Papel de Rpb4/7 en la fosforilación de la RNA polimerasa II y en la formación de los bucles génicos

Trabajo presentado por la licenciada Paula Allepuz Fuster para optar al grado de Doctora en Biología, que ha realizado el trabajo en el Instituto de Biología Funcional y Genómica (IBFG), centro mixto de la Universidad de Salamanca y del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).La transcripción es uno de los procesos más regulados de la expresión génica. Dicho proceso es llevado a cabo por las enzimas denominadas RNA polimerasas (RNAP). Nuestro estudio se centra en la RNA polimerasa II. Esta enzima es la encargada de llevar a cabo la transcripción de los RNAs mensajeros y de otros RNAs no codificantes de pequeño tamaño. La RNAPII está formada por 12 subunidades denominadas Rpb1-Rpb12, siendo Rpb1 la subunidad mayor y Rpb12 la menor. Dos dominios estructurales muy importantes son el dominio carboxilo terminal (CTD) de la subunidad mayor Rpb1 y el heterodímero formador por las subunidades Rpb4/7. En Saccharomyces cerevisiae el heterodímero Rpb4/7 es un complejo muy versátil capaz de actuar como regulador en la mayoría de las etapas de la expresión génica, incluyendo la transcripción, la reparación del DNA acoplada a la transcripción, el transporte del mRNA, su degradación y su traducción. En lo que respecta al ciclo de transcripción, el heterodímero Rpb4/7 además de participar en la iniciación y en la elongación , parece ser que podría tener un papel en la terminación, influyendo en la asociación de ciertos factores de procesamiento del extremo 3’ del gen. A diferencia de la RNAPI y RNAPIII, la subunidad mayor de la RNAPII presenta un dominio carboxilo terminal (CTD) exclusivo de ésta. El CTD es esencial para la viabilidad celular, y truncaciones parciales de este o mutaciones de residuos específicos del mismo llevan a defectos en el crecimiento e incluso a la letalidad. Se trata de un dominio repetitivo y desestructurado que se extiende desde el centro catalítico de la RNAPII a una zona próxima al canal de salida del RNA naciente. El CTD está formado por una serie de repeticiones en tándem de un heptapéptido consenso. La secuencia de este heptapéptido es la siguiente: Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Esta secuencia consenso está presente en animales, plantas, levaduras y un gran número de protistas. El CTD sufre modificaciones postraduccionales a lo largo de la transcripción, como fosforilaciones, glicosilaciones, metilaciones, ubiquitinaciones e isomerizaciones. Las numerosas modificaciones que puede sufrir el CTD, especialmente las fosforilaciones, combinadas con el número de repeticiones que presenta, es capaz de generar un número enorme de posibles estados de fosforilación, que hacen que la fosforilación del CTD y su regulación sea extremadamente compleja. El patrón dinámico de modificaciones post-traduccionales que sufre el CTD, referidas sobre todo a las fosforilaciones en Ser2 y Ser5, se denominó por S. Buratowski como “el código del CTD”. De manera que, cada patrón de fosforilación determina un código reconocible para los factores específicos que participan a distintos niveles en la biogénesis de los transcritos de la RNAPII y en otros procesos nucleares. De este modo, el CTD actúa como una plataforma para reclutar secuencialmente factores que co-regulan y coordinan distintos procesos de la expresión génica. La realización de esta tesis doctoral se ha centrado en analizar dos objetivos clave: 1.-Determinar el papel del heterodímero Rpb4/7 en la fosforilación del CTD de la RNAPII. 2.-Determinar si la RNAPII juega un papel en la formación de los bucles génicos, y si este papel es a través de Rpb4. En ambos casos hemos concluido que la subunidad Rpb4 se encuentra implicada tanto en el proceso de modulación de la fosforilación, mediante la interacción con varias fosfatasas del ciclo, así como en el proceso de formación de los bucles génicos, proceso mediante el cual se produce la recircularización de la transcripción.Peer reviewe

Papel de Rpb 4/7 en la fosforilación de la RNA polimerasa II

[ES]Nuestro estudio se centra en la RNA polimerasa II. Esta enzima es la encargada de llevar a cabo la transcripción de los RNAs mensajeros y de otros RNAs no codificantes de pequeño tamaño. La RNAPII está formada por 12 subunidades denominadas Rpb1-Rpb12, siendo Rpb1 la subunidad mayor y Rpb12 la menor. Dos dominios estructurales muy importantes son el dominio carboxilo terminal (CTD) de la subunidad mayor Rpb1 y el heterodímero formador por las subunidades Rpb4/7. En Saccharomyces cerevisiae el heterodímero Rpb4/7 es un complejo muy versátil capaz de actuar como regulador en la mayoría de las etapas de la expresión génica, incluyendo la transcripción, la reparación del DNA acoplada a la transcripción, el transporte del mRNA, su degradación y su traducción. En lo que respecta al ciclo de transcripción, el heterodímero Rpb4/7 además de participar en la iniciación y en la elongación , parece ser que podría tener un papel en la terminación, influyendo en la asociación de ciertos factores de procesamiento del extremo 3’ del gen. A diferencia de la RNAPI y RNAPIII, la subunidad mayor de la RNAPII presenta un dominio carboxilo terminal (CTD) exclusivo de ésta. El CTD es esencial para la viabilidad celular, y truncaciones parciales de este o mutaciones de residuos específicos del mismo llevan a defectos en el crecimiento e incluso a la letalidad. Se trata de un dominio repetitivo y desestructurado que se extiende desde el centro catalítico de la RNAPII a una zona próxima al canal de salida del RNA naciente. El CTD está formado por una serie de repeticiones en tándem de un heptapéptido consenso. La secuencia de este heptapéptido es la siguiente: Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Esta secuencia consenso está presente en animales, plantas, levaduras y un gran número de protistas. El CTD sufre modificaciones postraduccionales a lo largo de la transcripción, como fosforilaciones, glicosilaciones, metilaciones, ubiquitinaciones e isomerizaciones. Las numerosas modificaciones que puede sufrir el CTD, especialmente las fosforilaciones, combinadas con el número de repeticiones que presenta, es capaz de generar un número enorme de posibles estados de fosforilación, que hacen que la fosforilación del CTD y su regulación sea extremadamente compleja. El patrón dinámico de modificaciones post-traduccionales que sufre el CTD, referidas sobre todo a las fosforilaciones en Ser2 y Ser5, se denominó por S. Buratowski como “el código del CTD”. De manera que, cada patrón de fosforilación determina un código reconocible para los factores específicos que participan a distintos niveles en la biogénesis de los transcritos de la RNAPII y en otros procesos nucleares. De este modo, el CTD actúa como una plataforma para reclutar secuencialmente factores que co-regulan y coordinan distintos procesos de la expresión génica. La realización de esta tesis doctoral se ha centrado en analizar dos objetivos clave: 1.-Determinar el papel del heterodímero Rpb4/7 en la fosforilación del CTD de la RNAPII. 2.-Determinar si la RNAPII juega un papel en la formación de los bucles génicos, y si este papel es a través de Rpb4. En ambos casos hemos concluido que la subunidad Rpb4 se encuentra implicada tanto en el proceso de modulación de la fosforilación, mediante la interacción con varias fosfatasas del ciclo, así como en el proceso de formación de los bucles génicos, proceso mediante el cual se produce la recircularización de la transcripción

Rpb1-CTD phosphorylation is differentially modulated by Rpb4/7

Póster presentado a la EMBO Conference: "Gene Transcrition in Yeast: From Chromatin to RNA and back", celebrada en Sant Feliu de Guixols (España) del 11 al 16 de junio de 2016.The Rpb4 and Rpb7 subunits of eukaryotic RNA polymerase II (RNAPII) participate in a variety of processes from transcription, DNA repair, mRNA export and decay, to translation regulation and stress response. In addition, we have recently shown that the Rpb4/7 heterodimer in S. cerevisiae plays a key role in controlling phosphorylation of the carboxy terminal domain (CTD) of the Rpb1 subunit of RNAPII. Deletion of RPB4, and mutations that disrupt the integrity of Rpb4/7 or its recruitment to the RNAPII complex, increased phosphorylation of Ser2, Ser5, Ser7. We showed that Rpb4 is important for Ssu72 and Fcp1 phosphatases association, recruitment and/or accessibility to the CTD, and that this correlates strongly with Ser5P and Ser2P levels, respectively. Here we show that, in addition, rpb4D cells display increased Thr4P and Tyr1P. Our data suggest that Fcp1 is the Thr4P phosphatase in yeast, as in vertebrate. Moreover, we present evidences that Rpb4 may be also linked to the function of the CTD phosphatase Rtr1, which has been involved in Ser5P and Tyr1P dephosporylation. On the other hand, Rpb4 also influences the recruitment of the CTD-Ser2 kinase Ctk1 during transcription elongation. We proposed a model where Rpb1-CTD phosphorylation levels are differentially modulated by Rpb4/7. Thus, increased Ser2P phoshorylation levels in the rpb4D mutants are due to altered Fcp1 and Ctk1 functions, while increased Ser5 phosphorylation is the result of changes in Ssu72. Our data and others, and the close localization of Rpb4/7 to the CTD, suggest that Rpb4/7 might modulate the access of the CTD modifying enzymes to their substrate during the whole transcription cycle.This work was funded by the MINECO (BFU2013-48374-P)Peer Reviewe

Rpb4/7 roles in RNAPII phosphorylation and gene loops formation

Trabajo presentado en la II Reunión de la Red de Excelencia Temática: RNA Life, celebrada en Madrid (España), los días 19 y 20 de julio de 2017Peer reviewe

Sub1, two domains, two functions: transcription initiation versus elongation

Póster presentado a la EMBO Conferences: Gene Transcription in Yeast: From regulatory networks to mechanisms, celebrada en Sant Feliu de Guixols (España) del 14 al 19 de junio de 2014.We have performed a detailed analysis of the ssDNA binding and C-terminal domains of Sub1 from S. cerevisiae and identified the essential residues involved in Sub1 DNA binding capacity, which are not required during transcription elongation. Additionally, our data indicates that the C-terminus domain of Sub1, the function of which was previously unknown, might be important in promoting Sub1 release from the promoter to facilitate transcription elongation. In summary, Sub1 plays a dual function during transcription, being a pre-initiation factor via its DNA binding domain, and a transcription elongation factor through its C-terminus domain.This work was funded by the Ministerio de Economía y Competitividad.Peer Reviewe

A role for Rpb4 in gene looping and transcription termination by RNAPII

Trabajo presentado al EMBO Workshop: "Regulation of RNA 3' end formation across eukaryotic genomes", celebrado en Oxford (UK) del 20 al 24 de septiembre de 2017.Peer Reviewe

Rpb4/7 heterodimer regulates RNAPII phosphorylation

Póster presentado a la EMBO Conferences: Gene Transcription in Yeast: From regulatory networks to mechanisms, celebrada en Sant Feliu de Guixols (España) del 14 al 19 de junio de 2014.The 12-subunit RNA polymerase II enzyme in eukaryotic cells is essential for transcription of protein-coding genes. The Rpb4 and Rpb7 subunits bind to each other forming a complex in archaebacteria and in eukaryotic cells, and display some unique features that distinguish them from the remaining subunits. In S. cerevisiae, the Rpb4/7 heterodimer can dissociate from the rest of the holoenzyme. These subunits are important for transcription initiation, elongation and, in particular, Rpb4 contributes to contranscriptional recruitment of 3’-end processing factors. However, recent evidences suggests that they are also involved in DNA repair, mRNA export and decay, as well as translation. Additionally, several facts suggest that Rpb4/7 may play a role on RNAPII phosphorylation: 1) The close proximity of the Rpb4/7 heterodimer to the CTD of the Rpb1. 2) The in vitro concerted interaction of Rpb4 and the CTD phosphatase, Fcp1, in S. pombe, suggesting that Rpb4 may play an important role in the assembly of Fcp1 into the RNAPII complex and thus, also in dephosphorylation. 3) The Rpb4-Fcp1 interaction is also conserved in Drosophila; and 4) in Saccharomyces cerevisiae, Rpb7 genetically interacts with the propyl isomerase Ess1, also involved in CTD phosphorylation regulation. Here, we present genetic and biochemical data showing that effectively Rpb4/7 subcomplex is important for RNAPII dephosphorylation in S. cerevisiae, regulating several CTD modifying enzymes.This work was funded by the MINECO (BFU2009-07179/BMC).Peer Reviewe

Sub1 contacts the RNA polymerase II stalk to modulate mRNA synthesis

Biogenesis ofmessenger RNA is critically influenced by the phosphorylation state of the carboxy-terminal domain (CTD) in the largest RNA polymerase II(RNAPII) subunit. Several kinases and phosphatases are required to maintain proper CTD phosphorylation levels and, additionally, several other proteins modulate them, including Rpb4/7 and Sub1. The Rpb4/7 heterodimer, constituting the RNAPII stalk, promote phosphatase functions and Sub1 globally influences CTD phosphorylation, though its mechanism remains mostly unknown. Here, we show that Sub1 physically interacts with the RNAPII stalk domain,Rpb4/7, likely through its C-terminal region,and associates with Fcp1. While Rpb4 is not required for Sub1 interaction with RNAPII complex, a fully functional heterodimer is required for Sub1 association to promoters. We also demonstrate that a complete CTD is necessary for proper association of Sub1 to chromatin and to the RNAPII. Finally, genetic data show a functional relationship between Sub1 and the RNAPII clamp domain. Altogether, our results indicate that Sub1, Rpb4/7 and Fcp1 interaction modulates CTD phosphorylation. In addition, Sub1 interaction with Rpb4/7 can also modulate transcription start site selection and transcription elongation rate likely by influencing the clamp function.Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) [BFU2013-48374-P]; Predoctoral fellowships from MINECO (to J.A.L.); Technician Formation Program from the Spanish National Research Council (CSIC) (to N.G.-P.). Funding for open access charge: MINECO [BFU2013-48374-P].Peer reviewe