Efeito da homogeneização à alta pressão na atividade e estabilidade de enzimas

Orientador: Marcelo CristianiniTexto em português e inglêsTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: A homogeneização à alta pressão (HAP) é uma operação unitária capaz de alterar a conformação e, consequentemente a funcionalidade de polissacarídeos,proteínas e enzimas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da HAP na atividade e estabilidade de cinco enzimas comerciais com aplicação na indústria de alimentos (x-amilase de Aspergillus niger, protease neutra de Bacillus subtilis, b-galactosidase de Kluyveromyces lactis, amiloglicosidase de A. niger e glicose oxidase de A. niger). Para cada enzima, a atividade foi avaliada antes e após a HAP (até 200 MPa) em diferentes temperaturas e pH. Além disso, a reversibilidade dos efeitos do processo foi determinada indiretamente através da medida de atividade da enzima após um período de repouso. Os resultados de x-amilase demonstraram que a enzima é altamente estável ao processo de HAP (em pressões de até 150 MPa), independentemente do pH e temperatura de processo e da ausência de cálcio no tampão de diluição da enzima. Os resultados da b-galactosidase, por outro lado, mostraram que a enzima é pouco estável, apresentando redução da atividade (~30%) após HAP a 150 MPa quando processadas em pH não ótimo para atividade da enzima. Os resultados obtidos para a protease neutra, amiloglicosidase e glicose oxidase indicaram que o efeito da HAP foi dependente dos parâmetros utilizados no processo (pH, temperatura e pressão de homogeneização) e das condições utilizadas na medida de atividade (pH, temperatura e tempo de estocagem). Para estas três enzimas, significativos ganhos de atividade e/ou estabilidade foram observados para pelo menos uma das condições avaliadas, sendo que os mais importantes foram: (i) redução da temperatura ótima de atividade da protease neutra de 55 para 20ºC após HAP a 200 MPa, (ii) aumento da atividade da glicose-oxidase à 75ºC após HAP a 150 MPa, (iii) aumento da atividade residual entre 100 e 400% após armazenamento refrigerado de glicose-oxidase homogeneizada em diferentes pressões, (iv) aumento da atividade de amiloglicosidase à 80ºC após a HAP a 100 MPa. A reversibilidade das alterações observadas foi inferida pela avaliação da atividade da enzima após um período de repouso, sendo as alterações determinadas como reversíveis (protease neutra, glicose-oxidase, amiloglicosidase) ou irreversíveis (protease neutra, glicose-oxidase, b-galactosidase) em função dos parâmetros de processo. O efeito de processamentos sequenciais sobre a glicose oxidase, a protease e a amiloglicosidase também foi avaliado e os resultados demonstraram que, para a maioria das condições estudadas, a atividade da enzima se manteve igual à obtida após o primeiro ciclo de homogeneização ou apresentou uma redução. Uma exceção foram os resultados da glicose oxidase homogeneizada a 150 MPa por 3 vezes, que apresentou aumento de atividade de aproximadamente 150% em relação à enzima nativa. A partir dos resultados, conclui-se que o efeito da HAP é diferente para cada enzima e que as maiores alterações ocorrem em condições de atividade não ótima e para enzimas de estruturas mais complexas, como é o caso da glicose oxidase. Os resultados obtidos apresentam aplicação direta, para modificação e melhoria do desempenho de enzimas comerciais, e preenchem uma lacuna científica importante sobre o conhecimento dos efeitos do processo de HAP em enzimasAbstract: High pressure homogenization (HPH) is a unitary operation capable to alter the conformation and, consequently, the functionality of polyssacharides, proteins and enzymes. This work aimed to study the HPH effects on activity and stability of five commercial enzymes intensively applied in food industry (x-amylase from Aspergillus niger, b-galactosidase from Kluyveromyces lactis, neutral protease from Bacillus subtilis, amyloglucosidase from A. niger and glucose-oxidase from A. niger). The activity of each enzyme was studied before and after HPH process (up to 200 MPa) at different temperatures and pH. Moreover, the process reversibility was indirectly determined by the activity measured after a rest period under refrigeration (8ºC).The results revealed that x-amylase was highly stable to HPH up to 150 MPa,independent on the pH or temperature used in the HPH process or the presence of calcium in buffer. On the other hand, the results of b-galactosidase indicated that enzyme was partially inactivated (~ 30%) after homogenization at 150 MPa when processed at non optimum pH. The HPH effects on neutral protease, amyloglucosidase (AMG) and glucose oxidase (GO) were dependent on the process parameters (pH, temperature and homogenization conditions) and the activity measurement conditions (pH, temperature and storage time). For these enzymes, it was observed activity and/or stability improvement after some process. The main improvements were: (i) change of the optimum temperature of neutral protease from 55 to 20ºC after HPH at 200 MPa, (ii) improvement of GO activity at 75ºC after HPH at 150 MPa, (iii) enzyme activity improvement between 100 and 400% after GO refrigerated storage, (iv) improvement on amyloglucosidase activity at 80ºC after HPH at 100 MPa. The reversibility of the HPH effects was evaluated after a rest period.The reversibility was dependent on the process parameters; but, in general, neutral protease, GO and AMG were reversible, while the results of neutral protease, GO and b-galactosidase were irreversible. The effects of sequential homogenization processes (sequential passes) on GO, AMG and neutral protease were evaluated and the results showed that the enzyme activity remained equal or reduced after 2 or 3 cycles of homogenization. An exception was the result obtained for GO homogenized at 150 MPa, which showed an activity improvement of 150% after three passes. The results evaluation of this research showed that HPH effects on enzymes were different for each enzyme. The main alterations occured at non optimum condition of enzyme activity and for enzymes with complex structure as the GO. The obtained results can be directly applied for improvement of enzyme industrial production. Also, the results enriched the scientific knowledge about the HPH effects on enzymesDoutoradoTecnologia de AlimentosDoutora em Tecnologia de Alimento

Aspergillus niger inactivation in mango nectar by dynamic high pressure combined with mild heat treatment

Orientadores: Marcelo Cristianini, Pilar Rodriguez de MassaguerDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: O néctar de manga é apreciado por sua cor e aroma. Este produto, pela sua alta acidez, pode ser contaminado por bolores, dentre os quais são de grande relevância aqueles capazes de sobreviver ao processamento térmico. O processamento a alta pressão dinâmica (APD) é um tratamento ¿a frio¿ realizado para inativação de microrganismos visando uma melhor qualidade sensorial e nutricional do produto obtido. Neste estudo, avaliou-se o efeito do processamento a APD isoladamente ou combinado com tratamento térmico (TT) brando na inativação de Aspergillus niger em néctar de manga e, posteriormente, foi realizada a avaliação do efeito dos processos sobre a cor e a concentração de vitamina C do néctar. Paralelamente foi desenvolvida uma metodologia para limpeza e sanificação do equipamento e um processo para a redução de viscosidade do néctar de manga. Foram estudadas pressões entre 100 e 300 MPa para a inativação do Aspergillus niger. A pressão de 300 MPa inativou toda a carga inicial (> 6,24 reduções decimais), 200 MPa provocou uma inativação parcial (aproximadamente 2 ciclos) e, pressões inferiores a 150 MPa não resultaram em inativação significativa do A. niger. Quando o processo de APD foi associado à TT brando (80ºC/15minutos) foi observado um efeito sinérgico entre pré tratamento a APD e posterior TT (aproximadamente 1 ciclo logaritmo); já quando utilizado pré TT seguido de tratamento a APD, foi observado apenas um efeito aditivo. Utilizando-se aplicação de APD seguida de TT, foi realizado um planejamento experimental fixando-se a pressão em 200 MPa e variando-se temperatura e tempo do TT e ratio do néctar de manga (brix/acidez), de forma a obter um modelo que descrevesse o processo. Os resultados indicaram que tempo e temperatura afetaram positivamente a inativação e o ratio do néctar afetou negativamente. A partir do modelo foram estabelecidos que processos a 200 MPa seguido de TT a 73,5ºC/10 minutos ou 61,5ºC/20 minutos eram suficientes para obter 5 reduções decimais do bolor. A avaliação desses processos combinados, do processo térmico tradicional (100ºC/10 minutos) e do processo utilizando apenas pressão (300 MPa) sobre o conteúdo de vitamina C e cor do néctar demonstrou uma inativação de vitamina C muito similar para todos os processos (perdas de aproximadamente 45%) e uma melhor retenção de cor para os produtos processados à APD. O desenho do processo de limpeza e sanificação para o equipamento foi considerado eficaz uma vez que reduziu para 6.24 decimal reduction), 200 MPa caused a partial inactivation (2 log cycles) and pressures up to 150 MPa did not inactivate the mold. A synergistic effect was observed when pre treatment of DHP was associated to mild TT (80ºC/ 15 minutes) with increase of 1 log cycle on mold inactivation. However, only an additive effect was observed when pre TT was associated to DHP. An experimental design was carried out using fixed pressure of 200 Mpa followed by mild TT. Temperature and time of thermal treatment and ratio of mango nectar (brix/acidity) was select as experimental design variables. The results indicated that time and temperature affected positively and nectar ratio affected negatively the mold inactivation. By the mathematical model, process of 200 MPa followed by 73.5ºC/10 minutes or by 61.5ºC/20 minutes was able to promote 5 decimal reduction of A. niger. The effect of these processes, the conventional heat and DHP at 300 MPa on vitamin C concentration and nectar color retention was evaluated. The vitamin C losses were around 45% for all processes studied but better color retention was observed on the nectar processed by DHP. The CIP design was considered efficient once it was able to reduce the initial load of A. niger from ~106 CFU.mL-1 to <1 CFU.mL-1. 2.5% of a commercial detergent (active agents: sodium toluenosulfonate and didecylmethilamonium chlorine) and peracetic acid at 0.05% were used in this process. The nectar viscosity reduction was effective by using pectic enzymes and celullase, being able to reduce natural mango nectar viscosity by 50%. The results obtained indicated that DHP isolated or combined with mild thermal treatment are a viable alternative to inactivate A. niger in mango nectar. The process has a negative effect on vitamin C retention. It can be attributed to the oxygen dissolved in mango nectar and also to metals seals of equipment (Be-Cu) which can had promoted an increase in metallic ions concentration in nectar. These ions are pro oxidant of vitamin C, resulting in intense vitamin oxidationMestradoMestre em Tecnologia de Alimento

Effects Of High Pressure Homogenization On The Activity, Stability, Kinetics And Three-dimensional Conformation Of A Glucose Oxidase Produced By Aspergillus Niger.

High pressure homogenization (HPH) is a non-thermal method, which has been employed to change the activity and stability of biotechnologically relevant enzymes. This work investigated how HPH affects the structural and functional characteristics of a glucose oxidase (GO) from Aspergillus niger. The enzyme was homogenized at 75 and 150 MPa and the effects were evaluated with respect to the enzyme activity, stability, kinetic parameters and molecular structure. The enzyme showed a pH-dependent response to the HPH treatment, with reduction or maintenance of activity at pH 4.5-6.0 and a remarkable activity increase (30-300%) at pH 6.5 in all tested temperatures (15, 50 and 75°C). The enzyme thermal tolerance was reduced due to HPH treatment and the storage for 24 h at high temperatures (50 and 75°C) also caused a reduction of activity. Interestingly, at lower temperatures (15°C) the activity levels were slightly higher than that observed for native enzyme or at least maintained. These effects of HPH treatment on function and stability of GO were further investigated by spectroscopic methods. Both fluorescence and circular dichroism revealed conformational changes in the molecular structure of the enzyme that might be associated with the distinct functional and stability behavior of GO.9e10341

INOVAÇÕES SOBRE SISTEMAS DE EMBALAGENS PARA ALIMENTOS PROCESSADOS TERMICAMENTE

Esta revisão de literatura teve como objetivo avaliar os diferentes sistemas de embalagem disponíveis para alimentos termicamente processados e como as embalagens afetam o tipo de processo utilizado e a qualidade final do produto obtido. Foram abordados os principais processos térmicos utilizados e os seus requerimentos em termos de resistência (mecânica e térmica) da embalagem, além das vantagens e limitações dos principais materiais utilizados. Também foram tratados os desenvolvimentos recentes e importantes para superar parcialmente as limitações de cada tipo de material e reduzir os custos envolvidos, além das propriedades de barreira exigidas para que o alimento não sofra alterações, especialmente de ordem físico-química por oxidação, umidade e migração de materiais da embalagem, durante o seu armazenamento. Concluiu-se que existem várias opções de embalagens para alimentos termicamente tratados e que, enquanto embalagens tradicionais passam por constantes pesquisas para se manterem competitivas, as de plástico ou flexíveis são muito estudadas visando o desenvolvimento de sistemas compatíveis com o processamento térmico e baixo custo

Effect of High-Pressure Technologies on Enzymes Applied in Food Processing

High isostatic pressure (HIP) and high-pressure homogenization (HPH) are considered important physical technologies that able to induce changes on enzymes. HIP and HPH are emerging food processing technologies that involve the use of ultra high pressures (up to 1200 MPa for HIP and up to 400 MPa for HPH), where the first process is based on the principle that the maintenance of a product inside vessels at high pressures induces changes in the molecules conformation and, consequently, in the functionality of polysaccharides, proteins and enzymes. To the contrary, for HPH process, the high shear and sudden pressure drop are the responsible phenomena for the changes on the processed product. This chapter aims to evaluate comparatively the effects of HIP and HPH on the activity of enzymes currently applied in food industry and to identify the main structural changes induced by each process. The overall evaluation of the results shows that mild conditions of both processes were recently highlighted as able to improve the activity and the stability of several enzymes, whereas extreme process conditions (pressure, time and temperature) induce enzyme denaturation with consequent reduction of biological activity. Considering the complexity and diversity involved in the enzyme structure and its ability to react, it is not possible to determine specific conditions that each process is able to promote increase or reduction of enzyme activity, being necessary to evaluate HIP and HPH for each enzyme. Finally, in terms of molecular structure, the effect of HIP and HPH on enzymes can be explained by the alterations in the quaternary, tertiary and secondary structures of enzymes, which directly affects its active site configuration

Influence of high pressure homogenization on commercial protease from Rhizomucor miehei: Effects on proteolytic and milk-clotting activities

AbstractThis work studied the influence of high pressure homogenization (HPH) on a commercial fungal protease. The enzyme solutions (2 and 20 g/100 mL) were processed up to 190 MPa and the proteolytic activity (PA), milk-clotting activity (MCA) and the rheological behavior of the milk coagulation phase were evaluated. The effects of multi-pass (three cycles) HPH at 25 and 190 MPa was evaluated for enzyme processed at concentration of 2 g/100 mL. No differences in PA and MCA were observed for the samples of 2 g/100 mL of enzyme concentration processed by HPH. On the other hand, increase in PA (∼3%) and MCA (∼10%) were observed for the enzymes processed at 190 MPa at high concentration, which consequent faster clotting and higher consistency of the milk gel. The multi-pass increased PA (≤6%) but did not alter MCA nor improved the milk coagulation phase. The results highlight that the energy supplied from HPH to enzyme at low concentration is not enough to promote positive changes in the enzyme coagulant profile; however, the HPH of solution with high enzyme concentration showed a positive effect, indicating that the collisions between enzymes during the process was important to reach the observed changes

Sanitização de alface americana com água ozonizada para inativação de Escherichia coli O157:H7

As hortaliças folhosas, especialmente a alface, têm sido identificadas como veículos significativos de patógenos relevantes em saúde pública. O objetivo deste trabalho foi avaliar a redução de Escherichia coli O157:H7 intencionalmente inoculada na alface após sanitização da hortaliça com água ozonizada. Dez amostras de alface americana foram inoculadas com E. coli O157:H7 e submetidas à sanitização em água ozonizada na concentração de 1 mg.L-1 durante um minuto. A contaminação inicial das alfaces foi da ordem de 105-106 UFC.g-1 , e o processo de sanitização resultou em reduções decimais entre 2,40 e 4,49, sendo a variação observada possivelmente função da concentração inicial inoculada e da heterogeneidade da superfície da alface, o que pode afetar a aderência do micro-organismo nas amostras e, consequentemente, a efetividade do processo de sanitização. Assim, a utilização de água ozonizada mostra ser uma tecnologia promissora na etapa de sanitização em alface

INATIVAÇÃO DE Escherichia coli O157:H7 E Bacillus subtilis POR ÁGUA OZONIZADA

O objetivo deste trabalho foi estudar a eficiência da água ozonizada para a inativação de Escherichia coli O157:H7 e Bacillus subtilis. O sanitizante foi utilizado nas concentrações de 0,6, 0,8 e 1,0 mg.L-1 e tempos de contato de 1, 3 e 5 minutos. Avaliou-se a eficiência do sanitizante em função de contagens totais em placas para cada micro-organismo alvo. Obtiveram-se reduções decimais de 1,9, 3,9 e 6,6 para E. coli O157:H7 quando aplicado ozônio por 1 minuto nas concentrações de 0,6, 0,8 e 1,0 mg.L-1, respectivamente. Para os demais tempos de exposição (3 e 5 minutos) e concentração de 1,0 mg.L-1 não foi possível a recuperação de E. coli O157:H7, obtendo-se mais de 8 ciclos de redução decimal. Para o B. subtilis, no tempo de exposição de 1 minuto e com a concentração inicial de 108 esporos.mL-1, as reduções foram de 2,5 e 5,3 ciclos logarítmicos nas concentrações de 0,6 e 1,0 mg.L-1, respectivamente. Para o tempo de 3 minutos, os esporos foram inativados em até 5,8 ciclos logarítmicos na concentração de 1,0 mg.L-1. Os resultados demonstraram que a maior atividade do ozônio ocorre em até 1 minuto de contato, porém há atividade residual até 5 minutos, o que permite a utilização de concentrações menores (0,6 mg.L-1) para se obter níveis seguros de inativação, desde que associados a maior tempo. O sanitizante mostrou-se eficaz na inativação de E. coli O157:H7 e esporos de B. subtilis