Expansion of NK cells for the treatment of multiple myeloma

The purpose of this study was to test the efficacy of expanded natural killer cells (eNKs) as a treatment against multiple myeloma (MM) cell lines and MM patient bone marrow aspirates. The cytotoxic effect of eNKs was studied alone and in combination with daratumumab, anti-CD38 monoclonal antibody approved for use in multiple myeloma patients. In multiple myeloma cell lines, eNKs were found to have a dramatic cytotoxic effect against the cells. For the patient samples, when eNKs were harvested during the optimum expansion period, they produced a cytotoxic effect against the MM cells. Daratumumab was also effective against some of the patient samples. However, when combined, eNKs and daratumumab produced a greater percent of specific cell death than both separately, on all cells tested. Combination therapy maximizes the effect of each individual treatment. This important finding supports the possible use of combination eNKs with daratumumab therapy against multiple myeloma in further trials

CPP32 inhibition prevents Fas-induced ceramide generation and apoptosis in human cells

AbstractIntracellular activation of sphingomyelinase, leading to ceramide generation, and ICE-like proteases have been implicated in TNF and Fas-induced apoptosis, but the links between these intracellular apoptotic mediators remain undefined. We show here that a specific peptide inhibitor of the ICE-like protease CPP32/Yama (DEVD-cho) blocks anti-Fasinduced apoptosis in Jurkat and U937 cells, while having no effect on TNF-induced apoptosis in U937 cells. This peptide also prevents ceramide accumulation induced by Fas engagement. Jurkat and U937 cells, as well as their mtDNA-depleted derived lines (π° cells), were sensitive to ceramide toxicity, which was not prevented by ICE-like protease inhibitors. These results, taken together, suggest that ICE-like protease activation is a prerequisite for ceramide generation and subsequent apoptosis, at least in the case of Fas-induced cell death

DR5 Up-Regulation Induced by Dichloroacetate Sensitizes Tumor Cells to Lipid Nanoparticles Decorated with TRAIL

Cancer resistance to treatments is a challenge that researchers constantly seek to overcome. For instance, TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a potential good prospect as an anti-cancer therapy, as it attacks tumor cells but not normal cells. However, treatments based in soluble TRAIL provided incomplete clinical results and diverse formulations have been developed to improve its bioactivity. In previous works, we generated a new TRAIL formulation based in its attachment to the surface of unilamellar nanoliposomes (LUV-TRAIL). This formulation greatly increased apoptosis in a wide selection of tumor cell types, albeit a few of them remained resistant. On the other hand, it has been described that a metabolic shift in cancer cells can also alter its sensitivity to other treatments. In this work, we sought to increase the sensitivity of several tumor cell types resistant to LUV-TRAIL by previous exposure to the metabolic drug dichloroacetate (DCA), which forces oxidative phosphorylation. Results showed that DCA + LUV-TRAIL had a synergistic effect on both lung adenocarcinoma A549, colorectal HT29, and breast cancer MCF7 cells. Despite DCA inducing intracellular changes in a cell-type specific way, the increase in cell death by apoptosis was clearly correlated with an increase in death receptor 5 (DR5) surface expression in all cell lines. Therefore, DCA-induced metabolic shift emerges as a suitable option to overcome TRAIL resistance in cancer cells

Role of PknH in Mycobacterium tuberculosis Complex virulence. Involvement of lung myeloid cells in vaccine-induced protection of pulmonary delivered BCG

La tuberculosis es actualmente la enfermedad infecciosa asociada a un único patógeno más devastadora, causando alrededor de 1.5 millones de muertes en 2018. A pesar de la existencia de la vacuna BCG y su amplia administración, su protección variable contra las formas respiratorias de la enfermedad junto con la creciente aparición de cepas resistentes a los antibióticos, convierte a la tuberculosis en un alarmante problema de salud global. La tuberculosis es causada en mamíferos por organismos del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTBC), cuyos genomas presentan más del 99% de homología. Sin embargo, los miembros del MTBC muestran importantes diferencias en cuanto a especificidad de huésped y virulencia. Mycobacterium tuberculosis es el principal agente causal de la tuberculosis en humanos, mientras que otros miembros del MTBC causan tuberculosis en un amplio rango de mamíferos, como Mycobacterium bovis, el principal agente causal de la tuberculosis bovina. La tuberculosis bovina provoca importantes pérdidas económicas a nivel global asociadas al control de la enfermedad y a pérdidas de producción, tanto en países desarrollados como en países en vías de desarrollo. Además, la infección zoonótica causada por M. bovis representa una amenaza para la salud humana. A pesar de su alto grado de homología genómica, M. tuberculosis y M. bovis presentan importantes diferencias fenotípicas. M. bovis ha demostrado ser más virulenta que M. tuberculosis en diferentes modelos animales, y aunque M. tuberculosis no produce enfermedad en el ganado, M. bovis presenta un amplio rango de hospedadores, que incluye diferentes animales mamíferos salvajes y domesticados, así como el ser humano. En este trabajo, hemos caracterizado la infección de diferentes miembros del MTBC en modelo de ratón con el objetivo de definir sus diferencias de virulencia in vivo. Se ha observado que M. bovis presenta mayor virulencia que M. tuberculosis y M. africanum, al inducir mayor patología pulmonar y presentar mayor capacidad de diseminación, así como mayor grado de infectividad en pulmón y mayor infiltración de neutrófilos pulmonares. Sin embargo, a pesar de las diferencias de infección observadas entre M. bovis y M. tuberculosis, los mecanismos genéticos y moleculares responsables de las diferencias en virulencia y especificidad de huésped no son conocidos. La PknH es una serina/treonina quinasa implicada en la regulación de diversos procesos bacterianos en M. tuberculosis que, además, ha sido relacionada con virulencia. La organización genética de la región del genoma que contiene el gen de la pknH (región RD900) presenta gran variación a lo largo de los miembros del MTBC, entre los que se encuentran M. tuberculosis y M. bovis. Con el objetivo de estudiar las consecuencias de estas variaciones, hemos analizado la organización genética de la región RD900 y de los genes pknH en el contexto evolutivo del MTBC, demostrando la existencia de deleciones independientes de la región RD900 en diferentes linajes del MTBC y en diferentes cepas del mismo linaje. Además, se ha observado una deleción en una región correspondiente a un dominio rico en prolinas en el gen de la pknH conservada en M. bovis y M. caprae respecto al resto de especies del MTBC. El posible papel diferencial de la PknH en la regulación de la virulencia de M. bovis como consecuencia de estas variaciones ha sido evaluado mediante la construcción y caracterización de cepas mutantes de la PknH de M. bovis y M. tuberculosis. La inserción de la PknH de M. tuberculosis en el genoma de cepas de M. bovis dio lugar a una reducción de la virulencia de las cepas mutantes respecto a las cepas silvestres de M. bovis. Además, los perfiles de expresión génica de estas cepas mostraron diferencias en la expresión de un amplio conjunto de genes, lo que sugiere un posible papel diferencial de la PknH en la regulación de la virulencia de M. tuberculosis y M. bovis. La falta de eficacia de BCG en la protección contra la tuberculosis pulmonar convierte el desarrollo de nuevas estrategias de vacunación efectivas en una necesidad urgente. El uso de rutas alternativas de vacunación para la administración de BCG o de nuevos candidatos a vacuna ha cobrado un renovado interés durante los últimos años. Una de las rutas alternativas de administración más estudiadas es la ruta pulmonar, cuyo objetivo es mimetizar la vía natural de infección de M. tuberculosis. Diversos estudios preclínicos en diferentes modelos animales han demostrado que la vacunación pulmonar con BCG confiere mejor protección que la vacunación por vía subcutánea o intradérmica. Sin embargo, los estudios de la respuesta inmune inducida por la vacunación pulmonar con BCG realizados hasta el momento están centrados en el estudio de respuestas adaptativas, pero existen pocos datos de la inmunidad innata local y de la interacción de BCG con las células mieloides del pulmón. En este trabajo, hemos administrado micobacterias virulentas y atenuadas que expresan GFP por vía pulmonar, con el objetivo de caracterizar in vivo las poblaciones de células mieloides infectadas en el pulmón y las diferencias en la dinámica de infección en modelo de ratón, observándose grandes diferencias en los patrones de diseminación de M. tuberculosis y BCG. Mientras que BCG permanece principalmente en los macrófagos, M. tuberculosis disemina de forma activa de macrófagos a neutrófilos en un mecanismo dependiente de RD1. La presencia de BCG en los pulmones da lugar a la activación de los macrófagos del pulmón. Como consecuencia, la replicación y diseminación a neutrófilos de M. tuberculosis queda restringida cuando el patógeno es fagocitado por macrófagos pre-activados en ratones previamente vacunados con BCG por vía pulmonar, pero no subcutánea, lo que correlaciona con un elevado nivel de protección. Además, se ha demostrado que el mecanismo de activación de los macrófagos pulmonares inducido por BCG requiere la contribución de las células T CD4 para su generación, pero no para su mantenimiento. De forma relevante, la vacunación pulmonar con BCG induce la activación a largo plazo de los macrófagos alveolares, los cuales mantienen su estatus de activación y capacidad bactericida durante largo tiempo una vez que la vacuna ha sido eliminada del pulmón, lo que sugiere la generación de rasgos de memoria en los macrófagos pulmonares. Estos resultados destacan la gran importancia de la dinámica celular de infección para el éxito de la infección temprana con M. tuberculosis y sugieren que los macrófagos del pulmón contribuyen de manera crucial a la protección temprana contra la tuberculosis inducida por vacunas vivas administradas por vía pulmonar.Tuberculosis (TB) is nowadays the most devastating infectious disease associated with a single pathogen. Despite the existence of the widely administered BCG vaccine, its variable protection against pulmonary TB along with the rising appearance of drug resistant strains makes this disease an alarming global health problem, causing an estimated 1.5 million deaths in 2018. TB is caused in humans and animals by organisms from the Mycobacterium tuberculosis Complex (MTBC), that show more than 99% genetic identity but exhibit distinct host preference and virulence. Unlike the human restriction of M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine TB, has one of the broadest host ranges of all known pathogens and exacts a global tremendous economic burden in both developed and developing countries. Although it mainly infects cattle, M. bovis exhibits transmissibility across many other mammalian species and it has been found to be more virulent than M. tuberculosis in different animal models. However, the molecular genetic changes that underly host specificity and infection phenotype within MTBC members have not been fully elucidated. In this work, we performed a comparison study between M. tuberculosis, M. bovis and M. africanum strains regarding their virulence and dissemination ability in vivo. In addition, we analysed RD900 genomic region across MTBC members using whole genome sequences from different MTBC strains so as to determine its role in the context of MTBC evolutionary history. The RD900 region comprises two homologous genes encoding the serine/threonine protein kinase PknH flanking the tbd2 gene. PknH is involved in the regulation of several bacterial processes and has been associated with virulence in M. tuberculosis. This analysis revealed that RD900 has been independently lost in different MTBC lineages and different strains, resulting in the generation of a single pknH gene. Importantly, all the analysed M. bovis and M. caprae strains carry a conserved deletion within a proline rich-region of pknH genes independent of RD900 presence or absence. We hypothesized that conservation of this deletion in M. bovis may affect PknH function, having a potential role in its virulence and evolutionary adaptation. To explore this hypothesis, we constructed and characterized M. bovis and M. tuberculosis pknH mutant strains. M. bovis knock-in strains containing the M. tuberculosis complete pknH gene revealed a reduced virulence compared to the wild type in the mouse model, suggesting that PknH plays an important role in the differential virulence phenotype of M. bovis vs M. tuberculosis. The failure of BCG to protect against pulmonary TB results in an urgent need for the development of new effective TB vaccines strategies. The use of alternative routes of administration for the delivery of BCG or new vaccine candidates has emerged a renewed interest during the last years. One of the most studied non-canonical routes of administration is the pulmonary delivery, with the rationale of mimicking the natural route of M. tuberculosis infection. In this regard, preclinical studies in different animal models have shown that pulmonary BCG confers significantly improved protection compared to subcutaneous or intradermal vaccination. However, current immunogenicity studies about mucosal immune responses elicited by pulmonary BCG are focused on adaptive responses, with few data of local innate immunity and BCG interaction with lung myeloid cells. In the present study, we pulmonary delivered GFP-expressing virulent and attenuated mycobacteria to characterize infected lung myeloid populations and differences in cellular infection dynamics occurring in vivo in the mouse model. We found profound differences in dissemination patterns between M. tuberculosis and BCG. Whereas BCG mainly remained in the macrophage compartment, M. tuberculosis actively spread from macrophages to neutrophils in a mechanism dependent on RD1-containg genes. BCG presence in lungs leads to the activation of lung macrophages. As a consequence, M. tuberculosis replication and neutrophil dissemination is impaired when M. tuberculosis is engulfed by BCG pre-activated macrophages in pulmonary, but not subcutaneous, vaccinated mice, which correlates with a strong vaccine-induced protection. Furthermore, we show that lung macrophages are activated by pulmonary BCG in a mechanism that required the contribution of CD4 T cells for the induction, but not maintenance, of their activation status. Noteworthy, pulmonary BCG induced long-term activation of alveolar macrophages, which maintain their activation status and early bactericidal capacity long after vaccine clearance, suggesting the generation of a memory-like response in lung macrophages. These results highlight a crucial importance of bacterial cell-to-cell infection dynamics for early M. tuberculosis infection success, and indicate that lung macrophages might crucially contribute to the early protection provided by pulmonary live TB vaccines. <br /

Apoptotic pathways are selectively activated by granzyme A and/or granzyme B in CTL-mediated target cell lysis

Purified cytolytic T lymphocyte (CTL) proteases granzyme (gzm)A and gzmB with sublytic dose of perforin (perf) initiate distinct proapoptotic pathways. Their physiological relevance in CTL-mediated target cell apoptosis is elusive. Using ex vivo virus-immune CD8+ T cells from mice deficient in perf, gzmA and/or gzmB, and the Fas-resistant EL4.F15 tumor target cell, we show that (a) CTL from gzmA−/− or gzmB−/− mice similarly induced early proapoptotic features, such as phosphatidyl serine (PS) exposure on plasma membrane, ΔΨm loss, and reactive oxygen radical generation, though with distinct kinetics; (b) CTL from gzmA−/− but not from gzmB−/− mice activate caspase 3 and 9; (c) PS exposure induced by CTL from gzmA−/− or gzmB−/− mice is prevented, respectively, by caspase inhibitors or by reactive oxygen scavengers without interfering with target cell death; and (d) all gzm-induced apoptotic features analyzed depend critically on perf. Thus, perf is the principal regulator in CTL-mediated and gzm-facilitated intracellular processes. The ability of gzmA and gzmB to induce multiple independent cell death pathways may be the hosts response to circumvent evasion strategies of pathogens and tumors

Activación de células NK humanas para el tratamiento de la leucemia

Las células asesinas naturales también conocidas como NK presentan actividad citotóxica frente a células infectadas por virus y frente a células tumorales del organismo. Estos últimos años se ha planteado el uso de células NK obtenidas a partir de la sangre periférica de donantes sanos, para el tratamiento contra leucemias linfoides y mieloides resistentes a fármacos convencionales. Para que la actividad citotóxica sobre las células tumorales sea significativa, las natural killer deben ser activadas y expandidas y para ello se requiere seguir una serie de pasos previos entre los que se encuentran la eliminación parcial de linfocitos T de la muestra, la adición de células estimuladoras 721.221 y de interleuquinas IL-2 e IL-15 al cultivo y un aislamiento positivo de las células NK con el fin de enriquecer la muestra con las células de interés. La finalidad de este trabajo es expandir y activar las células en experimentos de 18 días de duración. Además, se ha comparado la eficiencia de dos kits de aislamiento inmunomagnético, procedentes de las casas comerciales Stem Cell y Miltenyi, con el fin de averiguar cuál de los dos permitía una mayor eliminación de linfocitos T y una mayor purificación de las células NK en el cultivo

Diferenciación de células madre mesenquimales a cardiomiocitos

A día de hoy, la enfermedad cardiaca es causante de innumerables muertes por todo el mundo. Ante un ataque de isquemia o infarto, el organismo no es capaz de regenerar el daño causado en el miocardio, como tampoco son capaces los tratamientos convencionales a base de fármacos y cirugías. Es por esto que son necesarias nuevas vías para tratar estos casos de enfermedad cardiaca, teniendo un futuro muy prometedor la terapia con células madre, capaces de diferenciarse y regenerar el tejido dañado. Existen diferentes tipos de células madre, entre ellas las células madre mesenquimales (MSCs), de fácil obtención y con mucha capacidad de diferenciación. Las ADSCs (adipose-derived stem cells) son un grupo de MSCs presentes en el tejido adiposo, embebidas en una matriz de tejido conectivo con gran cantidad de tipos celulares que, al digerirse, se puede acceder a ellas. En este estudio se aislaron ADSCs de tejido adiposo y se pusieron en cultivo para diferenciarlas a células musculares cardiacas. Se realizaron tres tratamientos de diferenciación en paralelo, con dos agentes por separado, el kit de diferenciación de la casa comercial StemCell™ y el modificador epigenético 5-azacitidina, así como una combinación de ambos. Las células se caracterizaron mediante la técnica inmunoquímica de ELISA y, aunque no se han obtenido resultados del todo satisfactorios, queda abierta la puerta a futuras investigaciones que sigan esta línea.<br /

Efecto antitumoral de inmunotoxinas anti-tn conjugadas con granulisina

Este grupo de investigación ha venido estudiando por más de dos décadas la granusilina recombinante de 9 KDa (GRNLY), a partir de una colaboración con el laboratorio del Dr. Krensky, descubridor de la molécula. Se demostró la capacidad antitumoral de la GRNLY recombinante en estudios in vitro y en modelos de desarrollo de tumores humanos xenotransplantados en ratones atímicos, mediante administración intratumoral. Posteriormente, se desarrolló una estrategia para direccionar la molécula con miras a el uso sistémico. Como prueba de concepto, se generó en colaboración con la Dra. Laura Sanz una inmunotoxina dirigida contra el antígeno carcino embrionario (CEA) y se demostró su capacidad de direccionar el tratamiento hacia el tumor en un modelo atímico xenotransplantado con células tumorales que expresaban CEA. La GRNLY en solitario no era capaz de detener el crecimiento tumoral por inyeccón sistémica. Más adelante, en colaboración con el Dr. Ramón Hurtado, experto en el estudio de las glicosilaciones proteicas, se desarrollaron dos inmunotoxinas dirigidas contra el antígeno asociado a tumor Tn, encaminadas a su uso sistémico en un número mayor de tumores que la inmunotoxina anti-CEA. El modelo de expresión que usamos fue P .pastoris, que genera proteínas plegadas y glicosiladas que no contienen lipopolisacáricos (LPS), problemas éstos asociados con las proteínas recombinantes producidas en E.coli. Fue necesaria la optimización del protocolo y en ese proceso, el Dr. Javier Raso nos asesoró para mejorar los procesos biotecnológicos asociados y se innovó mediante la técnica de electroporación por campos eléctricos pulsados o PEF. El exitoso proceso incrementó el rendimiento y además se introdujeron protocolos adecuados de estabilización de las inmunotoxinas para su conservación a largo plazo. Inicialmente, se demostró que la fracción scFv de la inmunotoxina mantiene su afinididad por su antígeno purificado o expresado en la superficie de células tumorales. En general, las inmunotoxinas resultaron más citotóxicas sobre las líneas celulares a las que se unía con mayor afinidad la inmunotoxina, debido a una mayor expresión del antígeno Tn. Estudios previos mostraron que la GRNLY actúa mediante activación de la vía intrínseca de la apoptosis y en menor proporción, activación de la vía de la necroptosis y la esfingomielininasa. Se demostró que las inmunotoxinas, aunque también ejercen muerte celular al menos parcialmente a través de mecanismos apoptóticos y necroptóticos, son capaces de activar además un mecanismos necróticos que actúa con mayor rapidez. Gracias a las mejoras al rendimiento de producción de las proteínas, se pudieron realizar los ensayos in vivo en un modelo NUDE xenotransplantado con el adenocarcinoma de páncreas humano CAPAN-2. En este modelo se demostró que las inmunotoxinas SM3GRNLY y AR20.5GRNLY fueron eficientes tras inyección sistémica, disminuyendo el volumen tumoral en un 40 y un 60% respectivamente. En consonancia con el mecanismo apoptótico señalado, los cortes histológicos de tumores derivados de los ratones atímicos mostraron morfología nuclear compatible con apoptosis y marcaje positivo en inmunohistoquímica de Caspasa-3 activada.Un aspecto a considerar acerca de los resultados obtenidos en los modelos atímicos heterólogos es la falta de certeza respecto a la respuesta inmunogénica, debido a que las células inmunitarias, citocinas y matriz extracelular derivan de ratón mientras que el tumor y la granulisina son humanos. En este contexto, como primer acercamiento, se ensayó la GRNLY intratumoral en un modelo murino humanizado, los ratones NOD Rag gamma (NRG) xenotransplantados con la línea de adenocarcinoma de colon humano HT-29. Estos experimentos demostraron que se puede utilizar este modelo para futuros estudios sobre el auténtico potencial inmunogénico de la granulisina y sus inmunotoxinsas. La optimización de los protocolos biotecnológicos y la introducción de la técnica PEF para la producción/purificación de las proteínas recombinantes en el sistema de expresión P. pastoris permite continuar con la investigación de los mecanismos de acción de las inmunotoxinas y trasladar la experimentación a un modelo murino humanizado para corroborar su inmunogenicidad. La patente de las proteínas recombinantes usadas en este estudio fue adquirida por la empresa Peaches Biotech, de modo que esta investigación ha despertado el interés de las empresas farmacéuticas con perspectivas para su uso en humanos. <br /

Efecto del metabolismo glucídico sobre la supervivencia y proliferación de los tumores

Cuando una célula normal del organismo se convierte en tumoral, ésta sufre una amplia remodelación metabólica. Entre otros cambios, las células tumorales cambian su forma de obtener energía, pasando de realizar la respiración aerobia a la anaerobia. Esto es conocido como el “efecto Warburg”. En los últimos años, se está empezando a utilizar este cambio metabólico como diana contra el cáncer. En este trabajo, se ha estudiado el metabolismo glucídico del cáncer a través de dos aproximaciones. Por una parte, se ha utilizado el dicloroacetato (DCA), fármaco que fuerza a las células a realizar la fosforilación oxidativa mitocondrial, como agente sensibilizador de líneas celulares de distintos orígenes frente a la acción citotóxica de TRAIL unido a liposomas o de ibrutinib. Por otra parte, se ha caracterizado la funcionalidad de la cadena de transporte electrónico mitocondrial (mETC) y su influencia en el metabolismo glucolítico de la línea celular L929dt, derivada de la línea de fibroblasto de ratón L929, que sufrió un proceso espontáneo de pérdida de adhesión a la placa de cultivo. Los resultados muestran que el DCA es capaz de sinergizar con los fármacos utilizados en las líneas celulares ensayadas. Además de esto, las células L929dt presentan una disminución en la incorporación del complejo I de la mETC en supercomplejos, lo cual reduce su capacidad respiratoria y las hace sensibles al DCA

Dynamic Changes in miRNA Expression during the Generation of Expanded and Activated NK Cells

Cytotoxicity; Immunotherapy; miRNACitotoxicidad; Inmunoterapia; miARNCitotoxicitat; Immunoteràpia; miRNATherapies based on allogenic Natural Killer (NK) cells are becoming increasingly relevant, and our laboratory has produced expanded and activated NK (eNK) cells that are highly cytotoxic against several hematological cancers when used alone or in combination with currently approved therapeutic monoclonal antibodies. In order to produce eNK cells, healthy human donor NK cells undergo a 20-day expansion protocol with IL-2, IL-15 and Epstein–Barr virus (EBV)-transformed lymphoblastoid feeder cells. In order to produce an even more potent eNK-based therapy, we must elucidate the changes our protocol produces within healthy NK cells. To understand the post-transcriptional changes responsible for the increased cytolytic abilities of eNK cells, we performed microRNA (miRNA) expression analysis on purified NK cells from day 0 and day 20 of the protocol using quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR). Of the 384 miRNAs profiled, we observed changes in the expression of 64 miRNAs, with especially significant changes in 7 of them. The up-regulated miRNAs of note were miRs-146a, -124, -34a, and -10a, which are key in the regulation of cell survival through the modulation of pro-apoptotic genes such as PUMA. The down-regulation of miRs-199a, -223, and -340 was also detected and is associated with the promotion of NK cell cytotoxicity. We validated our analysis using immunoblot and flow cytometry studies on specific downstream targets of both up- and down-regulated miRNAs such as PUMA and Granzyme B. These results corroborate the functional importance of the described miRNA expression patterns and show the wide variety of changes that occur in eNK cells at day 20.This research was supported by project PID2019-105128RB-I00 financed by MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ and “FEDER Una manera de hacer Europa” and by Government of Aragon grant B31_20R