) plates, indicating insufficient selectivity of the used media. On the other hand, HTS can also be biased due to DNA isolation (cell lysis) and polymerase chain reaction (PCR) analysis, which can favour certain microbial population. Regarding bacterial diversity during sausage production, the number of operational taxonomic units (OTUs) was highest at day 0 and day 4, followed by a decrease toward the later phases of fermentation and ripening, which might be explained by the decrease of pH and available water for microbial growth (aw). Measured alpha diversity parameters (Shannon's index and Pielou evenness) were significantly higher in wild boar meat sausages compared to deer meat at day 4 (p<0.01) and day 7 (p<0.05), which might be linked to a different lifestyles, type of diet and feeding habits of wild boar and deer. With fermentation time, the abundance of undesired and potentially harmful microbiota decreased indicating the microbial stability and safety of final products. However, 33 % of ready-to-eat sausages can be considered as inappropriate for human consumption, due to the elevated cell counts of Enterobacteriaceae (DS2, WB3) as well as E. coli, coliforms and presumptive B. cereus (WB3). To select strains suitable to be used as indigenous starter cultures, 1326 LAB isolates were collected from sausages. Isolates were grouped based on their rep-PCR patterns, and 57 representatives were selected and screened for safety issues and technological potential, as well as probiotic potential. Around half of the tested representatives (56.14 %) was safe for application in food, of which 53.12 % showed good acidification activity (pH<4) and variable other technological traits. Based on the results of safety and technological characterization, 2 Lb. sakei strains (MRS_296 and C_7d_13) were selected and applied simultaneously in meat batter as indigenous starter cultures. Although respective strains were originally grouped in the same cluster, they exhibited different technological traits. The majority (86.49 %) of isolates recovered from inoculated batch had rep-PCR patterns that corresponded to the patterns of respective starter cultures, suggesting that applied strains were able to establish themselves from day zero and prevailed through the production. However, considering that rep-PCR patterns of MRS_296 and C_7d_13 were not possible to differentiate, it is not possible to say whether both strains survived, or only a single one, and if, which one. It seems that the inoculation of native starter cultures suppressed the growth of Enterobacteriaceae, coliforms and L. monocyogenes. The pH values were significantly lower throughout the production in the inoculated batch (p<0.05) than in control. The tyramine content was 67.18 % lower in the ready-to-eat inoculated batch compared to the control. Such results suggest the efficiency of applied starter cultures as well as highlighting their potential of its use in future.Trajne, spontano fermentirane kobasice od mesa divljači se proizvode na malim obiteljskim gospodarstvima, prateći tradicionalne recepture i postupke. Zbog toga su prepoznate i cijenjene kao autohtoni, odnosno, tradicionalni proizvodi specifičnih senzornih osobina. Međutim, budući da se proizvode bez upotrebe starter kultura i to često u varijabilnim uvjetima, fermentacija ovisi o metaboličkoj aktivnosti prirodno prisutnih populacija bakterija mliječne kiseline (BMK) te stoga mikrobiološka sigurnost krajnjeg proizvoda može biti kompromitirana. Također, na mikrobiološku (zdravstvenu) sigurnost gotovih kobasica od mesa divljači utječu mnogi faktori povezani s načinom odstrijela divljači i daljnje obrade mesa. Da bi se osigurala potrebna kvaliteta gotovih proizvoda, potrebno je u potpunosti kontrolirati čitav proizvodni proces, a jedan od načina je upotreba detaljno karakteriziranih starter kultura u njihovoj proizvodnji. Budući da komercijalne starter kulture nisu jednako efikasne u svim tipovima proizvoda, tendencija je aplikacija autohtonih startera, a upravo spontano fermentirani proizvodi koji nisu termički obrađeni predstavljaju izvor velikog broja različitih bakterijskih sojeva, naročito BMK. Dok je mikrobiota mnogih drugih tradicionalnih fermentiranih proizvoda detaljno istražena i karakterizirana, dostupna literatura o takvim saznanjima o kobasicama od mesa divljači je vrlo limitirana. Stoga je prvi korak ovog istraživanja bio karakterizirati prirodno prisutnu mikrobiotu ovakvih kobasica, te nakon toga prikupiti i detaljno karakterizirati sojeve BMK s ciljem selekcije onih bakterijskih sojeva prikladnih za daljnje korištenje kao starter kultura. Mikrobna raznolikost tri tipa kobasica od mesa divlje svinja (WB1, WB2, WB3) i tri od mesa jelena (DS1, DS2, DS3) je istražena koristeći metode ovisne i neovisne o uzgoju. Uzorci kobasica su prikupljeni u triplikatima tijekom različitih faza proizvodnje (n=105). Izdvajanjem BMK na selektivnim mikrobiološkim medijima tijekom različitih faza zrenja I fermentacije (0, 4, 7, 10, 20 ili/i 40 dana) te molekularno-biološkom identifikacijom prikupljenih izolata, Leuconostoc mesenteroides je prepoznat kao dominanta vrsta BMK (28,24 %), a sljedili su ga Lactobacillus sakei (20,72 %) i Enterococcus casseliflavus (11,55 %). Le. mesenteroides je izoliran i identificiran u velikoj mjeri na LamVab (52,31 %) i De Man, Rogosa i Sharpe agaru (MRS) (40,89 %) mikrobiološkim podlogama, od kojih se naročito LamVab smatra selektivnima za laktobacile, što upućuje na zaključak da su navedeni mediji favorizirali rast leukonostoka. Ovaj zaključak podupiru rezultati analize DNA u denaturirajućem gradijentnom gelu poliakrilamida (DGGE) konzorcija prikupljenih sa MRS medija, budući da su potvrdili dominaciju Le. mesenteroides na ovom mediju. Osim za izdvajanje i prikupljanje BMK, različiti selektivni mediji su korišteni za detekciju i određivanje vijabilnog broja (cfu/g) ostalih ciljanih mikrobnih skupina, uključujući mikrobiotu kvarenja i potecijalne patogene. Ovakav je pristup omogućio procjenu mikrobiološke ispravnosti gotovih kobasica, budući da su propisani referentni intervali temeljeni na uzgoju i određivanju broja naraslih kolonija. Utvrđeno je da ukupno 33,33 % kobasica predstavljaju rizik za konzumaciju zbog povećanog broja bakterija porodice Enterobacteriaceae (DS2, WB3), kao i E. coli, koliformnih bakterija i hemolitičkih bakterija iz grupe B. cereus (WB3). S druge strane, analizom podataka dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije (engl. next generation sequencing; NGS) koristeći Miseq platformu (Illumina), dobivena je šira slika o zastupljenosti različitih mikobnih zajednica, budući da je izdvojena i analizirana ukupna bakterijska DNA prisutna u kobasicama, dakle, analiza nije ograničena samo na ciljane mikrobne skupine. Općenito, najveća mikrobna raznolikost je zabilježena u samom početku proizvodnje kobasica (0. i 4. dan) nakon čega opada prema kasnijim fazama fermentacije i zrenja. Zabilježeni pad raznolikosti se može objasniti kao rezultat pada pH vrijednosti, smanjenja dostupne vode za rast bakterija (aw) i antagonizmom prirodno prisutnih BMK. Iako je općenito raznolikost ostala ujednačena kod oba tipa kobasica kada su uspoređeni isti vremenski intervali, Shannonov index i ujednačenost po Pielou su ukazali na veću razinu raznolikosti bakterijskih populacija u 4. i 7. danu kod kobasica od mesa divlje svinje (WB) nego kod kobasica od mesa jelena (DS), što je vjerojatno povezano s različitim načinom života i prehrane ovih životinja. Zajedno s trendom pada ukupne bakterijske raznolikosti tijekom fermentacije i zrenja, zabilježen je i pad neželjenih mikroorganizama, s iznimkom bakterija iz roda Stenotrophomonas i Pseudomonas čiji pad nije zabilježen. Ova je metodologija također omogućila detaljniji uvid u strukturu prisutnih zajednica BMK, pri čemu su primijećena neslaganja s rezultatima dobivenima klasičnim metodama (ovisnima o uzgoju). Analizom NGS podataka vrste roda Lactobacillus su identificirane kao dominantne, i to vrste Lb. sakei (40,32 %), Lb. curvatus (40,29 %) i Lb. plantarum (1,31 %), dok su ostale BMK detektirane u malom broju. Iako se sekvenciranje sljedeće generacije pokazalo kao pouzdan pristup za in situ karakterizaciju mikrobiote prisutne u trajnim kobasicama od divljači, izolacija i prikupljanje BMK na selektivnim podlogama je nužna za prikupljanje kolekcije vijabilnih sojeva. U ovom istraživanju je prikupljeno ukupno 917 izolata na mikrobiološkim medijima selektivnima za BMK. Međutim, BMK su također prikupljene i iz drugih trajnih tradicionalnih kobasica od mesa divlje svinje i jelena te su uključene u ovo istraživanje, tako da je ukupno prikupljeno 1326 izolata. Svi izolati su identificirani koristeći molekularno-biološke metode (rod i vrsta specifični PCR, sekvenciranje po Sangeru) te su genotipizirani pomoću rep-PCR metode koristeći GTG5 početnicu. Obrasci dobiveni repPCR metodom su pokazali visoku razlučivost između sojeva i omogućili njihovo grupiranje. Izabrano je 57 reprezentativnih sojeva koji su uključeni u daljnje analize s ciljem selekcije odgovarajućih starter kultura. Prvenstveno, istražena je sigurnost njihove upotrebe u hrani (rezistencija na antibiotike, prisutstvo gena koji kodiraju za biogene amine i virulente faktore, hemolitička aktivnost) te su istražene njihove tehnološke karakteristike (sposobnost brze acidifikacije, lipolitička, proteolitička i peptidazna aktivnost) kao i antimikrobna aktivnost. Među reprezentativnim predstavnicima, izabrano je 19 bakterijskih sojeva za koje je istražena sposobnost preživljavanja u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog (GI) trakta. Rezultati su pokazali da je približno polovica reprezentativnih predstavnika (56,14 %) sigurna za primjenu u hrani, od kojih je 53,12 % pokazalo dobru sposobnost acidifikacije, odnosno, snizili su pH mesnog medija s početnih pH=5.8 na pH< 4 nakon 24 sata inkubacije. Velika većina reprezentativnih predstavnika koji su smatrani sigurnima je pokazala lipoličku (96.87 %) i proteolitičku aktivnost na mediju s obranim mlijekom (93.75 %), međutim samo je njih 9.37 % pokazalo sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina. Njihova je peptidazna aktivnost varirala između 203.50±0.00 i 5942.20±0.14 µM pNA. Iako je većina reprezentativnih predstavnika (n=57) u vijabilnom obliku pokazala antagonističku (antimikrobnu) aktivnost prema testiranim indikatorskim bakterijama, kada je testiranje provedeno korištenjem njihovih neutraliziranih supernatanata (slobodnih od bakterijskih stanica), antimikrobna aktivnost je zabilježena za 4 soja i to prema Listeria innocua ATCC 33090. Ovakav rezultat indicira da spomenuti sojevi mogu imati sposobnost produkcije bakteriocina. Jedan je soj (E. durans A_4d_1) pokazao sposobnost preživljavanja u simuliranih uvjetima GI trakta, naročito u uvjetima tankog crijeva koji su bili pogubni za ostale sojeve, zbog čega se može smatrati potencijalnim probiotičkim sojem. Temeljem rezultata sigurnosne i tehnološke karakterizacije, 2 soja Lb. sakei (MRS_296 and C_7d_13) su odabrana za primjenu u kobasicama kao starter kulture. Ovi sojevi se smatraju sigurnima za primjenu u hrani, budući da nisu bili hemolitički aktivni, nisu pokazali rezistenciju prema testiranim antibioticima te nije detektirano prisutstvo gena koji kodiraju za produkciju biogenih amina. Iako su ova dva soja originalno bila grupirana u isti klaster, pokazali su različite tehnološke karakteristike. MRS_296 je pokazao brzu sposobnost acidifikacije mesnog supstrata, što je najvažniji preduvjet svake starter kulture. Iako niti jedan od izabranih sojeva nije pokazao sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina, kod MRS_296 je detektirana proteolitička aktivnost na mediju s obranim mlijekom. Soj C_7d_13, nije pokazao dobru sposobnost acidifikacije, ali je pokazao zadovoljavajuću lipolitičku i peptidaznu aktivnost, svojstva koja su nedostajala kod MRS_296. Oba soja su pokazala antimikrobno djelovanje prema velikom broju testiranih bakterija. Izabrane autohtone starter kulture su dodane u mesnu smjesu za pripremu kobasica (15 kg) s brojem vijabilnih stanica od 9,34 og cfu/g (MRS_296) i 9,30 log cfu/g (C_7d_13) dok je neinokulirana smjesa služila kao kontrola. Kako bi se pratilo preživljavanje dodanih startera u kobasicama, izolati su izdvojeni na medijima selektivnima za BMK, prikupljeni i genotipizirani pomoću rep-PCR reakcije. Rep-PCR metodom je bilo moguće usporediti obrasce dodanih startera s obrascima prikupljenih sojeva, odnosno, bilo je moguće na ovaj način pratiti preživljavanje starter kultura. Velika većina sojeva (86,49 %) izoliranih iz kobasica s dodanim starterima je imala rep-PCR obrasce koji odgovaraju obrascima dodanih startera, što pokazuje da su dodani starteri preživjeli tijekom čitavog procesa proizvodnje kobasica. Međutim, budući da nije moguće razlikovati rep-PCR obrasce između MRS_296 i C_7d_13, nije moguće zaključiti da li su oba soja preživjela. Rezultati potpune mikrobiološke analize ukazuju na efikasnost primjenjenih starter kultura, odnosno, pokazuju da je primjenom startera kontroliran rast enterobakterija, koliformnih bakterija i L. monocyogenes kod inokulirane grupe (šarže), u kojoj su pH vrijednost i koncentracija tiramina bili značajno (p<0,05) niži, u odnosu na neinokuliranu kontrolu. Ovo istraživanje pruža uvid u in situ raznolikost i brojnost prirodno prisutnih mikrobnih populacija kobasica od mesa divljači, što doprinosi kompletnijem razumijevanju sastava i dinamike mikroorganizama kod ovakvog tipa proizvoda. Kao jedan od ključnih koraka za NGS, optimizirana je izolacija DNA iz uzoraka kobasica te je etablirana zbirka definiranih sojeva koji imaju potencijal za buduću uporabu kao starter i/ili bioprotektivne kulture. Također, kroz ovo istraživanje dobivena je efikasna starter kultura koja se sastoji od dva autohtona soja Lb. sakei, a koja se može primijeniti za proizvodnju visoko kvalitetnih kobasica od mesa divljači u tradicionalnoj ili industrijskoj proizvodnji

Mikrobiota spontano fermentiranih kobasica od mesa divljači

In the present study, the microbiota of three wild boar (WB1, WB2, WB3) and three deer meat (DS1, DS2, DS3) sausage types was characterised, with focus on lactic acid bacteria. The sausage samples were collected in triplicates (n=105) from each of the sausage producers at day zero (0), after 4, 7, 10, 20 days and at the end of the ripening period (20 or 40 days). Dominant LAB isolates collected from sausages were identified as Le. mesenteroides (n=259), Lb. sakei (n=190) and E. casseliflavus (n=106). However, high throughput amplicon sequencing revealed lactobacilli, mainly Lb. sakei and Lb. curvatus, as the predominant species, with 20.55 % of sequences at the beginning of fermentation and 70.48 % in mature sausages. It seems that the isolation of LAB on selective media favored the growth of Le. mesenteroides, since its predominance was also observed in the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of bulk colonies collected from De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) plates, indicating insufficient selectivity of the used media. On the other hand, HTS can also be biased due to DNA isolation (cell lysis) and polymerase chain reaction (PCR) analysis, which can favour certain microbial population. Regarding bacterial diversity during sausage production, the number of operational taxonomic units (OTUs) was highest at day 0 and day 4, followed by a decrease toward the later phases of fermentation and ripening, which might be explained by the decrease of pH and available water for microbial growth (aw). Measured alpha diversity parameters (Shannon's index and Pielou evenness) were significantly higher in wild boar meat sausages compared to deer meat at day 4 (p<0.01) and day 7 (p<0.05), which might be linked to a different lifestyles, type of diet and feeding habits of wild boar and deer. With fermentation time, the abundance of undesired and potentially harmful microbiota decreased indicating the microbial stability and safety of final products. However, 33 % of ready-to-eat sausages can be considered as inappropriate for human consumption, due to the elevated cell counts of Enterobacteriaceae (DS2, WB3) as well as E. coli, coliforms and presumptive B. cereus (WB3). To select strains suitable to be used as indigenous starter cultures, 1326 LAB isolates were collected from sausages. Isolates were grouped based on their rep-PCR patterns, and 57 representatives were selected and screened for safety issues and technological potential, as well as probiotic potential. Around half of the tested representatives (56.14 %) was safe for application in food, of which 53.12 % showed good acidification activity (pH<4) and variable other technological traits. Based on the results of safety and technological characterization, 2 Lb. sakei strains (MRS_296 and C_7d_13) were selected and applied simultaneously in meat batter as indigenous starter cultures. Although respective strains were originally grouped in the same cluster, they exhibited different technological traits. The majority (86.49 %) of isolates recovered from inoculated batch had rep-PCR patterns that corresponded to the patterns of respective starter cultures, suggesting that applied strains were able to establish themselves from day zero and prevailed through the production. However, considering that rep-PCR patterns of MRS_296 and C_7d_13 were not possible to differentiate, it is not possible to say whether both strains survived, or only a single one, and if, which one. It seems that the inoculation of native starter cultures suppressed the growth of Enterobacteriaceae, coliforms and L. monocyogenes. The pH values were significantly lower throughout the production in the inoculated batch (p<0.05) than in control. The tyramine content was 67.18 % lower in the ready-to-eat inoculated batch compared to the control. Such results suggest the efficiency of applied starter cultures as well as highlighting their potential of its use in future.Trajne, spontano fermentirane kobasice od mesa divljači se proizvode na malim obiteljskim gospodarstvima, prateći tradicionalne recepture i postupke. Zbog toga su prepoznate i cijenjene kao autohtoni, odnosno, tradicionalni proizvodi specifičnih senzornih osobina. Međutim, budući da se proizvode bez upotrebe starter kultura i to često u varijabilnim uvjetima, fermentacija ovisi o metaboličkoj aktivnosti prirodno prisutnih populacija bakterija mliječne kiseline (BMK) te stoga mikrobiološka sigurnost krajnjeg proizvoda može biti kompromitirana. Također, na mikrobiološku (zdravstvenu) sigurnost gotovih kobasica od mesa divljači utječu mnogi faktori povezani s načinom odstrijela divljači i daljnje obrade mesa. Da bi se osigurala potrebna kvaliteta gotovih proizvoda, potrebno je u potpunosti kontrolirati čitav proizvodni proces, a jedan od načina je upotreba detaljno karakteriziranih starter kultura u njihovoj proizvodnji. Budući da komercijalne starter kulture nisu jednako efikasne u svim tipovima proizvoda, tendencija je aplikacija autohtonih startera, a upravo spontano fermentirani proizvodi koji nisu termički obrađeni predstavljaju izvor velikog broja različitih bakterijskih sojeva, naročito BMK. Dok je mikrobiota mnogih drugih tradicionalnih fermentiranih proizvoda detaljno istražena i karakterizirana, dostupna literatura o takvim saznanjima o kobasicama od mesa divljači je vrlo limitirana. Stoga je prvi korak ovog istraživanja bio karakterizirati prirodno prisutnu mikrobiotu ovakvih kobasica, te nakon toga prikupiti i detaljno karakterizirati sojeve BMK s ciljem selekcije onih bakterijskih sojeva prikladnih za daljnje korištenje kao starter kultura. Mikrobna raznolikost tri tipa kobasica od mesa divlje svinja (WB1, WB2, WB3) i tri od mesa jelena (DS1, DS2, DS3) je istražena koristeći metode ovisne i neovisne o uzgoju. Uzorci kobasica su prikupljeni u triplikatima tijekom različitih faza proizvodnje (n=105). Izdvajanjem BMK na selektivnim mikrobiološkim medijima tijekom različitih faza zrenja I fermentacije (0, 4, 7, 10, 20 ili/i 40 dana) te molekularno-biološkom identifikacijom prikupljenih izolata, Leuconostoc mesenteroides je prepoznat kao dominanta vrsta BMK (28,24 %), a sljedili su ga Lactobacillus sakei (20,72 %) i Enterococcus casseliflavus (11,55 %). Le. mesenteroides je izoliran i identificiran u velikoj mjeri na LamVab (52,31 %) i De Man, Rogosa i Sharpe agaru (MRS) (40,89 %) mikrobiološkim podlogama, od kojih se naročito LamVab smatra selektivnima za laktobacile, što upućuje na zaključak da su navedeni mediji favorizirali rast leukonostoka. Ovaj zaključak podupiru rezultati analize DNA u denaturirajućem gradijentnom gelu poliakrilamida (DGGE) konzorcija prikupljenih sa MRS medija, budući da su potvrdili dominaciju Le. mesenteroides na ovom mediju. Osim za izdvajanje i prikupljanje BMK, različiti selektivni mediji su korišteni za detekciju i određivanje vijabilnog broja (cfu/g) ostalih ciljanih mikrobnih skupina, uključujući mikrobiotu kvarenja i potecijalne patogene. Ovakav je pristup omogućio procjenu mikrobiološke ispravnosti gotovih kobasica, budući da su propisani referentni intervali temeljeni na uzgoju i određivanju broja naraslih kolonija. Utvrđeno je da ukupno 33,33 % kobasica predstavljaju rizik za konzumaciju zbog povećanog broja bakterija porodice Enterobacteriaceae (DS2, WB3), kao i E. coli, koliformnih bakterija i hemolitičkih bakterija iz grupe B. cereus (WB3). S druge strane, analizom podataka dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije (engl. next generation sequencing; NGS) koristeći Miseq platformu (Illumina), dobivena je šira slika o zastupljenosti različitih mikobnih zajednica, budući da je izdvojena i analizirana ukupna bakterijska DNA prisutna u kobasicama, dakle, analiza nije ograničena samo na ciljane mikrobne skupine. Općenito, najveća mikrobna raznolikost je zabilježena u samom početku proizvodnje kobasica (0. i 4. dan) nakon čega opada prema kasnijim fazama fermentacije i zrenja. Zabilježeni pad raznolikosti se može objasniti kao rezultat pada pH vrijednosti, smanjenja dostupne vode za rast bakterija (aw) i antagonizmom prirodno prisutnih BMK. Iako je općenito raznolikost ostala ujednačena kod oba tipa kobasica kada su uspoređeni isti vremenski intervali, Shannonov index i ujednačenost po Pielou su ukazali na veću razinu raznolikosti bakterijskih populacija u 4. i 7. danu kod kobasica od mesa divlje svinje (WB) nego kod kobasica od mesa jelena (DS), što je vjerojatno povezano s različitim načinom života i prehrane ovih životinja. Zajedno s trendom pada ukupne bakterijske raznolikosti tijekom fermentacije i zrenja, zabilježen je i pad neželjenih mikroorganizama, s iznimkom bakterija iz roda Stenotrophomonas i Pseudomonas čiji pad nije zabilježen. Ova je metodologija također omogućila detaljniji uvid u strukturu prisutnih zajednica BMK, pri čemu su primijećena neslaganja s rezultatima dobivenima klasičnim metodama (ovisnima o uzgoju). Analizom NGS podataka vrste roda Lactobacillus su identificirane kao dominantne, i to vrste Lb. sakei (40,32 %), Lb. curvatus (40,29 %) i Lb. plantarum (1,31 %), dok su ostale BMK detektirane u malom broju. Iako se sekvenciranje sljedeće generacije pokazalo kao pouzdan pristup za in situ karakterizaciju mikrobiote prisutne u trajnim kobasicama od divljači, izolacija i prikupljanje BMK na selektivnim podlogama je nužna za prikupljanje kolekcije vijabilnih sojeva. U ovom istraživanju je prikupljeno ukupno 917 izolata na mikrobiološkim medijima selektivnima za BMK. Međutim, BMK su također prikupljene i iz drugih trajnih tradicionalnih kobasica od mesa divlje svinje i jelena te su uključene u ovo istraživanje, tako da je ukupno prikupljeno 1326 izolata. Svi izolati su identificirani koristeći molekularno-biološke metode (rod i vrsta specifični PCR, sekvenciranje po Sangeru) te su genotipizirani pomoću rep-PCR metode koristeći GTG5 početnicu. Obrasci dobiveni repPCR metodom su pokazali visoku razlučivost između sojeva i omogućili njihovo grupiranje. Izabrano je 57 reprezentativnih sojeva koji su uključeni u daljnje analize s ciljem selekcije odgovarajućih starter kultura. Prvenstveno, istražena je sigurnost njihove upotrebe u hrani (rezistencija na antibiotike, prisutstvo gena koji kodiraju za biogene amine i virulente faktore, hemolitička aktivnost) te su istražene njihove tehnološke karakteristike (sposobnost brze acidifikacije, lipolitička, proteolitička i peptidazna aktivnost) kao i antimikrobna aktivnost. Među reprezentativnim predstavnicima, izabrano je 19 bakterijskih sojeva za koje je istražena sposobnost preživljavanja u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog (GI) trakta. Rezultati su pokazali da je približno polovica reprezentativnih predstavnika (56,14 %) sigurna za primjenu u hrani, od kojih je 53,12 % pokazalo dobru sposobnost acidifikacije, odnosno, snizili su pH mesnog medija s početnih pH=5.8 na pH< 4 nakon 24 sata inkubacije. Velika većina reprezentativnih predstavnika koji su smatrani sigurnima je pokazala lipoličku (96.87 %) i proteolitičku aktivnost na mediju s obranim mlijekom (93.75 %), međutim samo je njih 9.37 % pokazalo sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina. Njihova je peptidazna aktivnost varirala između 203.50±0.00 i 5942.20±0.14 µM pNA. Iako je većina reprezentativnih predstavnika (n=57) u vijabilnom obliku pokazala antagonističku (antimikrobnu) aktivnost prema testiranim indikatorskim bakterijama, kada je testiranje provedeno korištenjem njihovih neutraliziranih supernatanata (slobodnih od bakterijskih stanica), antimikrobna aktivnost je zabilježena za 4 soja i to prema Listeria innocua ATCC 33090. Ovakav rezultat indicira da spomenuti sojevi mogu imati sposobnost produkcije bakteriocina. Jedan je soj (E. durans A_4d_1) pokazao sposobnost preživljavanja u simuliranih uvjetima GI trakta, naročito u uvjetima tankog crijeva koji su bili pogubni za ostale sojeve, zbog čega se može smatrati potencijalnim probiotičkim sojem. Temeljem rezultata sigurnosne i tehnološke karakterizacije, 2 soja Lb. sakei (MRS_296 and C_7d_13) su odabrana za primjenu u kobasicama kao starter kulture. Ovi sojevi se smatraju sigurnima za primjenu u hrani, budući da nisu bili hemolitički aktivni, nisu pokazali rezistenciju prema testiranim antibioticima te nije detektirano prisutstvo gena koji kodiraju za produkciju biogenih amina. Iako su ova dva soja originalno bila grupirana u isti klaster, pokazali su različite tehnološke karakteristike. MRS_296 je pokazao brzu sposobnost acidifikacije mesnog supstrata, što je najvažniji preduvjet svake starter kulture. Iako niti jedan od izabranih sojeva nije pokazao sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina, kod MRS_296 je detektirana proteolitička aktivnost na mediju s obranim mlijekom. Soj C_7d_13, nije pokazao dobru sposobnost acidifikacije, ali je pokazao zadovoljavajuću lipolitičku i peptidaznu aktivnost, svojstva koja su nedostajala kod MRS_296. Oba soja su pokazala antimikrobno djelovanje prema velikom broju testiranih bakterija. Izabrane autohtone starter kulture su dodane u mesnu smjesu za pripremu kobasica (15 kg) s brojem vijabilnih stanica od 9,34 og cfu/g (MRS_296) i 9,30 log cfu/g (C_7d_13) dok je neinokulirana smjesa služila kao kontrola. Kako bi se pratilo preživljavanje dodanih startera u kobasicama, izolati su izdvojeni na medijima selektivnima za BMK, prikupljeni i genotipizirani pomoću rep-PCR reakcije. Rep-PCR metodom je bilo moguće usporediti obrasce dodanih startera s obrascima prikupljenih sojeva, odnosno, bilo je moguće na ovaj način pratiti preživljavanje starter kultura. Velika većina sojeva (86,49 %) izoliranih iz kobasica s dodanim starterima je imala rep-PCR obrasce koji odgovaraju obrascima dodanih startera, što pokazuje da su dodani starteri preživjeli tijekom čitavog procesa proizvodnje kobasica. Međutim, budući da nije moguće razlikovati rep-PCR obrasce između MRS_296 i C_7d_13, nije moguće zaključiti da li su oba soja preživjela. Rezultati potpune mikrobiološke analize ukazuju na efikasnost primjenjenih starter kultura, odnosno, pokazuju da je primjenom startera kontroliran rast enterobakterija, koliformnih bakterija i L. monocyogenes kod inokulirane grupe (šarže), u kojoj su pH vrijednost i koncentracija tiramina bili značajno (p<0,05) niži, u odnosu na neinokuliranu kontrolu. Ovo istraživanje pruža uvid u in situ raznolikost i brojnost prirodno prisutnih mikrobnih populacija kobasica od mesa divljači, što doprinosi kompletnijem razumijevanju sastava i dinamike mikroorganizama kod ovakvog tipa proizvoda. Kao jedan od ključnih koraka za NGS, optimizirana je izolacija DNA iz uzoraka kobasica te je etablirana zbirka definiranih sojeva koji imaju potencijal za buduću uporabu kao starter i/ili bioprotektivne kulture. Također, kroz ovo istraživanje dobivena je efikasna starter kultura koja se sastoji od dva autohtona soja Lb. sakei, a koja se može primijeniti za proizvodnju visoko kvalitetnih kobasica od mesa divljači u tradicionalnoj ili industrijskoj proizvodnji

Autohtoni sojevi roda Lactobacillus izolirani iz Istarskog sira kao potencijalne starter kulture

Istrian ewe’s milk cheese is an autochthonous product that is manufactured for generations on small family farms in the Croatian peninsula Istria. Traditional Istrian cheese is made from unpasteurized ewe’s milk, without the addition of starter cultures. Consequently, the specific flavour and texture of the Istrian cheese is owed to metabolic processes of indigenous microflora of which Lactobacillus species play pivotal role. Characterisation and selection of indigenous lactobacilli may result in the potential use of selected strains as starter, bioprotective or even probiotic cultures. This study focuses on potential use of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei isolated from traditional Istrian cheese as starter cultures, by using methods that determine their proteolytic, lipolytic, antimicrobial and haemolytic potential, as well as their ability of acidification, autoaggregation and survival in simulated gastrointestinal conditions. Our results indicated that from 12 representative strains most revealed a low or moderate proteolytic activity as well as absence of lipolytic and haemolytic activities. From 12 strains, 5 of them showed a medium to strong acidification ability and lowered the pH of milk below 5.00 after 24 hours of incubation. Furthermore, almost all isolates exhibited antimicrobial activity against Serratia marcescens, and lowest number of isolates showed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Listeria innocua. The studied Lactobacillus strains revealed high survival rate in a simulated oral cavity and duodenum conditions, while the survival ability in a simulated gastric conditions was much lower. Ability to aggregate was low for all tested strains, after 3 hours and after 5 hours of incubation.Tradicionalni Istarski sir proizvodi se od nepasteriziranog ovčjeg mlijeka, bez dodatka starter kultura. Prema tome, specifična aroma i tekstura Istarskog sira pripisuje se, uz ostale faktore, metaboličkim procesima autohtone mikroflore od kojih vrste roda Lactobacillus imaju ključnu ulogu. Karakterizacija i izbor autohtonih sojeva laktobacila može dovesti do potencijalnog korištenje odabranih sojeva kao starter, zaštitnih ili probiotičkih kultura. U ovom istraživanju željeli smo istražiti tehnološki i probiotički potencijal sojeva Lactobacillus plantarum i Lactobacillus casei izoliranih iz tradicionalnog Istarskog sira pomoću metoda koje određuju njihov proteolitički, kazeinolitički, lipolitički, antimikrobni i hemolitički potencijal, kao i njihovu sposobnost zakiseljavanja, autoagregacije i preživljavanja u simuliranim gastrointestinalnim uvjetima. Svih 12 reprezentativnih sojeva pokazuju nisku do umjerenu proteolitičku aktivnost te odsutnost lipolitičke i hemolitičke aktivnosti. Od 12 sojeva, 5 je pokazalo jaku sposobnost zakiseljavanja, spuštajući pH mlijeka ispod 5,00 nakon 24 sati inkubacije. Nadalje, gotovo svi izolati pokazuju antimikrobno djelovanje u odnosu na vrstu Serratia marcescens te slabo antimikrobno djelovanje u odnosu na Staphylococcus aureus i Listeria innocua. Istraživani sojevi pokazali su visoku prosječnu stopu preživljavanja u simuliranim uvjetima usne šupljine i dvanaesnika, dok je prosječna stopa preživljavanja u simuliranim želučanim uvjetima bila znatno niža. Nakon 5 sati inkubacije, autoagregacijska sposobnost svih istraživanih sojeva bila je niska

THE ROLE OF GUT MICROBIOTA ON MAINTAINING HEALTH OF PIGS

Stabilna crijevna mikrobiota utječe na mnogo načina na održavanje ili poboljšanje zdravlja svinja. Dosadašnja istraživanja su pokazala pozitivan utjecaj crijevne mikrobiote u iskoristivosti hranjivih tvari, poboljšanju morfoloških i fizioloških svojstava gastrointestinalnog (GI) trakta, u sprječavanju prodora patogenih vrsta, a također mikroorganizmi probavila imaju važnu imunološku ulogu. Osim korisnih i poželjnih bakterijskih vrsta, crijevna mikrobiota svinja može uključivati patogene poput Salmonella spp., Clostridia spp. i patogenih sojeva E. coli. U slučaju narušene ravnoteže prirodno prisutnih mikrobnih zajednica, ovi patogeni mogu uzrokovati bolesti svinja te posljedično gubitke u proizvodnji. U prošlosti su za osiguranje stabilne mikrobiote GI trakta preventivno korišteni antibiotici, no od kada je prepoznata štetnost takve prakse sve više se koriste probiotici, prebiotici te različiti aditivi. Za takav pristup, potrebno je poznavati sastav i brojnost mikrobnih zajednica prisutnih u GI traktu svinja kao i identificirati ključne mikroorganizme u prevenciji infekcija i održavanju zdravlja domaćina. Zbog toga je u fokusu znanstvenog interesa definirati i detaljno karakterizirati crijevnu mikrobiotu zdravih jedinki, istražiti međusobne mikrobne interakcije, kao i interakcije s domaćinom, te različite načine osiguravanja stabilne crijevne mikrobiote kako bi se održala vitalnost i zdravlje životinja.Stable gut microbiota may influence the health and wellbeing of pigs. Results of up-to-date studies have shown a positive effect of gut microbiota on feed efficiency, improvement of morphological and physiological characteristics of gastrointestinal (GI) tract, prevention of breach of pathogenic species, as well as a positive role in immunology. However, besides beneficial bacterial species, gut microbiota of pigs can include pathogens such as Salmonella spp., Clostridia spp. and pathogenic strains of E. coli. When the balance of naturally present microbial communities is disturbed, these pathogens can cause illness of pigs, causing production losses. Antibiotics were used in the past for ensuring a stable gut microbiota, but since damaging effects of such practice were recognized, alternative methods have been considered, such as the use of probiotics and prebiotics. For this approach, it is necessary to know the composition and abundance of microbial communities in GI tract of healthy pigs, as well as to identify the most important microorganisms that have a role in the prevention of infection and maintaining the wellbeing of the host. Therefore, many studies have been focused on defining and detailed characterization of gut microbiota of healthy individuals, to study interactions between microbes as well as microbial interactions with the host. Also, different approaches have been considered to ensure a stable gut microbiota to maintain vitality and health of animals

Arbuscular mycorrhizal fungi and olive groves

Arbuskularna mikoriza je simbiozni odnos pri kojem gljiva prodire u stanice korteksa korijena vaskularne biljke. Selekcija prikladnog soja gljiva, koja ovisi o uzgajanoj kulturi, jedan je od najvažnijih faktora za ostvarivanje uspješne arbuskularne mikorize. Jednom kada se ostvari uspješan simbiozni odnos, koji na određeni način predstavlja most između korijena biljke i tla, dolazi do pozitivnog utjecaja na prinos kao i na kvalitetu maslinova ulja. Dosadašnja istraživanja su potvrdila kako arbuskularna mikoriza može pozitivno utjecati na ishranjenost i poboljšano zdravstveno stanje masline, prinos plodova kao i na kemijski sastav maslinovog ulja. Ovakva saznanja omogućuju poboljšanje te moduliranje različitih parametara proizvodnje u maslinarstvu.Arbuscular mycorrhiza - a symbiotic relationship in which the fungus invades the cortical cells of the root of the vascular plant. The selection of a suitable fungal strain, which depends on the crop grown, is one of the most important factors in achieving a successful arbuscular mycorrhiza. Once achieved, a successful symbiotic relationship acts as a bridge between the plant roots and the soil that has a positive impact on nutrient transport. Previous research has confirmed that arbuscular mycorrhiza can have a positive effect on olive nutrition, phytosanitary stability, as well as fruit yield and olive oil quantality, and chemical composition. Insight into relationship enables the improvement and modulation of various production parameters in olive growing

Las bacterias del ácido láctico en la producción de los chorizos crudo-fermentados tradicionales

Spontano fermentirane trajne kobasice, koje se proizvode u domaćoj radinosti, prepoznati su i cijenjeni tradicionalni proizvodi. Odlikuju se specifičnim senzornim karakteristikama i izvor su vrijednih hranjivih sastojaka. Međutim, različit izbor sirovine i dodataka te varijabilni uvjeti proizvodnje dovode do neujednačene mikrobiološke i senzorne kvalitete tradicionalnih kobasica. Ključnu ulogu u osiguravanju zdravstvene ispravnosti takvih proizvoda imaju prirodno prisutne, autohtone populacije bakterija mliječne kiseline (BMK). Selektirane i aplicirane kao starter kulture autohtone populacije BMK mogle bi smanjiti rizike uzorkovane mikrobiološkom kontaminacijom za vrijeme klanja, odnosno lova i tijekom prerade mesa te povoljno utjecati na organoleptičke karakteristike krajnjeg proizvoda. Stoga je cilj ovog rada pokazati specifičnosti bakterija mliječne kiseline i mogućnosti njihove aplikacije u fermentaciji tradicionalnih suhih kobasica proizvedenih od mesa domaćih ili divljih životinja.Spontaneously fermented dry sausages that are produced locally are considered to be recognized and appreciated traditional products. They are characterized by specific sensory properties and represent a source of valuable nutrients. However, a multiple choice of raw materials and additives, as well as varying production conditions affect variable microbiological and sensory quality of traditional sausages. The inherently present, indigenous population of lactic acid bacteria (LAB) plays a key role in ensuring the health and safety of such products. Indigenous populations of LAB that are selected and applied as starter cultures could not only reduce risks caused by microbial contamination during slaughtering or hunting and during the processing of meat, but could also favourably affect the organoleptic properties of the end product. The aim of this paper was therefore to demonstrate the specificity of lactic acid bacteria and the possibility of their application in the fermentation of traditional dry sausages that are produced from the meat of domestic or wild animals.Hausgemachte spontan fermentierte Dauerwürste aus Wildeisch sind ein anerkanntes und geschätztes Traditionsprodukt, das sich durch besondere sensorische Eigenschaften auszeichnet und eine Quelle von hochwertigen Nährstoen darstellt. Die Wahl von unterschiedlichen Rohstoen und Zusätzen sowie die veränderlichen Produktionsbedingungen führen zu einer unausgewogenen mikrobiologischen und sensorischen Qualität solcher Würste. Eine ausschlaggebende Rolle bei der Sicherstellung der gesundheitlichen Unbedenklichkeit solcher Produkte haben die von Natur aus anwesenden, autochthonen Populationen der Milchsäurebakterien. Als Starterkulturen selektiert und appliziert, könnten die Populationen der Milchsäurebakterien die durch die mikrobiologische Kontaminierung während der Jagd und/oder während der Fleischverarbeitung verursachten Risiken reduzieren und sich günstig auf die organoleptischen Eigenschaften des Endprodukts auswirken. Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, die Besonderheiten der Milchsäurebakterien und die Möglichkeiten ihrer Anwendung in der Fermentierung von Wildwurst aufzuzeigen.Le salsicce di selvaggina a lunga conservazione, fermentate spontaneamente e prodotte artigianalmente, sono un prodotto noto e apprezzato. Esse hanno speciche caratteristiche sensoriali e sono fonte d’ingredienti altamente nutrienti. Tuttavia, una di!erente scelta delle materie prime e degli additivi e la variabilità delle condizioni di produzione rendono la qualità microbiologica e sensoriale di queste salsicce non uniforme. La popolazione autoctona di batteri lattici (BL), naturalmente presente, svolge un ruolo chiave nel garantire l’idoneità sanitaria di simili prodotti. Selezionati e applicati come cultura starter della popolazione autoctona di BL, potrebbero ridurre i rischi causati dalla contaminazione microbiologica durante la caccia e/o durante la lavorazione delle carni e incidere positivamente sulle caratteristiche organolettiche del prodotto nale. L’obiettivo di questo lavoro, quindi, consiste nel mostrare la specicità dei batteri lattici e la possibilità della loro applicazione nella fermentazione delle salsicce di selvaggina.Los chorizos crudo-fermentados de la carne de caza fermentados espontáneamente y hechos en casa son productos tradicionales reco- nocidos y valiosos. Son caracterizados por sus propiedades sensoriales especícas y son la fuente de los ingredientes altamente nutritivos. No obstante, tanto la selección diferente de la materia cruda y de los aditivos como las condiciones variables llevan a las calidades microbiológicas y sensoriales desniveladas de estos tipos de chorizos. Las bacterias del ácido láctico (BAL) autóctonas, que están presentes de forma natural, tienen el papel clave en la provisión de la seguridad sanitaria de este tipo de productos. Seleccionadas y aplicadas como cultivos iniciadores de la populación autóctona, las BAL podrían disminuir el riesgo causado por la contaminación microbiológica durante la caza y/o durante el procesamiento de la carne y de esta manera inuir positivamente sobre las propiedades organolépticas del producto nal. Por lo tanto el n de este trabajo fue mostras las especidades de las bacterias del ácido láctico y las posibilidades de su aplicación durante la fermentación de los chorizos de carne de caza