Pesquisa sorológica de sorovares de leptospiras que mais frequentemente infectam e causam doença em cães com suspeita clínica de leptospirose / Serological study of leptospira serovars that most often infect and cause disease in dogs with clinically suspected leptospirosis

A leptospirose é uma zoonose de importância mundial que acomete grande variedade de espécies de mamíferos na qual a espécie canina é considerada um importante hospedeiro de manutenção da doença no ambiente. Considerando a importância da leptospirose canina para a saúde pública, o objetivo deste trabalho foi verificar os prováveis sorovares que mais frequentemente infectam e causam a doença em cães com suspeita clínica de leptospirose aguda. Para tal, 14 amostras de sangue foram coletadas de cães com suspeita clínica de leptospirose aguda atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Metodista de São Paulo e destinadas à investigação de anticorpos antileptospiras por meio da técnica de soroaglutinação microscópica, além de serem avaliadas quanto aos níveis de ureia e creatinina sérica, atividade de enzimas hepáticas e concentração de bilirrubinas total. Os achados clínicos laboratoriais neste estudo evidenciaram importante acometimento renal e hepático nos animais afetados com predominância do sorovar Copenhageni, além da ocorrência do sorovar Brastilava. No Brasil o sorovar Copenhageni, representante do sorogrupo Icterohaemorrhagiae é considerado endêmico na população canina e nos seres humanos e responsável por casos graves da doença nestas espécies. Estes resultados sugerem a implementação de estratégias de vacinação canina para mitigar parcialmente essa tendência, uma vez que a maioria das vacinas encontradas hoje no mercado nacional contêm este sorovar na formulação

Pesquisa sorológica para detecção de anticorpos anti- Leptospira spp. em pequenos ruminantes no município de Suzano, São Paulo / Serological survey of anti-Leptospira spp. antibodies in in small ruminants in the municipality of Suzano, São Paulo

A leptospirose é uma doença infectocontagiosa responsável por graves consequências socioeconômicas na ovinocaprinocultura mundialmente, ocasionadas em decorrência de problemas reprodutivos, diminuição na produção de leite, perda de animais e transmissão do agente para o homem. O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência de anticorpos anti-Leptospira spp. em pequenos ruminantes no município de Suzano, São Paulo. Foram analisadas para a pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp. amostras de soro sanguíneo de 159 caprinos e 21 ovinos, oriundos de duas propriedades localizadas no município de Suzano. Para diagnostico de leptospirose foi utilizado o teste de soroaglutinação microscópica (SAM), frente a uma coleção de 23 sorovares representantes de 18 sorogrupos. Na análise do sorovar mais provável foi considerada a sorovariedade que apresentou maior título e maior frequência. A frequência de caprinos reagentes na SAM para pelo menos um sorovar foi de 23,27% (37/159) com títulos variando de 100 a 400, sendo o sorovar Butembo 86,48% (32/37), pertencente ao sorogrupo Autumnalis o mais prevalente. Nos ovinos a soro prevalência encontrada foi de 9,52% (2/21) e os sorovares mais frequentes foram Butembo (50%) e Bratislava (50%) pertencentes aos sorogrupos Autumnalis e Australis, respectivamente

Occurrence of antibodies against Leptospira spp. in shelter dogs / Ocorrência de anticorpos contra Leptospira spp. em cães de abrigo

The present study aimed to investigate the occurrence of anti-Leptospira antibodies in dogs held in a public animal shelter from the city of Barbacena, Southeastern Brazil. All samples were analyzed by the Microscopic Agglutination Test (MAT) including a panel of 24 serovars representing 21 serogroups, samples with titer ? 100 were defined as seroreactive. Of a total of 172 dogs investigated, 23 (13.44%) were seroreactivity with antibody titers ranging from 100 to 1600. Leptospira interrogans serovar Canicola (30.4%) (serogroup Canicola) presented the highest seroreactivity, followed by Pyrogenes (17.4%) (serogroup Pyrogenes) and Hebdomadis (13%) (serogroup Hebdomadis). The serological findings indicate that sheltered dogs are exposed to Leptospira spp. infection, with predominant of serovar Canicola historically maintained by dogs.

“Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions”

Abstract\ud \ud \ud \ud Background\ud \ud Leptospirosis is considered a re-emerging infectious disease caused by pathogenic spirochaetes of the genus Leptospira. Pathogenic leptospires have the ability to survive and disseminate to multiple organs after penetrating the host. Leptospires were shown to express surface proteins that interact with the extracellular matrix (ECM) and to plasminogen (PLG). This study examined the interaction of two putative leptospiral proteins with laminin, collagen Type I, collagen Type IV, cellular fibronectin, plasma fibronectin, PLG, factor H and C4bp.\ud \ud \ud \ud Results\ud \ud We show that two leptospiral proteins encoded by LIC11834 and LIC12253 genes interact with laminin in a dose - dependent and saturable mode, with dissociation equilibrium constants (KD) of 367.5 and 415.4 nM, respectively. These proteins were named Lsa33 and Lsa25 (Leptospiral surface adhesin) for LIC11834 and LIC12253, respectively. Metaperiodate - treated laminin reduced Lsa25 - laminin interaction, suggesting that sugar moieties of this ligand participate in this interaction. The Lsa33 is also PLG - binding receptor, with a KD of 23.53 nM, capable of generating plasmin in the presence of an activator. Although in a weak manner, both proteins interact with C4bp, a regulator of complement classical route. In silico analysis together with proteinase K and immunoflorescence data suggest that these proteins might be surface exposed. Moreover, the recombinant proteins partially inhibited leptospiral adherence to immobilized laminin and PLG.\ud \ud \ud \ud Conclusions\ud \ud We believe that these multifunctional proteins have the potential to participate in the interaction of leptospires to hosts by mediating adhesion and by helping the bacteria to escape the immune system and to overcome tissue barriers. To our knowledge, Lsa33 is the first leptospiral protein described to date with the capability of binding laminin, PLG and C4bp in vitro.We are deeply indebted to Alexsander Seixas de Souza (Departamento de Parasitologia, Instituto Butantan, Sao Paulo, Brazil) for use of Confocal facilities and helpful discussion. This work was supported by FAPESP, CNPq and Fundaçao Butantan, Brazil; RFD and MLV have fellowships from FAPESP

Canine leptospirosis in asymptomatic populations from the Southwest Region of São Paulo State, Brazil

A leptospirose é uma enfermidade infectocontagiosa que pode acometer os animais e o homem. Nos países tropicais e em desenvolvimento ocorrem 70% dos casos humanos, com mortalidade variando entre 10 a 70%. Os cães podem se tornar portadores assintomáticos por um longo período, podendo transmitir a Leptospira para humanos. Devido ao intenso convívio com o ser humano, os cães podem servir como sentinelas da contaminação ambiental. Esse trabalho investigou a frequência de ocorrência da leptospirose canina em populações assintomáticas da região sudoeste do estado de São Paulo. Para isso foram examinadas pela técnica de soroaglutinação microscópica (MAT), amostras de sangue provenientes de 572 cães assintomáticos dos municípios de Apiaí, Cananeia, Itapeva e Itu por amostragem de conveniência, oriundos de campanhas de castração. Em Apiaí, foram encontrados 40,5% dos animais reagentes para Leptospira spp.; em Itapeva, 42,6%; em Cananeia, 7,7% e em Itu, 5,1%. Os dados encontrados demonstram que, pelo menos, um animal dos municípios de Itapeva, Apiaí e Cananeia apresentaram título igual ou maior que 800, indicando a circulação da bactéria nessas localidades e que a equipe envolvida nas campanhas de castração precisam ser alertadas sobre o correto uso de equipamento de proteção individual, principalmente no esvaziamento mecânico da bexiga antes do procedimento cirúrgico. O estudo também sugere que as campanhas de castração podem ser estratégicas no monitoramento de doenças zoonóticas e poderiam auxiliar no estabelecimento de ações preventivas para a saúde humana e animal.Leptospirosis is an infectious disease that can affect animals and humans. Distributed worldwide, the disease is more prevalent in tropical regions due to socioenvironmental characteristics. Dogs can serve as sentinels for environmental contamination due to their frequent contact with humans. This study investigated the frequency of occurrence of canine leptospirosis in asymptomatic populations from the Southwest Region of the State of São Paulo, Brazil. Thus, blood samples collected from 572 asymptomatic dogs from the cities of Apiaí, Cananeia, Itapeva, and Itu were tested with a microscopic agglutination test (MAT). A total of 40.5% of animals in Apiaí reacted to Leptospira spp., 42.6% in Itapeva, 7.1% in Cananeia, and 5.1% in Itu. The data from the present study demonstrate that at least one animal from the municipalities of Itapeva, Apiaí, and Cananeia had a titer equal to or higher than 800, indicating that Leptospira is circulating in these municipalities and that the teams working on castration campaigns need to be educated on the correct use of personal protective equipment, especially when mechanically emptying the bladder of these animals. This study also suggests that castration campaigns can strategically monitor zoonotic diseases and assist in establishing preventive strategies for human and animal health

Evaluation for leptospirosis vaccine. Relation between in vitro growh inibition test and potency test in hamsters

Foi investigada a existência da correlação entre o teste padrão de potência de bacterinas antileptospiras e o teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro. Os ensaios foram realizados, em hamsters machos, isoladamente segundo a bacterina comercial (A ou B) antileptospirose empregada. Foram comparados a proteção conferida pelas bacterinas e os níveis de anticorpos neutralizantes, respectivamente obtidos nos teste de desafio e inibição de crescimento de leptospiras in vitro (ICL). O protocolo de imunização adotou duas aplicações de 0,25 mL das bacterinas, puras e suas diluições, pela via subcutânea com o intervalo de 15 dias. Os desafios foram realizados após 15 dias da segunda dose com 0,2 mL de culturas vivas dos sorovares Canicola (bacterina A e B) ou Pomona (somente bacterina A), os óbitos por leptospirose foram registrados e, os animais sobreviventes foram submetidos a eutanásia no 21° dia de observação e a condição de portador renal foi investigada por cultivos de tecido renal em meio de Fletcher. Os animais destinados ao teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro foram sacrificados no mesmo dia em que se realizou o desafio dos animais submetidos ao teste de potência. As colheitas de sangue foram efetuadas assepticamente por punção intracardíaca. Constatada individualmente a esterilidade dos soros foram constituídos os pools com quantidades iguais de soro por animal e subgrupo (n=5). No teste de potência de bacterinas para ambas as estirpes a DL50 foi superior a diluição 10-9 do controle do inóculo de desafio, os animais foram desafiados com a diluição 10-6. O número de animais sobreviventes ao desafio e a proteção contra a infecção renal variou de acordo com a bacterina empregada e sua concentração. Os resultados do teste de desafio com as bacterinas antileptospirose A e B situaram-se dentro dos parâmetros exigidos, sendo as bacterinas aprovadas segundo o critério de avaliação internacional. A diluição 1:800 das duas bacterinas testadas recomendada pelas normas internacionais não foi capaz de proteger contra o estado de portador renal de leptospiras. Os hamsters imunizados com as bacterinas apresentaram anticorpos neutralizantes em níveis superiores ao de aglutininas. A comparação do desempenho das bacterinas testadas para os sorovares Canicola e/ou Pomona, segundo sua concentração, por meio das proporções de animais sobreviventes ao teste de desafio e a média dos títulos de anticorpos neutralizantes, estabeleceu que o título de anticorpos neutralizantes igual ou superior a 1,0log10 como correspondente ao nível de aprovação de bacterinas no teste de potência.It was investigated the existence in hamsters of correlation between the standard potency test of bacterins antileptospires and the in vitro leptospires growth inhibition test. The assays were performed, in male hamsters, separately according to the commercial (A and B) animal antileptospirosis bacterin used. The quality of the bacterins and the level of neutralizing antibodies were compared, respectively obtained in the challenge test and the in vitro leptospires growth inhibition test (ICL). The potency test with challenge, performed with serovars Pomona and Canicola, was modified from the protocol of The United States Agriculture Department. The immunization schedule employed two 0,25 mL of bacterins, pure and with dilutions, by subcutaneous route with 15-day interval. The challenge was performed after 15 days from the second dose with 0,2 mL of alive cultures from serovars Canicola (bacterins A and B) or Pomona (only bacterin A), the deaths by leptospirosis were registered and on the 21st observation day the survivors were sacrificed and the condition of renal carrier was investigated by culture of renal tissue for leptospires isolation in Fletcher medium. The animals destined to the in vitro leptospire growth inhibition test were sacrificed on the same day the potency assay with challenge was performed on the other group of hamsters. The blood samples were collected aseptically by intracardiac puncture. Once the sterility of each serum was verified the pools were formed with equal amounts of serum per animal and subgroup (n=5). The bacterins potency tests, for both strains, resulted in a higher DL50 for the dilution 10-9 of the challenge inoculum control, the animals were challenged with the dilution 10-6. The number of surviving animals to the challenge and the protection against renal infection varied according to the bacterin used and its concentration. The results of the potency tests with challenge using the bacterins antileptospirosis A and B were within the required standards, being therefore approved according to the international evaluation criteria. The dilution 1:800, for both bacterins tested, which is recommended by international criteria was not capable of protecting against the condition of leptospires renal carrier. Hamsters immunized with the bacterins showed neutralizing antibodies in higher titers in comparison to agglutinating antibodies. The comparison of the performance of the tested bacterins with the sorovars Canicola and/or Pomona, according to its concentration, by the proportions of surviving animals to the challenge assay and the average of the neutralizing antibodies titers, established a neutralizing antibodies titer equal or higher than 1,0log10 corresponding with the bacterins level of approval in the potency assay

Evaluation of the efficacy of a swine antileptospiral bacterin: relationship between the results of in vitro leptospiral growth inhibition test applied to swine sera with the ones in vivo potency test in hamsters

O controle da eficiência de bacterinas antileptospirose de uso animal é o teste de potência com desafio em hamsters, contudo, na atualidade, tem sido estimulada a busca de alternativas que dispensem o uso de animais de laboratório. O teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro (ICLIV) tem sido proposto como possível alternativa. O presente trabalho empregou os testes de ICLIV, soroaglutinação microscópica (SAM) e ELISA anti IgG para avaliar a intensidade e a duração da imunidade passiva em leitões em aleitamento e ativa em matrizes suínas e leitões desmamados imunizados com bacterina experimental antileptospirose aprovada no teste de potência em hamster. Foi produzida uma bacterina experimental antileptospirose com estirpe patogênica de Leptospira interrogans, sorovar Kennewicki, estirpe Pomona Fromm (LPF), padronizada para conter 109 leptospiras por mL e associada ao adjuvante de hidróxido de alumínio na proporção de 10% do volume da dose final. Para a avaliação da eficácia da concentração mínima de leptospiras a ser utilizada na bacterina, diluições seriadas de razão dez de cultivo de leptospiras variando de 105 a 109 leptospiras/mL, foram submetidas ao teste de potência com desafio em hamsters (Experimento A), apenas a bacterina produzida na concentração de 109 leptospiras/mL foi capaz de proteger os hamsters contra a infecção induzida pela estirpe LPF, quando a vacina foi testada na diluição de 1:800, critério internacional de aprovação. A bacterina na concentração de 109 leptospiras/mL foi submetida ao teste de potência em hamsters (Experimento B), imunizados com a vacina pura e em diluições seriadas de razão dois (200 a 25600). A bacterina foi aprovada no teste de desafio em hamster até a diluição de 1:6400. O controle do inóculo de desafio foi constituído por 100 DL50. Fêmeas suínas que nunca haviam sido vacinadas contra a leptospirose e que foram não reagentes no teste de soroaglutinação microscópica aplicado a leptospirose efetuado com 24 estirpes de referência e no teste ICLIV com a estirpe LPF (Experimento 1), receberam duas aplicações intervaladas de 30 dias e um reforço aos 210 da primeira dose da bacterina pura e em diluições seriadas de razão dois (400 a 3200). Estes animais foram 16 monitorados com colheitas de sangue efetuadas a cada 30 dias. Os picos máximos de anticorpos avaliados pelos testes de SAM e de ICLIV foram observados aos 30 dias da segunda aplicação da vacina, com maior magnitude para a vacina pura, contudo aos 120 dias da segunda aplicação da vacina houve um declínio acentuado nos níveis de anticorpos. Para encontrar um melhor intervalo entre as imunizações (Experimento 2), fêmeas suínas receberam duas aplicações da bacterina pura intervaladas de 30 dias e o reforço aos 150 da primeira dose. A redução do intervalo de revacinação após as duas doses iniciais determinou a persistência dos títulos de aglutininas e de anticorpos neutralizantes com níveis sempre superiores a 0,4 log. Nos leitões em aleitamento filhos das matrizes imunizadas com bacterina na concentração de 109 leptospiras/mL foi constatada a transferência de imunidade passiva, confirmada pelos títulos de anticorpos aglutinantes detectáveis no quinto dia de vida e de neutralizantes no quinto e décimo dia de vida. Nos ensaios realizados em leitões desmamados imunizados com uma série de diluições de razão dez variando de a 109 leptospiras/mL os picos máximos de anticorpos foram observados aos 30 dias da segunda imunização, com maior magnitude para a bacterina testada na concentração de 109 leptospiras/mL. Os parâmetros finalmente obtidos foram que matrizes suínas e leitões desmamados, primovacinados com duas aplicações intervaladas de 30 dias da bacterina aprovada no teste de potência com desafio em hamster, apresentaram no teste de ICLIV efetuado aos 60 dias da primo-vacinação, intervalos de títulos de anticorpos (95%) expressos em log variando, respectivamente de (0,87 a 1,35) e de (1,22 a 1,58). Os valores máximos (12.800) para o teste de ELISA anti IgG das matrizes suínas foram obtidos após o reforço efetuado aos 210 dias.The potency of antileptospirosis bacterins is controlled by in vivo experimental assay performed in hamsters; however, nowadays the search for in vitro methodologies that could replace the use of laboratory animals has been stimulated. For this purpose, the In vitro leptospiral growth inhibition test (IVLGIT) has been proposed as an alternative test. In this work, the intensity and duration of the passive immunity in suckling piglets and active immunity in weaned piglets and adult sows were evaluated, after vaccination with an experimental leptospirosis bacterin, which had been approved previously on the potency test in hamsters. The in vitro tests applied to swine sera were the growth inhibition test (IVLGIT), microscopic agglutination (MAT) and anti-IgG ELISA. The bacterin was produced with a pathogenic Leptospira interrogans serovar Kennewicki strain identified as Pomona Fromm (LPF), and added with aluminum hydroxide as adjuvant at a concentration of 10% of the final volume dose. In order to evaluate the efficacy of the minimum concentration of the leptospires to be used in the bacterin, ten-fold serial dilutions of a culture of leptospira varying from 105 to 109 leptospires/mL were submitted to potency-challenge test in hamsters (Trial A). Only the bacterin produced at the concentration of 109 leptospires/mL protected the hamsters against the infection by LPF strain, when the vaccine was tested at the dilution of 1:800, which is the international criterion for the approval. The bacterin at the concentration of 109 leptospires/mL was submitted to the potency test in hamsters (Trial B), which had been immunized with an undiluted and with two-fold serially diluted bacterin (from 1:200 to 1:25,600). In the challenge test in hamsters, the bacterin has passed till the dilution of 1:6,400. The control of the challenge inoculum presented a titer of 100 LD50. Adult sows, never been vaccinated against leptospirosis, and that showed negative MAT results using 24 reference serovars and with negative IVLGIT with the LPF strain (Trial 1) had administered two doses of bacterin with 30 day interval and a booster dose at 210th day after the first application of the undiluted bacterin and the two-fold diluted ones (1:400 to :3,200). The animals were 18 monitored with bleeding performed each 30 days. The levels of antibodies evaluated by MAT and IVLGIT showed the maximum peak at the 30th day after the second vaccination of the bacterin, with high magnitude found with the undiluted bacterin, however, at the 120th day after the second vaccination there were found a marked decline in antibodies levels. To find a better immunization scheme (Trial 2), the sows received two doses of undiluted bacterin with 30 day interval and the booster dose at the 150th day after the first dose. The reduction on the interval of revaccination after the two initial doses determined the persistence of a higher levels agglutinins and neutralizing antibodies with titers 0.4 log. In suckling piglets born from sows immunized with the bacterin at the concentration of 109 leptospires/mL, the passive transference of antibodies was confirmed by MAT titers detected on the fifth day, and by IVLGIT titers, at the fifth and tenth days after birth. In the study of weaned piglets immunized with the bacterin at the concentrations of 106, 107, 108 and 109 leptospires/mL (Trial 3), the highest antibodies levels were observed at the 30th day after the second immunization, with greater magnitude for the bacterin tested at the concentration of 109 leptospires/mL. The final results indicate that sows and weaned piglets, primo-vaccinated and revaccinated with 30 day interval with bacterin that had passed in the potency-challenge test in hamsters, presented the IVLGIT results varying (95% CI) from 0.87 log to 1.35 log for sows and 1.22 to 1.58 log for weaned piglets, at the 60th day after the first vaccination. In adult sows the highest anti-IgG ELISA titer reached 12,800, obtained after the booster vaccine dose performed at 210th day from the first vaccination