The HOG MAPK pathway in Candida albicans: more than an osmosensing pathway.

In 1993, Brewster and Gustin described the existence of a kinase whose activity was essential for Saccharomyces cerevisiae to grow in environments with high osmolarity. This led to the discovery of the HOG pathway, a MAP kinase (MAPK) pathway that has been revealed to be crucial to respond to a wide range of stress conditions frequently encountered by fungi in their common habitats. MAPK signaling is initiated at the plasma membrane, where triggering stimuli lead to a phosphorylation cascade that ultimately activates transcription factors to ensure an appropriate adaptive response. In pathogenic fungi, the HOG pathway gains special significance as it is involved in traits related to pathogenicity; these include biofilm formation, adhesion to surfaces, and morphogenetic and epigenetic transitions. It also plays a role in controlling both the pathogen and the commensal state program. Understanding the signals leading to its activation, the elements of the pathways and the targets of the pathway are therefore of primary importance in the design of novel antifungals

Implementation of a CRISPR-Based System for Gene Regulation in Candida albicans.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) methodology is not only an efficient tool in gene editing but also an attractive platform to facilitate DNA, RNA, and protein interactions. We describe here the implementation of a CRISPR-based system to regulate expression in the clinically important yeast By fusing an allele of Cas9 devoid of nuclease activity to a transcriptional repressor (Nrg1) or activator (Gal4), we were able to show specific repression or activation of the tester gene , encoding the cytosolic catalase. We generated strains where a 1.6-kbp upstream regulatory region of controls the expression of the green fluorescent protein (GFP) and demonstrated the functionality of the constructs by quantitative PCR (qPCR), flow cytometry, and analysis of sensitivity/resistance to hydrogen peroxide. Activation and repression were strongly dependent on the position of the complex in this regulatory region. We also improved transcriptional activation using an RNA scaffolding strategy to allow interaction of inactive variants of Cas9 (dCas9) with the RNA binding protein MCP (monocyte chemoattractant protein) fused to the VP64 activator. The strategy shown here may facilitate the analysis of complex regulatory traits in this fungal pathogen. CRISPR technology is a new and efficient way to edit genomes, but it is also an appealing way to regulate gene expression. We have implemented CRISPR as a gene expression platform in using fusions between a Cas9 inactive enzyme and specific repressors or activators and demonstrated its functionality. This will allow future manipulation of complex virulence pathways in this important fungal pathogen

The Glyoxylate Cycle Is Involved in White-Opaque Switching in Candida albicans

Candida albicans is a commensal yeast that inhabits the gastrointestinal tract of humans. The master regulator of the white-opaque transition WOR1 has been implicated in the adaptation to this commensal status. A proteomic analysis of cells overexpressing this transcription factor (WOR1OE) suggested an altered metabolism of carbon sources and a phenotypic analysis confirmed this alteration. The WOR1OE cells are deficient in using trehalose and xylose and are unable to use 2C sources, which is consistent with a reduction in the amount of Icl1, the isocitrate lyase enzyme. The icl1∆/∆ mutants overexpressing WOR1 are deficient in the production of phloxine B positive cells, a main characteristic of opaque cells, a phenotype also observed in mating type hemizygous mtla1∆ icl1∆/∆ cells, suggesting the involvement of Icl1 in the adaptation to the commensal state. In fact, icl1∆/∆ cells have reduced fitness in mouse gastrointestinal tract as compared with essentially isogenic heterozygous ICL1/icl1∆, but overproduction of WOR1 in an icl1∆/∆ mutant does not restore fitness. These results implicate the glyoxylate shunt in the adaptation to commensalism of C. albicans by mechanisms that are partially independent of WOR1

Implementación de informes de prácticas virtuales de Microbiología Clínica y construcción de un banco de imágenes para facilitar el aprendizaje de esta asignatura

El proyecto se ha desarrollado según lo previsto y se han alcanzado de manera muy satisfactoria los objetivos propuestos, generándose informes virtuales de prácticas de Microbiología Clínica de 4º de Farmacia y un banco de fotografías de pruebas microbiológicas. La realización de este proyecto ha resultado de gran interés para los estudiantes, repercutiendo además de forma positiva en sus calificaciones y no representando una carga de trabajo adicional excesiva. Para los profesores y otros miembros del equipo del proyecto también ha supuesto una experiencia muy gratificante y el material generado puede ahora tener múltiples aplicaciones docentes

Identification of Clinical Isolates of Candida albicans with Increased Fitness in Colonization of the Murine Gut

The commensal and opportunistic pathogen Candida albicans is an important cause of fungal diseases in humans, with the gastrointestinal tract being an important reservoir for its infections. The study of the mechanisms promoting the C. albicans commensal state has attracted considerable attention over the last few years, and several studies have focused on the identification of the intestinal human mycobiota and the characterization of Candida genes involved in its establishment as a commensal. In this work, we have barcoded 114 clinical C. albicans isolates to identify strains with an enhanced fitness in a murine gastrointestinal commensalism model. The 114 barcoded clinical isolates were pooled in four groups of 28 to 30 strains that were inoculated by gavage in mice previously treated with antibacterial therapy. Eight strains that either exhibited higher colonization load and/or remained in the gut after antibiotic removal were selected. The phenotypic analysis of these strains compared to an RFP-tagged SC5314 wild type strain did not reveal any specific trait associated with its increased colonization; all strains were able to filament and six of the eight strains displayed invasive growth on Spider medium. Analysis of one of these strains, CaORAL3, revealed that although mice required previous bacterial microbiota reduction with antibiotics to be able to be colonized, removal of this procedure could take place the same day (or even before) Candida inoculation. This strain was able to colonize the intestine of mice already colonized with Candida without antibiotic treatment in co-housing experiments. CaORAL3 was also able to be established as a commensal in mice previously colonized by another (CaHG43) or the same (CaORAL3) C. albicans strain. Therefore, we have identified C. albicans isolates that display higher colonization load than the standard strain SC5314 which will surely facilitate the analysis of the factors that regulate fungal colonization

Non-canonical Activities of Hog1 Control Sensitivity of Candida albicans to Killer Toxins From Debaryomyces hansenii

Certain yeasts secrete peptides known as killer toxins or mycocins with a deleterious effect on sensitive yeasts or filamentous fungi, a common phenomenon in environmental species. In a recent work, different () strains isolated from a wide variety of cheeses were identified as producing killer toxins active against and . We have analyzed the killer activity of these toxins in mutants defective in MAPK signaling pathways and found that the lack of the MAPK Hog1 (but not Cek1 or Mkc1) renders cells hypersensitive to mycocins while mutants lacking other upstream elements of the pathway behave as the wild type strain. Point mutations in the phosphorylation site (T174A-176F) or in the kinase domain (K52R) of gene showed that both activities were relevant for the survival of to killer toxins. Moreover, Hog1 phosphorylation was also required to sense and adapt to osmotic and oxidative stress while the kinase activity was somehow dispensable. Although the addition of supernatant from the killer toxin- producing 242 strain (-242) induced a slight intracellular increase in Reactive Oxygen Species (ROS), overexpression of cytosolic catalase did not protect against this mycocin. This supernatant induced an increase in intracellular glycerol concentration suggesting that this toxin triggers an osmotic stress. We also provide evidence of a correlation between sensitivity to -242 killer toxin and resistance to Congo red, suggesting cell wall specific alterations in sensitive strains

Diseño, desarrollo y elaboración de un soporte informático interactivo para el estudio de las prácticas de la asignatura de Microbiología Clínica mediante el uso de imágenes reales de pruebas microbiológicas obtenidas en el laboratorio

En las diferentes clases prácticas relacionadas con asignaturas de Microbiología, como sucede en otras áreas de conocimiento, un aspecto que requiere especial atención es el diseño y la elaboración de herramientas que contribuyan a facilitar y mejorar el aprendizaje por parte del alumnado de los múltiples conceptos microbiológicos que se imparten en las mismas, facilitando en lo posible la enseñanza no presencial. En este sentido, pensamos que la existencia de un soporte virtual interactivo de los distintos abordajes prácticos realizados en el laboratorio y sus posibles resultados facilitaría en gran medida el estudio, y por tanto, la adquisición de las competencias correspondientes a la docencia práctica de Microbiología. En los dos cursos académicos anteriores (2017/18 y 2018/19), a través de sendos proyectos UCM-INNOVA (Proyectos 161 y 76, respectivamente), se ha recopilado, con la participación activa de los alumnos, una gran cantidad de información gráfica de toda la labor práctica realizada durante la impartición de las asignaturas incluidas en diversas titulaciones, habiéndose generado de esta manera un amplio banco de imágenes de calidad para diversos usos docentes. El proyecto realizado (UCM-INNOVA 19/20 Proyecto 11), ha consistido en el diseño, generación e implementación de una herramienta informática en entorno PowerPoint, a la que hemos denominado EMC (Evaluación Microbiología Clínica), que pone en valor todo el esfuerzo realizado por parte del profesorado y los alumnos en los proyectos anteriores, en relación a la asignatura de Microbiología Clínica del 4º curso del Grado en Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid. En la aplicación EMC se ha incluido y estructurado cada práctica concreta siguiendo la misma organización realizada en el laboratorio, donde se sigue una rutina secuencial y jerárquica en la que el alumno debe interpretar los resultados posibles, fundamentalmente presentados en formato gráfico, de cada una de las pruebas realizadas según el tipo/s de microorganismo/s implicados, siendo redirigido a otro panel de pruebas cada vez más específicas hasta completar cada una de las prácticas. Esta herramienta se ha mostrado útil, no sólo para facilitar el estudio y el aprendizaje de los contenidos temáticos prácticos, sino también para servir de soporte y complemento al estudio del programa teórico de la asignatura. Es importante destacar que, durante las prácticas de Microbiología Clínica se explican los síndromes clínicos relacionados con las enfermedades infecciosas más frecuentes y su diagnóstico microbiológico, incluyendo desde la obtención y procesamiento de las muestras biológicas problema, hasta su posterior análisis microbiológico diferencial con el objeto de identificar a los potenciales microorganismos patógenos responsables de cada cuadro. Tras la realización de cada práctica, las pruebas microbiológicas deben ser adecuadamente eliminadas, no pudiendo guardarse las pruebas de forma indefinida. Por lo tanto, poder revisitar cuantas veces sea necesario por el alumno todas las pruebas y sus correspondientes resultados e interpretación de forma sencilla y visual en un entorno amigable (tipo presentación PowerPoint), supone un apoyo al estudio y al aprendizaje. Finalmente, pensamos que es importante remarcar que incluso en Universidades donde la metodología docente es eminentemente presencial, el desarrollo y utilización de forma complementaria de herramientas que faciliten el aprendizaje on-line es crucial en los tiempos que vivimos, cómo ha dejado patente la pandemia de la COVID-19

Elaboración de informes virtuales de prácticas de Microbiología general, odontológica e industrial basados en fotografías y su integración en un banco común de imágenes de Microbiología

Este proyecto, que se platea como continuación del número 161 del curso 2016-2017, propone la creación y realización de informes de prácticas virtuales en distintas asignaturas del área de la Microbiología. Con ello, se pretende incentivar el estudio y mejorar el aprovechamiento de las prácticas realizadas por alumnos de distintos cursos, Grados y Facultades, mediante el uso de las nuevas tecnologías y metodologías más visuales. Dichas asignaturas son: • Microbiología e Inmunología, 2º curso Grado de Odontología, Facultad de Odontología. • Microbiología, 3º curso Grado en Farmacia, Facultad de Farmacia. • Microbiología Industrial y biotecnología (MIBT), 2º curso Grado en Ciencia y Tecnología de los alimentos (CYTA), Facultad de Veterinaria. Se han construido 4 espacios virtuales con plantillas de los informes de prácticas, ya que el proyecto se realizó en 4 grupos distintos. De esta forma se tendrían guías virtuales de las distintas asignaturas con la inclusión de las fotografías y su interpretación. También se comprobaría la utilidad de esta metodología según la estructura de las prácticas de las asignaturas y/o la idiosincrasia de los distintos grupos de alumnos. El otro objetivo general del proyecto es el almacenamiento y clasificación de las fotografías realizadas para ampliar el banco de fotografías de microorganismos y pruebas microbiológicas. Esto, también justifica la elección de las 3 asignaturas mencionadas. El proyecto se ha desarrollado según lo previsto y se han alcanzado de manera satisfactoria los objetivos propuestos. Además, aunque de forma desigual según las asignaturas, la realización de este proyecto ha resultado de interés para los estudiantes, repercutiendo de forma positiva en algunas calificaciones y no representando una carga de trabajo adicional excesiva. Para los profesores y otros miembros del equipo del proyecto también ha supuesto una experiencia gratificante y el material generado puede ahora tener múltiples aplicaciones docentes. Por lo tanto, está metodología se podrá seguir utilizando si los profesores así lo desean en las prácticas de las asignaturas en las que haya presentado mayor utilidad.Depto. de Microbiología y ParasitologíaFac. de FarmaciaFALSEsubmitte

Cine en compañía para prevenir enfermedades

El proyecto “Cine en compañía para prevenir enfermedades” es continuación del proyecto iniciado en 2017 (INNOVA-Docencia 18/2018, ApS-UCM 18/2019) y se encuadra en el campo de Salud Pública, higiene y prevención de enfermedad, dirigido a personas desfavorecidas o en riesgo de exclusión social. En esta edición se ha ampliado el área de conocimiento y profesores participantes, incluyendo no solo enfermedades infecciosas, como en ediciones anteriores, sino otras del ámbito de la Bioquímica y Biología Molecular. El proyecto es multidisciplinar e interfacultativo (21 tutores: profesores, colaboradores postdoctorales, doctorandos, estudiantes participantes en ediciones anteriores y técnico de laboratorio, de las Facultades de Farmacia, Biología y Medicina y del Hospital 12 de Octubre) y en él han participado 41 estudiantes de distintos Grados (Biología, Bioquímica, Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Derecho, Farmacia, Ingeniería Electrónica) y Postgrados (Máster en Biología Sanitaria, y en Microbiología y Parasitología: Investigación y Desarrollo; Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular) y participantes en la asignatura Transversal “Ciencia para la Sociedad”. La necesidad social detectada y atendida es la situación de algunos colectivos, por ejemplo, personas sin hogar, mujeres en exclusión, adictos a drogas, presidiarios o familias residentes en áreas no salubres, de una mayor exposición a determinadas enfermedades debido a sus condiciones de vida (enfermedades infecciosas, mentales, metabólicas derivadas de adicciones o alcoholismo), además de que encuentran escasas posibilidades de conocer cómo prevenirlas y la forma adecuada de recibir tratamiento. Adicionalmente, y no menos importante, acusan una carencia severa de compañía, atención y escucha de sus necesidades. Los estudiantes de universidad que cursan estudios en el campo de Ciencias y Ciencias de la Salud estudian estas enfermedades, por lo que pueden ayudar a estos colectivos en la mejora de prácticas higiénico-sanitarias, así como al acceso a la información para su prevención y tratamiento. Las actividades desarrolladas en el proyecto han consistido en el acompañamiento y desarrollo de una actividad lúdica mediante la proyección de películas comerciales que traten una enfermedad de interés en el colectivo a atender, seguida de coloquio para ayudar a conocer las formas adecuadas de prevención y tratamiento. Los equipos de 4-5 estudiantes (de distintas titulaciones y cursos) y dos tutores (senior y junior) han realizado varias visitas a centros sociales atendidos por Fundaciones con las que existe convenio de la UCM (centros de día para personas sin hogar, mujeres en exclusión, discapacitados o presidiarios, gestionados por Cáritas, Hogar-Sí, Diaconía, Medinacelli). Han investigado en profundidad las enfermedades que afectan y de interés del grupo atendido, seleccionado y analizado críticamente películas adecuadas, preparado materiales divulgativos (carteles, juegos) y diseñado y analizado encuestas para evaluar su actividad por parte de las personas atendidas y los coordinadores de los centros. Los resultados de las encuestas a todos los participantes (tutores, estudiantes, centros) y la recogida de opiniones y memorias de los estudiantes muestran una alta consecución de los objetivos de aprendizaje previstos, refuerzo de contenidos específicos de los estudios y, sobre todo, trabajo y adquisición de competencias transversales como trabajo en equipo, coordinación y asunción de responsabilidades, análisis crítico o expresión científica divulgativa. En cuanto a los objetivos de servicio, destaca la utilidad del proyecto en atención e información a los colectivos, la aplicación de los estudios a situaciones reales en atención a personas desfavorecidas y el valor social del proyecto