Clonagem e expressão de genes relacionados com a biossíntese de NAD e FAD de Mycoplasma hyopneumoniae

Bactérias do gênero Mycoplasma compreendem um grupo de mais de 200 espécies que se caracterizam principalmente por seu tamanho diminuto, ausência de parede celular e por serem parasitas obrigatórios de uma ampla gama de organismos incluindo humanos, plantas e animais. A espécie Mycoplasma hyopneumoniae encontra-se normalmente associada a suínos, causando uma doença respiratória denominada pneumonia enzoótica suína, que caracteriza-se por ser crônica porém não muito severa, podendo se agravar por infecções oportunistas de outras bactérias, gerando grandes perdas econômicas às indústrias suinícolas. Neste trabalho 3 genes que codificam proteínas anotadas como hipotéticas (MHP7448_0278, MHP7448_0394 e MHP7448_0476), e que revelaram a presença de motivos proteicos relacionados a atividades metabólicas, como a rota de biossíntese de FAD e NAD, respectivamente, foram selecionados, amplificados por PCR e clonados em vetores de expressão de Escherichia coli. A expressão, solubilidade e rendimento das proteínas recombinantes foram analisados. A clonagem com o gene MHP7448_0394 resultou em uma colônia recombinante. Para o gene MHP7448_0278 três colônias recombinantes foram obtidas e para o gene MHP7448_0476 a clonagem ainda não foi bem sucedida. A expressão ocorreu em linhagens de E. coli BL21 e foi induzida com a adição de IPTG. As melhores linhagens para a expressão da proteína codificada pelo gene MHP7448_0394 foram E. coli BL21 (DE3) pLysE e E. coli BL21 (DE3) Star, e para a proteína codificada pelo gene MHP7448_0278 as melhores cepas foram E. coli BL21 (DE3) pLysE e E. coli BL21 (DE3) CodonPlus Rill. O teste de solubilidade proteica foi realizado nas duas melhores linhagens de expressão de MHP7448_0394 e ambas mostraram a proteína na sua fração solúvel em condições padrões de indução, sendo então purificada a partir de cromatografia de afinidade. A proteína codificada pelo gene MHP7448_0278 mostrou-se insolúvel nas condições padrões. As proteínas purificadas terão suas estruturas analisadas e função caracterizada.Bacteria from Mycoplasma’s genus comprise a group of more than 200 species that are characterized mainly by their diminutive size, lack of cell wall and by their obligate parasites’ lifestyle of a wide range of organisms including humans, plants and animals. The species Mycoplasma hyopneumoniae is usually associated with pigs, causing a respiratory disease denominate swine enzootic pneumonia, which is characterized as chronic but not severe, and could be worsen by opportunistic infections of other bacteria, causing great economic losses to swine industries. In this work 3 genes that encodes for proteins annotated as hypothetical (MHP7448_0278, MHP7448_0394 and MHP7448_0476), which revealed the presence of protein motifs related to metabolic activities, such as the route of NAD and FAD biosynthesis, respectively, were selected, amplified by PCR and cloned into Escherichia coli expression vectors. Recombinant protein expression, solubility and yields were analyzed. The MHP7448_0394 gene cloning resulted in one recombinant colony. For the gene MHP7448_0278 three recombinant colonies were obtained, and for the MHP7448_0476, gene cloning has not yet been successful. The expression occurred in strains of E. coli BL21 and was induced with the addition of IPTG. The best strains for the protein encoded by the MHP7448_0394 gene were E. coli BL21 (DE3) pLysE and E. coli BL21 (DE3) Star and the protein encoded by the gene MHP7448_0278 the best strains are E. coli BL21 (DE3) pLysE and E. coli BL21 (DE3) CodonPlus Rill. The protein solubility test was conducted on the two best strains of MHP7448_0394 expression and both showed protein in the soluble fraction in standards induction conditions, that was then purified from affinity chromatography. The MHP7448_0278 gene protein proved to be insoluble under standards conditions. The purified proteins will have its structures reviewed and featured function analyzed

Compreendendo a dormência de gemas de macieira (Malus × domestica Borkh.) por meio da integração de estímulos externos, sinalização hormonal e mecanismos moleculares

Plantas perenes cultivadas em climas temperados adquiriram ao longo do processo evolutivo um mecanismo adaptativo chamado de dormência o qual permite a sua sobrevivência em condições adversas de crescimento. Em macieira (Malus × domestica Borkh), a indução e a liberação da dormência são finamente reguladas e abrangem diversos aspectos que vão desde a percepção da célula ao frio até as respostas moleculares que desencadeiam os eventos fisiológicos. Sabendo-se da complexa rede regulatória por trás desse controle, o presente estudo visou contribuir com o seu entendimento por meio da caracterização dos genes MdoCBFs e MdoICE1, envolvidos nas vias de aclimatação ao frio, bem como dos genes MdoBRRs, fatores de transcrição responsáveis por modular a resposta dependente de citocinina (CK), um importante hormônio vegetal promotor do crescimento. O estudo contou com a avaliação de um conjunto de dados contendo perfis transcricionais, quantificações hormonais e ensaios de transativação in vivo usando protoplastos de Arabidopsis. Os dados revelaram que, ao longo do ciclo da dormência, os genes MdoCBF2 e MdoCBF4 são expressos somente durante a fase inicial da endodormência enquanto que os genes MdoBRR1 e MdoBRR8 tem sua expressão acentuada em uma fase posterior, que engloba a transição da endo- para a ecodormência. Além disso, o aumento de transcritos dos genes MdoBRRs é concomitante com a regulação negativa de MdoDAM1, importante gene envolvido na manutenção da dormência. Nesta mesma fase, há um incremento nos níveis de CK, seguido de um aumento na quantidade de giberelina (GA) e redução drástica da expressão dos genes MdoCBFs. O antagonismo entre os perfis trancricionais de MdoBRRs e MdoDAM1 também foi revelado em gemas ecodormentes tratadas com CK, onde houve aumento nos níveis de transcritos de MdoBRR9 e MdoBRR10 e diminuição da expressão de MdoDAM1. De maneira similar, ensaios de transativação in vivo permitiram mostrar que ambos os estímulos de CK e as expressões transientes de MdoBRR1, MdoBRR8 ou MdoBRR10 levaram à modulação negativa de MdoDAM1. Por meio da mesma técnica, foi possível observar que os genes MdoCBF4 e MdoCBF5 são modulados de forma dependente de frio mas independente do ativador transcricional codificado por MdoICE1. Por fim, os dados foram integrados em um modelo hipotético que indica uma via de regulação bem orquestrada mediada tanto por MdoCBFs e GA quanto por MdoBRRs e CK que, respectivamente, levam à ativação e à repressão de MdoDAM1, um regulador-chave da dormência de gemas.Throughout the evolutionary process, temperate perennial plants developed an adaptive mechanism called dormancy that allows their survival in adverse growth conditions. In apple trees (Malus × domestica Borkh), the induction and release of dormancy is finely regulated and covers several aspects, ranging from cold perception by cells to molecular responses that trigger physiological events. Knowing that dormancy control is dependent of complex network, the present study aimed to contribute to its understanding by the characterization of the MdoCBFs and MdoICE1 genes involved in cold acclimation pathways, as well as the MdoBRRs genes encoding transcription factors responsible for modulating cytokinin (CK)- dependent genes. The study inferences were based on transcriptional profiles, hormonal quantifications and in vivo transactivation assays using Arabidopsis protoplasts. The data revealed that, throughout the dormancy cycle, the MdoCBF2 and MdoCBF4 genes were expressed only during the initial phase of endodormancy while the MdoBRR1 and MdoBRR8 genes have their transcription enhanced in a later stage, along the transition from endo- to ecodormancy. Moreover, the increase in MdoBRR transcript levels was concomitant with the negative regulation of MdoDAM1, an important gene involved in dormancy maintenance. At this same stage, high levels of CK, followed by increased amounts of gibberellins (GA) and drastic decrease in MdoCBFs expression were also observed. The antagonism between the transcriptional profiles of MdoBRRs and MdoDAM1 was also revealed in ecodormant buds treated with CK, which presented higher transcript levels of MdoBRR9 and MdoBRR10 genes along with a decrease in MdoDAM1 expression. Similarly, in vivo transactivation assays showed that both CK stimulus and transient expression of MdoBRR1, MdoBRR8 or MdoBRR10 led to the negative modulation of MdoDAM1. With the same technique, it was possible to observe that MdoCBF4 and MdoCBF5 genes were modulated in a colddependent manner but independently of the transcriptional activator encoded by MdoICE1. Finally, the present data were integrated into a hypothetical model that indicates a wellorchestrated pathway mediated by MdoCBFs and GA as well as by MdoBRRs and CK, which respectively lead to activation and repression of MdoDAM1, a key regulator of bud dormancy

Elementos repetitivos na regulação da transcrição de Mycoplasma hyopneumoniae

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria de tamanho diminuto, caracterizada por um genoma pequeno, com baixo conteúdo GC. Está associada com doenças respiratórias de suínos, resultando em prejuízos produtivos e econômicos na indústria animal. A presença de sequências de DNA repetitivas, que ocorrem em grandes quantidades em células eucarióticas, vem sendo cada vez mais identificadas em genomas de procariotos, sendo também associadas a um potencial papel regulador. Uma vez que a regulação da transcrição nesses organismos ainda é pouco entendida, o objetivo do presente estudo foi realizar uma busca in silico por elementos repetitivos nas regiões intergênicas do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Dois tipos de repetições foram selecionados para a busca inicial: tandem e palindromes. Regiões intergênicas de até 500 pb a montante do sítio de início da tradução de todas as CDSs do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448 foram utilizadas para a predição. Para cada tipo de elemento dois programas computacionais independentes foram utilizados. As predições in silico resultaram em 144 repetições em tandem e 1.171 palindromes. O DNA repetitivo se encontra distribuído a montante de 86% das unidades transcricionais de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Análises comparativas entre genomas de micoplasmas demonstraram diferentes níveis de conservação dos elementos repetitivos entre linhagens patogênicas e não-patogênicas. Linhagens patogênicas revelaram uma conservação de 59%, enquanto que a não patogênica, somente de 46%. Através de ensaios de amplificação quantitativa de DNA, foi observado diferentes níveis de expressão em genes codificantes para importantes proteínas, como glicina hidroximetiltransferase, lipoproteína, adesinas e proteína ligadora de GTP. Os genes codificantes para essas proteínas divergiam no número de repetições palindromes e tandens na sua respectiva região intergênica. Além disso, repetições encontradas em 206 genes já descritos como regulados em diferentes condições em M. hyopneumoniae linhagem 232 mostraram aproximadamente 80% de conservação em relação à linhagem M. hyopneumoniae linhagem 7448. Todos esses resultados sugerem um potencial papel regulador das repetições de DNA em tandem e palindromes em Mycoplasma.Mycoplasma hyopneumoniae is a diminutive bacterium, characterized by a small genome with a low GC content. It is commonly associated with swine respiratory diseases, resulting in productivity and economic losses in the animal industry. Repetitive DNA, which occurs in large quantities in eukaryotic cells, has been increasingly identified in prokaryotic genomes, and has been associated with a potential regulatory function. Once transcription regulation in these organisms is still poorly understood, the aim of the current study was to perform an in silico search of repeat elements in the genomic intergenic regions of M. hyopneumoniae strain 7448. Two types of repeats were selected for initial search: Tandem and Palindromic. Intergenic regions up to 500 bp upstream from start codon of M. hyopneumoniae strain 7448 CDSs were used as input for the software’s prediction. For each type of repeat sequence, two independent software packages were used. Computational analysis results in 144 tandem repeats and 1,171 palindrome elements. The repeats were distributed in the upstream region of 86% of transcriptional units of M. hyopneumoniae strain 7448. Comparative analysis between distinct mycoplasmas, demonstrate different indices of repeat conservation among pathogenic and non-pathogenic strains. Pathogenic strains revealed 59% conservation, while non-pathogenic only 46%. Through assays of quantitative amplification of DNA, different levels of expression in genes coding important proteins have been demonstrated, as glycine hydroxymethyltransferase, lipoprotein, adhesins and GTP-binding protein. These protein coding genes differ in number of palindromes or tandem repeats in respective upstream regions. In addition, repeats found in 206 genes already described to be regulated in different grow conditions in M. hyopneumoniae strain 232 showed almost 80% of conservation in relation to M. hyopneumoniae strain 7448. All these findings, suggests a potential regulatory role of tandem and palindrome DNA repeats

Repetitive Elements in <i>Mycoplasma hyopneumoniae</i> Transcriptional Regulation

<div><p>Transcriptional regulation, a multiple-step process, is still poorly understood in the important pig pathogen <i>Mycoplasma hyopneumoniae</i>. Basic motifs like promoters and terminators have already been described, but no other cis-regulatory elements have been found. DNA repeat sequences have been shown to be an interesting potential source of cis-regulatory elements. In this work, a genome-wide search for tandem and palindromic repetitive elements was performed in the intergenic regions of all coding sequences from <i>M</i>. <i>hyopneumoniae</i> strain 7448. Computational analysis demonstrated the presence of 144 tandem repeats and 1,171 palindromic elements. The DNA repeat sequences were distributed within the 5’ upstream regions of 86% of transcriptional units of <i>M</i>. <i>hyopneumoniae</i> strain 7448. Comparative analysis between distinct repetitive sequences found in related mycoplasma genomes demonstrated different percentages of conservation among pathogenic and nonpathogenic strains. qPCR assays revealed differential expression among genes showing variable numbers of repetitive elements. In addition, repeats found in 206 genes already described to be differentially regulated under different culture conditions of <i>M</i>. <i>hyopneumoniae</i> strain 232 showed almost 80% conservation in relation to <i>M</i>. <i>hyopneumoniae</i> strain 7448 repeats. Altogether, these findings suggest a potential regulatory role of tandem and palindromic DNA repeats in the <i>M</i>. <i>hyopneumoniae</i> transcriptional profile.</p></div

Influence of repeat composition on mycoplasma gene expression.

<p>Influence of repeat composition on mycoplasma gene expression.</p

Pipeline of tandem repeat comparison analysis among mycoplasma genomes.

<p>An example of nonconserved SSR between <i>M</i>. <i>hyopneumoniae</i> strain 7448 (MHP_7448), and <i>M</i>. <i>hyopneumoniae</i> strain J (MHP_J) can be observed above. A (TAT)₉ repeat found in the MHP_7448 gene intergenic region was classified as nonconserved, as a (TAT)₁₁ repeat was localized in the respective orthologous intergenic region in MHP_J. Abbreviations: <i>M</i>. <i>hyopneumoniae</i> strain 7422 (MHP_7422); <i>M</i>. <i>flocculare</i> (MFL). *First CDS of the transcription unit.</p