Entwicklung und Bewertung verschiedener Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Ectonucleotidasen und zur Identifizierung von Inhibitoren

Ectonucleotidasen werden ubiquitär im Körper exprimiert und sind an vielen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt. Sie sind daher als potentielle Arzneistofftargets von großem Interesse (z. B. in der Krebsbehandlung oder der antimikrobiellen Therapie). Für die Entwicklung neuer Wirkstoffe ist es jedoch wichtig die genaue Funktion der unterschiedlichen Enzyme und ihrer Subtypen zu kennen. Inhibitoren können hierbei als pharmakologische Werkzeuge dienen und zur Target-Validierung verwendet werden. Bisher sind nur wenige und nicht sehr potente Inhibitoren beschrieben worden. Um neue Hemmstoffe zu identifizieren, werden geeignete Methoden zur Aktivitätsbestimmung benötigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher der Malachitgrün-Assay für die Aktivitätsbestimmung der humanen NTPDase1, -2, -3 und -8 etabliert, erfolgreich auf eine Roboteranlage übertragen und validiert (Z´-Faktoren ≥ 0,71). Er ermöglicht die Detektion des bei der Enzymreaktion entstehenden Phosphats. In einem ersten High-throughput Screening (HTS) wurden verschiedene Substanzbibliotheken (insgesamt 3800 Testverbindungen) zur Identifizierung inhibitorisch aktiver Verbindungen getestet (Z´-Faktoren ≥ 0,79). Vier Treffer wurden näher charakterisiert: LE 135, Resveratrol, Tamoxifen und PSB-06126 wurden als selektive Inhibitoren einzelner NTPDase-Subtypen mit IC50-Werten im mikromolaren Bereich identifiziert. Weiterhin konnten erste Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Anthrachinon-Derivaten an den humanen NTPDasen1, -2 und -3 abgeleitet werden. Darüber hinaus wurden neue, auf Fluoreszenzpolarisationsmessungen beruhende Methoden zur Aktivitätsbestimmung der NTPDase1, -2, -3 und -8 entwickelt und validiert (Z´-Faktor ≥ 0.70). Diese Assays ermöglichen die direkte und sensitive Quantifizierung der bei der Enzymreaktion entstehenden Produkte ADP oder AMP im 384-Loch-Format. In einem ersten exemplarischen Screening wurden > 400 Arzneistoffe in Bezug auf ihre inhibitorische Aktivität gegenüber der humanen NTPDase3 (Z´-Faktor: 0,87) untersucht. Des Weiteren führten Untersuchungen von Polyoxometalaten zur Identifizierung des potentesten, bisher beschriebenen NTPDase1-Inhibitors K10[Co4(H2O)2(PW9O34)2]·22H2O mit einem Ki-Wert von 3,88 nM. Für die Aktivitätsbestimmung der bakteriellen Lp1NTPDase aus Legionella pneumophila wurde ein Kapillarelektrophorese-Assay entwickelt. Er ermöglicht es das bei der Enzymreaktion gebildete AMP elektrophoretisch vom Substrat ADP zu trennen und die entsprechenden Konzentrationen über die Peakflächen zu quantifizieren. Es konnten verschiedene Anthrachinon-Derivate in Hinblick auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und die Verbindung mit einem 9-Phenanthryl-Rest in der 4-Position des Anthrachinon-Grundgerüstes als potentester Inhibitor des Enzyms mit einem IC50-Wert von 4,24 µM identifiziert werden. Für die Aktivitätsbestimmung der gewebe-unspezifische Alkalische Phosphatase (TNAP) wurde ein Lumineszenzassay mit CDP-Star als Substrat etabliert und in einem ersten Screening der Metallkomplex Na20[P6W18O79]·37H2O als potentester Inhibitor (kompetitiver Hemmmechanismus) mit einem Ki-Wert von 2,27 µM ermittelt. Abschließend wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Vor- und Nachteile der Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Ectonucleotidasen ausführlich bewertet und diskutiert

X-Ray Co-Crystal Structure Guides the Way to Subnanomolar Competitive Ecto-5 '-Nucleotidase (CD73) Inhibitors for Cancer Immunotherapy

Ecto-5'-nucleotidase (CD73, EC 3.1.3.5) catalyzes the extracellular hydrolysis of AMP yielding adenosine, which induces immunosuppression, angiogenesis, metastasis, and proliferation of cancer cells. CD73 inhibition is therefore proposed as a novel strategy for cancer (immuno)therapy, and CD73 antibodies are currently undergoing clinical trials. Despite considerable efforts, the development of small molecule CD73 inhibitors has met with limited success. To develop a suitable drug candidate, a high resolution (2.05 degrees A) co-crystal structure of the CD73 inhibitor PSB-12379, a nucleotide analogue, in complex with human CD73 is determined. This allows the rational design and development of a novel inhibitor (PSB-12489) with subnanomolar inhibitory potency toward human and rat CD73, high selectivity, as well as high metabolic stability. A co-crystal structure of PSB-12489 with CD73 (1.85 degrees A) reveals the interactions responsible for increased potency. PSB-12489 is the most potent CD73 inhibitor to date representing a powerful tool compound and novel lead structure

Fluorescent-Labeled Selective Adenosine A_2B Receptor Antagonist Enables Competition Binding Assay by Flow Cytometry

Fluorescent ligands represent powerful tools for biological studies and are considered attractive alternatives to radioligands. In this study, we developed fluorescent antagonists for A_2B adenosine receptors (A_2BARs), which are targeted by antiasthmatic xanthines and were proposed as novel targets in immuno-oncology. Our approach was to merge a small borondipyrromethene (BODIPY) derivative with the pharmacophore of 8-substituted xanthine derivatives. On the basis of the design, synthesis, and evaluation of model compounds, several fluorescent ligands were synthesized. Compound <b>29</b> (PSB-12105), which displayed high affinity for human, rat, and mouse A_2BARs (<i>K</i>_i = 0.2–2 nM) and high selectivity for this AR subtype, was selected for further studies. A homology model of the human A_2BAR was generated, and docking studies were performed. Moreover, <b>29</b> allowed us to establish a homogeneous receptor–ligand binding assay using flow cytometry. These compounds constitute the first potent, selective fluorescent A_2BAR ligands and are anticipated to be useful for a variety of applications

α,β-Methylene-ADP (AOPCP) Derivatives and Analogues: Development of Potent and Selective <i>ecto</i>-5′-Nucleotidase (CD73) Inhibitors

<i>ecto</i>-5′-Nucleotidase (<i>e</i>N, CD73) catalyzes the hydrolysis of extracellular AMP to adenosine. <i>e</i>N inhibitors have potential for use as cancer therapeutics. The <i>e</i>N inhibitor α,β-methylene-ADP (AOPCP, adenosine-5′-<i>O</i>-[(phosphonomethyl)­phosphonic acid]) was used as a lead structure, and derivatives modified in various positions were prepared. Products were tested at rat recombinant <i>e</i>N. 6-(Ar)­alkylamino substitution led to the largest improvement in potency. <i>N</i>⁶-Monosubstitution was superior to symmetrical <i>N</i>⁶,<i>N</i>⁶-disubstitution. The most potent inhibitors were <i>N</i>⁶-(4-chlorobenzyl)- (<b>10l</b>, PSB-12441, <i>K</i>_i 7.23 nM), <i>N</i>⁶-phenylethyl- (<b>10h</b>, PSB-12425, <i>K</i>_i 8.04 nM), and <i>N</i>⁶-benzyl-adenosine-5′-<i>O</i>-[(phosphonomethyl)­phosphonic acid] (<b>10g</b>, PSB-12379, <i>K</i>_i 9.03 nM). Replacement of the 6-NH group in <b>10g</b> by O (<b>10q</b>, PSB-12431) or S (<b>10r</b>, PSB-12553) yielded equally potent inhibitors (<b>10q</b>, 9.20 nM; <b>10r</b>, 9.50 nM). Selected compounds investigated at the human enzyme did not show species differences; they displayed high selectivity versus other <i>ecto</i>-nucleotidases and ADP-activated P2Y receptors. Moreover, high metabolic stability was observed. These compounds represent the most potent <i>e</i>N inhibitors described to date