Studio della modulazione ormonale della riproduzione e della crescita nei Crostacei Decapodi mediante l'uso di neurormoni ricombinanti ed anticorpi specifici

2006/2007L’ormone iperglicemico dei crostacei (cHH) appartiene ad una famiglia di neuropeptidi che sono prodotti e rilasciati in circolo nel complesso organo X-ghiandola del seno, localizzato nei peduncoli oculari dei crostacei. Il ruolo principale del cHH è quello di regolare il livello emolinfatico del glucosio, ma questo ormone è implicato anche nel controllo di altre funzioni come la secrezione di enzimi digestivi, la muta, la riproduzione, il metabolismo lipidico, l’osmoregolazione e le risposte da stress. Il cHH maturo possiede sei cisteine che formano tre ponti disolfuro, l’estremità C-terminale ammidata e l’estremità N-terminale bloccata dal piroglutammato come in Carcinus maenas e Jasus lalandii oppure libera come in Penaeus schmitti. L’ammidazione carbossiterminale è una modificazione post-traduttiva rilevante che fornisce attività biologica ad un grande numero di peptidi, sia nei vertebrati che negli invertebrati. Il ruolo essenziale dell’ammidazione nel conferire un’attività iperglicemica al cHH è stato provato sinora solo per il cHH di Marsupenaeus japonicus. Per stabilire la funzione dell’ammidazione sull’attività biologica del cHH in altre specie, un peptide ricombinante di 73 residui, Asl-rcHH-Gly, è stato espresso, foldato, purificato e trattato con l’enzima di ammidazione in modo da ottenere l’ormone ammidato, Asl-rcHH-ammide. Con questo peptide ricombinante sono stati condotti dei saggi biologici su due specie appartenenti alla stessa superfamiglia (Astacoidea) ed infraordine (Astacidea) che erano Astacus leptodactylus, la specie dalla quale è stato clonato il cHH, e Procambarus clarkii, il cui cHH differisce da quello di A. leptodactylus per due soli amminoacidi, e su una specie filogeneticamente più distante come Palaemon elegans, che appartiene ad un diverso infraordine (Caridea). Asl-rcHH-ammide ha mostrato di avere in A. leptodactylus un’attività iperglicemica comparabile a quella del peptide nativo estratto dalle ghiandole del seno. Raddoppiando la quantità di Asl-rcHH-ammide iniettato si è osservata una risposta più forte con una concentrazione emolinfatica di glucosio di quasi il doppio a conferma dell’effetto dose dipendente dell’ormone nell’indurre l’iperglicemia. Il profilo della curva da stimolo era differente nel caso l’iperglicemia fosse stata indotta da 1,7 pmol/g di peso vivo oppure da 3,3 pmol/g di peso vivo di Asl-rcHH-ammide oppure dai peptidi nativi. Il peptide ricombinante induceva un incremento massimo nella risposta dopo un’ora, mentre l’estratto di ghiandole del seno induceva una risposta più lenta, con un spostamento del picco di iperglicemia alle due ore. Dopo l’iniezione di 1,7 pmol/g di peso vivo del peptide ammidato, l’effetto iperglicemico si esauriva entro le due ore dallo stimolo ed a quattro ore l’iperglicemia non era più osservabile. Questo comportamento è in buon accordo con l’emivita di circa 10 min riportata per il cHH. L’iniezione di una dose maggiore di Asl-rcHH-ammide non solo ha indotto un effetto maggiore, ma ha anche ritardato il ritorno al livello basale del glucosio, dovuto ad una insufficiente rimozione del peptide dall’emolinfa a causa dell’alta concentrazione dell’ormone circolante. Una simile tendenza è stata osservata anche per l’estratto di ghiandole del seno che ha mantenuto un forte effetto iperglicemizzante anche a quattro ore dalla stimolazione. Il Asl-rcHH-Gly non ha mostrato una potenza comparabile. Questi risultati dimostrano chiaramente che l’ammidazione è essenziale nel provvedere una completa funzionalità biologica al cHH, dato che il peptide non ammidato che possiede una potenza inferiore. Infatti, per osservare un effetto iperglicemico paragonabile a quello indotto dall’ormone ammidato, il peptide non ammidato deve essere iniettato a dosi elevate. Asl-rcHH-ammide è stato in grado di indurre una risposta iperglicemica anche in P. clarkii sebbene più debole di quella indotta in A. leptodactylus. Il profilo temporale della risposta era simile, con un picco di massima presente ad un’ora. Invece, l’iniezione di Asl-rcHH-Gly ha fornito un’attività iperglicemica molto debole. Per provare la capacità di Asl-rcHH-ammide di indurre l’iperglicemia in una specie filogeneticamente più distante da A. leptodactylus, è stato fatto un saggio eterologo sul gamberetto P. elegans. Anche in questa specie, Asl-rcHH-ammide è stato in grado di indurre una risposta rilevabile con un picco di glucosio presente dopo un’ora che aveva raddoppiato il livello basale, sebbene questo effetto positivo fosse di molto inferiore a quello indotto in A. leptodactylus e P. clarkii. L’attività di Asl-rcHH-Gly nel gamberetto era ancora più bassa se paragonata a quella del peptide ammidato. Questo dimostra che persino in specie filogeneticamente distanti l’attività biologica dell’ormone viene mantenuta parzialmente, probabilmente a causa di una somiglianza strutturale nel neuropeptide. Particolarmente interessante è il fatto che il peptide ammidato abbia indotto risposte diverse a seconda del sesso degli animali. Nei maschi si è ottenuta una forte risposta iperglicemica correlata all’elevata quantità di ormone iniettato, mentre la risposta nelle femmine è stata significativamente di molto inferiore. Questo dato fa supporre che nelle femmine vi fosse una diminuita affinità dei recettori verso il cHH oppure che le cascate dei segnali intracellulari attivati dal legame del cHH con i recettori fossero, in qualche modo, disattivate. Anticorpi specifici anti Asl-rcHH sono stati purificati da antisiero di coniglio mediante cromatografia per affinità, dove il Asl-rcHH era accoppiato alla resina. L’iniezione di questi anticorpi in A. leptodactylus 10 min prima dell’iniezione del Asl-rcHH ammidato ha fornito una risposta iperglicemica depressa, dimostrando che un’adeguata quantità di anticorpi specifici può essere usata per modulare l’asse ormonale nei gamberi. Con questo lavoro si è dimostrata l’importanza dell’ammidazione C-terminale per la funzionalità biologica del cHH; si è prodotto un peptide ricombinante con un’attività biologica paragonabile a quella dell’ormone nativo; si è evidenziato che l’attività del cHH dipende non solo dalla quantità di ormone circolante, ma è anche legata alla responsività degli organi bersaglio; si è dimostrato che è possibile modulare la funzionalità di un ormone mediante l’iniezione di anticorpi specifici. La possibilità di avere a disposizione un cHH pienamente funzionante apre la strada a molteplici studi atti a comprendere meglio il ruolo di questo ormone nei processi fisiologici dei crostacei. Inoltre, è possibile pensare di effettuare dei trattamenti a base di peptidi ricombinanti associati ad alginati, da somministrare sotto forma di mangime, in modo da avere una modulazione esterna degli assi ormonali. La preparazione di un anticorpo specifico anti-cHH consentirà la messa a punto di un dosaggio ELISA da usare per monitorare le variazioni nella concentrazione emolinfatica di questo ormone legate agli stadi di crescita, riproduzione oppure dovute a fattori stressogeni.XX Ciclo195

Sviluppo di un bioindicatore naturale per il monitoraggio della qualità delle acque

2011/2012La concentrazione del glucosio emolinfatico è regolata nei Crostacei dal crustacean Hyperglycemic Hormone (cHH), un neuropeptide prodotto e rilasciato in circolo nel complesso organo X-ghiandola del seno, localizzato nei peduncoli oculari. Il cHH, oltre a essere coinvolto nella regolazione di diversi processi fisiologici, è implicato anche nelle risposte da stress di origine ambientale o dovute all’esposizione a xenobiotici, il cui risultato finale è un aumento della glicemia. In numerose specie di crostacei sono state identificate più forme circolanti del cHH, alcune delle quali derivano da geni diversi e si differenziano per la sequenza amminoacidica, altre invece risultano da processi di maturazione post-traduzionale dei peptidi come l’isomerizzazione della L-Phe3 con la conseguente formazione di D-Phe3. Le eventuali differenze nella funzione biologica di queste due isoforme chirali sono ancora poco chiare, ma gli scarsi studi sin qui condotti indicano che il D-cHH ha una maggiore e più prolungata attività iperglicemizzante. Inoltre, è stato proposto un suo coinvolgimento sia nell’inibizione della sintesi degli ecdisteroidi sia nella regolazione osmotica. Due sono stati gli indirizzi principali di ricerca sviluppati in questi anni di dottorato. Il primo è consistito nel gettare le basi per la realizzazione di un organismo bioindicatore capace di rilevare la presenza di sostanze tossiche cambiando la propria colorazione in modo facilmente visualizzabile, ed è stato completato con il clonaggio e l’identificazione del promotore del cHH di Astacus leptodactylus (Crustacea, Decapoda), la verifica in vitro della sua funzionalità e l’identificazione di possibili siti di legame per dei fattori di trascrizione. L’obiettivo finale è la modifica in via transiente di Palaemon elegans e Palaemonetes antennarius (Crustacea, Decapoda) mediante l’iniezione di emociti trasfettati con il plasmide veicolante il promotore del cHH ed un gene reporter che visualizza la risposta mediante colorazione dell’animale. Il secondo progetto ha riguardato la sintesi chimica di alcune forme chirali del cHH di A. leptodactylus che è l’unica strategia possibile per ottenere peptidi identici all’ormone nativo, essendo la sola capace di consentire l’introduzione di tutte le modificazioni post-traduzionali necessarie. I peptidi ottenuti sono stati quindi adoperati in saggi biologici in vivo per provare la loro funzionalità. Inoltre, è stato fatto uno studio per appurare il possibile ruolo del cHH nel controllo dell’aggressività in Procambarus clarkii (Crustacea, Decapoda). Per ottenere una quantità sufficiente delle forme chirali del cHH in modo da poterne studiare la funzione biologica, abbiamo scelto la strada della sintesi chimica in fase solida (SPPS). La SPPS è generalmente limitata alla sintesi di peptidi non più lunghi di 40 amminoacidi. Per ottenere sequenze più lunghe è necessario sintetizzare segmenti diversi e quindi ligarli assieme attraverso delle reazioni chimiche. In questo caso si è adoperata la native chemical ligation. Il primo passo ha riguardato la sintesi di sei segmenti (QVF-cHH4-38, QVdF-cHH4-38, pEVF-cHH4-38, pEVdF-cHH4-38, pEVdA-cHH4-38, cHH-39-72) che legati fra loro in maniera diversa avrebbero portato alla formazione di cinque peptidi ammidati al C-terminale, due con la L-Phe3 e la parte N-terminale libera oppure bloccata con il piroglutammato, due con la D-Phe3 e la parte N-terminale anch’essa libera oppure bloccata, e uno con la D-Phe3 sostituita dalla D-Ala3 e l’N-terminale bloccato dal piroglutammato. La sintesi dei diversi segmenti non ha dato particolari problemi, ma la purificazione del segmento cHH-39-72 è risultata particolarmente difficile, in quanto questo peptide è risultato essere molto poco solubile. Questo problema è stato risolto con l’aggiunta di gruppi –SO3 allo zolfo delle cisteine che ha reso solubile il segmento cHH-39-72. Sono stati quindi sintetizzati in quantità sufficienti, dell’ordine di un centinaio di microgrammi, le seguenti forme chirali del cHH: QVdF-cHH, QVF-cHH, pEVF-cHH, pEVdF-CHH e pEVdA-cHH. In quest’ultima isoforma la D-fenilalanina in posizione 3 è stata sostituita dalla D-alanina, per verificare se la fenilalanina avesse un ruolo fondamentale nella funzionalità del peptide. I peptidi di sintesi sono stati quindi utilizzati per eseguire dei saggi in vivo su A. leptodactylus, iniettando nei gamberi il cHH sintetico e verificando la risposta biologica indotta attraverso il dosaggio della glicemia. I prelievi per il dosaggio del glucosio sono stati fatti ai tempi 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h e 24 h. Il profilo temporale della risposta glicemica indotta dalle due forme chirali è diverso, con il L-cHH avente un picco di risposta tra le 2 h e le 4 h, mentre il picco massimo della risposta del D-cHH è più tardivo, situandosi tra le 4 h e le 8 h. Invece, la differenza nella risposta iperglicemica tra la forma bloccata all’N-terminale (Glp-D-cHH) e la forma non bloccata (D-cHH) non è stata significativa a dimostrazione che la presenza del piroglutammato non influenza la risposta biologica indotta dal cHH. L’attività biologica dell’isomero Glp-dA-cHH è stata verificata usando il medesimo protocollo. L’attività iperglicemizzante di questo peptide è risultata essere significativamente inferiore a quella indotta dal Glp-D-cHH. Il risultato ottenuto dimostra che la porzione N-terminale del cHH è fondamentale per la funzionalità del peptide. Lo studio del promotore del cHH è stato effettuato su una sequenza clonata di 176 nucleotidi a monte della regione 5’ del gene per il cHH di A. leptodactylus, che è stata inserita in un vettore senza promotore (pGL3-Basic) a monte del gene reporter per la luciferasi. Con questo vettore sono state trasfettate cellule HEK 293T e la funzionalità del promotore è stata dimostrata da un incremento di circa 1000 volte nell’espressione della luciferasi rispetto a pGL3-Basic. La ricerca di eventuali siti di legame per elementi di regolazione presenti nella sequenza clonata ha consentito di identificare numerosi possibili siti di legame, inclusi una TATA box a -23, una CCAAT box a -78, due GC box a -63 e -70, ed altri per specifici elementi di trascrizione, più precisamente una sequenza a -91 dove i siti di legame per il cAMP response element-binding (CREB), l’elemento di risposta all’ipossia (HRE), il recettore per l’estrogeno (ER-alpha) si sovrappongono, mentre a -160 è stato identificato un possibile sito di legame per il recettore dell’ecdisone (EcR). L’influenza del cHH sull’aggressività in P. clarkii è stata studiata iniettando negli animali il cHH nativo estratto dalle ghiandole del seno. In generale gli animali in cui era stato iniettato il cHH hanno mostrato un aumento nell’espressione della dominanza, gli alfa attraverso un aumento della durata dei combattimenti e i beta per la maggiore intensità dei combattimenti che ne aumentava la dominanza fino a raggiungere una temporanea inversione della gerarchia. Il potenziamento del comportamento aggressivo potrebbe essere dovuto o a una modulazione da parte del cHH dei neuroni che controllano l’espressione del comportamento agonistico, oppure essere dovuto a una maggiore mobilizzazione delle risorse energetiche necessarie per la lotta. Per la prima volta sono state ottenute diverse isoforme del cHH mediante la sintesi peptidica in fase solida accoppiata alla native chemical ligation. I dati ottenuti indicano che questa è la strategia appropriata per la sintesi dei peptidi della famiglia del cHH, essendo l’unica in grado di consentire l’introduzione di tutte le modifiche post-traduzionali per ottenere un peptide identico all’ormone nativo. L’ottimizzazione del presente protocollo consente di rendere disponibili adeguate quantità di peptidi per esperimenti su larga scala, in vivo e in vitro, che possono portare a una migliore conoscenza della funzione del cHH e della relazione tra funzione e struttura. Inoltre sono state gettate le basi per la realizzazione di un organismo bioindicatore per monitorare l’inquinamento delle acque. È stato clonato il promotore del cHH di A. leptodactylus e per la prima volta la funzionalità di un promotore di un peptide della famiglia del cHH è stata verificata in un saggio in vitro. L’identificazione di diversi possibili siti di legame per gli elementi di regolazione nel promotore del cHH suggerisce che l’espressione del cHH sia regolata da svariati fattori fisiologici e ambientali. I risultati ottenuti sono rilevanti per futuri studi indirizzati alla comprensione del ruolo che i fattori di trascrizione identificati possono avere nella regolazione del promotore del cHH. Infine, lo studio sulla relazione di dominanza in Procambarus clarkii ha dimostrato, per la prima volta, che un neuropeptide, nella fattispecie il cHH, è in grado di modulare il comportamento aggressivo, sino a invertire, sia pur temporaneamente, il rango.XXIV Ciclo195

Tissue localization of betacyanins in cactus stems

Betalains are soluble pigments found only in the suborder Chenopodiniae, while in all other Angiospermae they are replaced by anthocyanins. The convergent evolution of the presence of anthocyanins and betalains in vegetative tissues supports the hypothesis of a similar function, based on the absorption properties of these pigments. The screening effect of anthocyanins results in the reduction of the amount of photoinhibition. betalains, being the anthocyanin counterpart in most families of Caryophyllales, were also suggested to have a screening role. This study is aimed at identifying in which Cactaceae stem tissues betacyanins, reddish to violet betalain pigments, accumulate. Stem accumulation of betacyanins was observed in cacti both in their natural habitat and in cultivation. The localization of betacyanins was assessed by light microscope studies on tubercle transverse sections. During 2 field trips in distinct years to the Mexican plateau in March, many cactus species, belonging to different genera, were observed displaying a reddish stem. Light microscope studies on cultivated plants showed that betacyanins accumulate in the hypodermis and in the outer layers of the chlorenchyma, where they may act as a screen, thus protecting the photosystems present in the underlying chlorenchyma, and have a possible antioxidant function in the cortex. Las betalaínas son pigmentos solubles que se encuentran sólo en el suborden Chenopodiniae, mientras que en el resto de Angiospermae, lo que existe son antocianinas. La evolución convergente de la presencia de antocianinas y betalaínas en tejidos vegetativos apoya la hipótesis de una función similar, que se basa en las propiedades de absorción de estos pigmentos. El efecto pantalla de las antocianinas resulta en la reducción de fotoinhibición. Siendo las betalaínas la contraparte antocianítica en la mayoría de las familias de Caryophyllales, se sugirió también un papel de pantalla de estos pigmentos. Este estudio tiene por objeto identificar los tejidos del tallo de los cactus en los cuales se acumulan las betacianinas. Esta acumulación se observó en tejidos tanto cultivados, como en la naturaleza. La localización de las betacianinas en los tallos de los cactus se observó en estudios de microscopía de luz en secciones transversales de tubérculos. Durante el trabajo de campo en la planicie mexicana en marzo, se observaron tallos rojizos en muchas especies de cactus de diferentes géneros. Los estudios en microscopía de luz mostraron que las betacianinas se acumulan en la hipodermis y en las capas más externas del clorénquima, donde pueden funcionar como pantalla, protegiendo los fotosistemas presentes en la capa subyacente, y posiblemente como antioxidante en la corteza

Solutions of a two-particle interacting quantum walk

We study the solutions of the interacting Fermionic cellular automaton introduced in Ref. [Phys Rev A 97, 032132 (2018)]. The automaton is the analogue of the Thirring model with both space and time discrete. We present a derivation of the two-particles solutions of the automaton, which exploits the symmetries of the evolution operator. In the two-particles sector, the evolution operator is given by the sequence of two steps, the first one corresponding to a unitary interaction activated by two-particle excitation at the same site, and the second one to two independent one-dimensional Dirac quantum walks. The interaction step can be regarded as the discrete-time version of the interacting term of some Hamiltonian integrable system, such as the Hubbard or the Thirring model. The present automaton exhibits scattering solutions with nontrivial momentum transfer, jumping between different regions of the Brillouin zone that can be interpreted as Fermion-doubled particles, in stark contrast with the customary momentum-exchange of the one dimensional Hamiltonian systems. A further difference compared to the Hamiltonian model is that there exist bound states for every value of the total momentum, and even for vanishing coupling constant. As a complement to the analytical derivations we show numerical simulations of the interacting evolution.Comment: 16 pages, 6 figure

Path-integral solution of the one-dimensional Dirac quantum cellular automaton

Quantum cellular automata have been recently considered as a fundamental approach to quantum field theory, resorting to a precise automaton, linear in the field, for the Dirac equation in one dimension. In such linear case a quantum automaton is isomorphic to a quantum walk, and a convenient formulation can be given in terms of transition matrices, leading to a new kind of discrete path integral that we solve analytically in terms of Jacobi polynomials versus the arbitrary mass parameter.Comment: 5 page

Path-sum solution of the Weyl Quantum Walk in 3+1 dimensions

We consider the Weyl quantum walk in 3+1 dimensions, that is a discrete-time walk describing a particle with two internal degrees of freedom moving on a Cayley graph of the group $\mathbb Z^3$, that in an appropriate regime evolves according to Weyl's equation. The Weyl quantum walk was recently derived as the unique unitary evolution on a Cayley graph of $\mathbb Z^3$ that is homogeneous and isotropic. The general solution of the quantum walk evolution is provided here in the position representation, by the analytical expression of the propagator, i.e. transition amplitude from a node of the graph to another node in a finite number of steps. The quantum nature of the walk manifests itself in the interference of the paths on the graph joining the given nodes. The solution is based on the binary encoding of the admissible paths on the graph and on the semigroup structure of the walk transition matrices.Comment: 13 page

Scattering and perturbation theory for discrete-time dynamics

We present a systematic treatment of scattering processes for quantum systems whose time evolution is discrete. First we define and show some general properties of the scattering operator, in particular the conservation of quasi-energy which is defined only modulo $2 \pi$. Then we develop two perturbative techniques for the power series expansion of the scattering operator, the first one analogous to the iterative solution of the Lippmann-Schwinger equation, the second one to the Dyson series of perturbative Quantum Field Theory. Our framework can be applied to a wide class of quantum simulators, like quantum walks and quantum cellular automata. As a case study we analyse the scattering properties of a one-dimensional cellular automaton with locally interacting fermions.Comment: 11 pages, 1 figur

Novel Protocol for the Chemical Synthesis of Crustacean Hyperglycemic Hormone Analogues — An Efficient Experimental Tool for Studying Their Functions

The crustacean Hyperglycemic Hormone (cHH) is present in many decapods in different isoforms, whose specific biological functions are still poorly understood. Here we report on the first chemical synthesis of three distinct isoforms of the cHH of Astacus leptodactylus carried out by solid phase peptide synthesis coupled to native chemical ligation. The synthetic 72 amino acid long peptide amides, containing L- or D-Phe3 and (Glp1, D-Phe3) were tested for their biological activity by means of homologous in vivo bioassays. The hyperglycemic activity of the D-isoforms was significantly higher than that of the L-isoform, while the presence of the N-terminal Glp residue had no influence on the peptide activity. The results show that the presence of D-Phe3 modifies the cHH functionality, contributing to the diversification of the hormone pool