Involvement of the specialized DNA polymerase zeta during heterochromatin replication in mammalian cells

La synthèse translésionnelle (TLS) est un processus important pour franchir des lésions de l’ADN au cours de la duplication du génome dans les cellules humaines. Le modèle « d’échange de polymérases » suggère que la polymérase réplicative est transitoirement remplacée par une polymérase spécialisée, qui va franchir le dommage et permettre de continuer la synthèse d’ADN. Ces ADN polymérases spécialisées appelées Pol êta (η), iota (ι), kappa (κ), zêta (ζ), et Rev1 ont été bien caractérisées pour leur capacité à franchir différents types de lésions in vitro. Un concept en émergence est que ces enzymes pourraient également être requises pour répliquer des zones spécifiques du génome qui sont « difficiles à répliquer ». Polζ est constituée d’au moins 2 sous-unités : Rev3 qui est la sous-unité catalytique et Rev7 sous-unité augmentant l’activité de Rev3L. Jusqu'ici, la fonction la mieux caractérisée de Polζ était de sa capacité à catalyser l'extension d'un mésappariement en face d'une lésion d'ADN. Cependant, il a été montré que la sous unité catalytique Rev3 de levure et humaine interagissent avec les deux sous-unités accessoires de Polδ que sont pol31 et pol32 chez la levure et p50 et p66 chez l’humain. Il a aussi été mis en évidence que Rev3L est importante pour la réplication des sites fragiles (SFCs) dans les cellules humaines, zones connues pour être à l’origine d’une instabilité génétique et pour être répliquées de manière tardive (en G2/M). Tout ceci suggère que Polζ pourrait jouer un rôle dans la réplication du génome non endommagé, et plus spécifiquement lorsque des barrières naturelles (e.g. ADN non-B) entravent la progression normale des fourches de réplication.Chez la levure S. cerevisiae, l’inactivation du gène rev3 est viable et conduit à une diminution de la mutagenèse spontanée ou induite par des agents génotoxiques suggérant que Polζ est impliquée dans le franchissement mutagène des lésions endogènes ou induite. En revanche, l’inactivation du gène Rev3L chez la souris est embryonnaire létale alors que la plupart des autres ADN polymérases spécialisées ne sont pas vitales. Ceci suggère que Polζ a acquis des fonctions essentielles au cours de l’évolution qui restent inconnues à ce jour. Les fibroblastes embryonnaires murins (MEF) Rev3L-/- présente une grande instabilité génétique spontanée associée une forte augmentation de cassures et de translocations chromosomiques indiquant que Polζ est directement impliquée dans le maintien de la stabilité du génome. Afin de clarifier le rôle de cette polymérase spécialisée au cours de la réplication du génome, nous avons entrepris de procéder à une étude sur les relations structure/fonction/localisation de la protéine Rev3. Notre étude met en évidence que la progression en phase S des cellules Rev3L-/- est fortement perturbée, notamment en fin de phase S. Dans ces cellules invalidées pour Rev3L, on constate des changements dans le programme de réplication et plus particulièrement dans des régions de transition (TTR) répliquées à partir du milieu de la phase S. Nous montrons aussi un enrichissement global en marques épigénétiques répressives (marques associées à l’hétérochromatine et méthylation de l’ADN) suggérant qu’un ralentissement de la progression de la fourche de réplication à des loci particuliers peut promouvoir une hétérochromatinisation lorsque Rev3L est invalidé. De manière intéressante, nous constatons une diminution de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans le développement qui pourrait peut-être expliquer la létalité embryonnaire constatée en absence de Rev3L. Enfin, nous mettons en évidence une interaction directe entre la protéine d’organisation de l’hétérochromatine HP1α et Rev3L via un motif PxVxL. Tout ceci nous suggère fortement que Polζ pourrait assister les ADN polymérases réplicatives Polδ et Polε dans la réplication des domaines compactés de la chromatine en milieu et fin de phase S.DNA polymerase zeta (Polζ) is a key player in Translesion DNA synthesis (TLS). Polζ is unique among TLS polymerases in mammalian cells, because inactivation of the gene encoding its catalytic subunit (Rev3L) leads to embryonic lethality in the mouse. However little is known about its biological functions under normal growth conditions.Here we show that S phase progression is impaired in Rev3L-/- MEFs with a delay in mid and late S phase. Genome-wide profiling of replication timing revealed that Rev3L inactivation induces changes in the temporal replication program, mainly in particular genomic regions in which the replication machinery propagates a slower velocity. We also highlighted a global enrichment of repressive histone modifications as well as hypermethylation of major satellites DNA repeats in Rev3L-deficient cells, suggesting that fork movements can slow down or stall in specific locations, and a delay in restarting forks could promote heterochromatin formation in Rev3L-depleted cells. As a direct or indirect consequence, we found that several genes involved in growth and development are down-regulated in Rev3L-/- MEFs, which might potentially explain the embryonic lethality observed in Rev3L KO mice. Finally we discovered that HP1α directly interacts and recruits Rev3L to pericentromeric heterochromatin. We therefore propose that Polζ has been co-opted by evolution to assist DNA polymerase ε and δ in duplicating condensed chromatin domains during mid and late S phase

Implication de l’ADN polymérase spécialisée zêta au cours de la réplication de l’hétérochromatine dans les cellules de mammifères

DNA polymerase zeta (Polζ) is a key player in Translesion DNA synthesis (TLS). Polζ is unique among TLS polymerases in mammalian cells, because inactivation of the gene encoding its catalytic subunit (Rev3L) leads to embryonic lethality in the mouse. However little is known about its biological functions under normal growth conditions.Here we show that S phase progression is impaired in Rev3L-/- MEFs with a delay in mid and late S phase. Genome-wide profiling of replication timing revealed that Rev3L inactivation induces changes in the temporal replication program, mainly in particular genomic regions in which the replication machinery propagates a slower velocity. We also highlighted a global enrichment of repressive histone modifications as well as hypermethylation of major satellites DNA repeats in Rev3L-deficient cells, suggesting that fork movements can slow down or stall in specific locations, and a delay in restarting forks could promote heterochromatin formation in Rev3L-depleted cells. As a direct or indirect consequence, we found that several genes involved in growth and development are down-regulated in Rev3L-/- MEFs, which might potentially explain the embryonic lethality observed in Rev3L KO mice. Finally we discovered that HP1α directly interacts and recruits Rev3L to pericentromeric heterochromatin. We therefore propose that Polζ has been co-opted by evolution to assist DNA polymerase ε and δ in duplicating condensed chromatin domains during mid and late S phase.La synthèse translésionnelle (TLS) est un processus important pour franchir des lésions de l’ADN au cours de la duplication du génome dans les cellules humaines. Le modèle « d’échange de polymérases » suggère que la polymérase réplicative est transitoirement remplacée par une polymérase spécialisée, qui va franchir le dommage et permettre de continuer la synthèse d’ADN. Ces ADN polymérases spécialisées appelées Pol êta (η), iota (ι), kappa (κ), zêta (ζ), et Rev1 ont été bien caractérisées pour leur capacité à franchir différents types de lésions in vitro. Un concept en émergence est que ces enzymes pourraient également être requises pour répliquer des zones spécifiques du génome qui sont « difficiles à répliquer ». Polζ est constituée d’au moins 2 sous-unités : Rev3 qui est la sous-unité catalytique et Rev7 sous-unité augmentant l’activité de Rev3L. Jusqu'ici, la fonction la mieux caractérisée de Polζ était de sa capacité à catalyser l'extension d'un mésappariement en face d'une lésion d'ADN. Cependant, il a été montré que la sous unité catalytique Rev3 de levure et humaine interagissent avec les deux sous-unités accessoires de Polδ que sont pol31 et pol32 chez la levure et p50 et p66 chez l’humain. Il a aussi été mis en évidence que Rev3L est importante pour la réplication des sites fragiles (SFCs) dans les cellules humaines, zones connues pour être à l’origine d’une instabilité génétique et pour être répliquées de manière tardive (en G2/M). Tout ceci suggère que Polζ pourrait jouer un rôle dans la réplication du génome non endommagé, et plus spécifiquement lorsque des barrières naturelles (e.g. ADN non-B) entravent la progression normale des fourches de réplication.Chez la levure S. cerevisiae, l’inactivation du gène rev3 est viable et conduit à une diminution de la mutagenèse spontanée ou induite par des agents génotoxiques suggérant que Polζ est impliquée dans le franchissement mutagène des lésions endogènes ou induite. En revanche, l’inactivation du gène Rev3L chez la souris est embryonnaire létale alors que la plupart des autres ADN polymérases spécialisées ne sont pas vitales. Ceci suggère que Polζ a acquis des fonctions essentielles au cours de l’évolution qui restent inconnues à ce jour. Les fibroblastes embryonnaires murins (MEF) Rev3L-/- présente une grande instabilité génétique spontanée associée une forte augmentation de cassures et de translocations chromosomiques indiquant que Polζ est directement impliquée dans le maintien de la stabilité du génome. Afin de clarifier le rôle de cette polymérase spécialisée au cours de la réplication du génome, nous avons entrepris de procéder à une étude sur les relations structure/fonction/localisation de la protéine Rev3. Notre étude met en évidence que la progression en phase S des cellules Rev3L-/- est fortement perturbée, notamment en fin de phase S. Dans ces cellules invalidées pour Rev3L, on constate des changements dans le programme de réplication et plus particulièrement dans des régions de transition (TTR) répliquées à partir du milieu de la phase S. Nous montrons aussi un enrichissement global en marques épigénétiques répressives (marques associées à l’hétérochromatine et méthylation de l’ADN) suggérant qu’un ralentissement de la progression de la fourche de réplication à des loci particuliers peut promouvoir une hétérochromatinisation lorsque Rev3L est invalidé. De manière intéressante, nous constatons une diminution de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans le développement qui pourrait peut-être expliquer la létalité embryonnaire constatée en absence de Rev3L. Enfin, nous mettons en évidence une interaction directe entre la protéine d’organisation de l’hétérochromatine HP1α et Rev3L via un motif PxVxL. Tout ceci nous suggère fortement que Polζ pourrait assister les ADN polymérases réplicatives Polδ et Polε dans la réplication des domaines compactés de la chromatine en milieu et fin de phase S

DNA polymerase zeta contributes to heterochromatin replication to prevent genome instability

International audienceThe DNA polymerase zeta (Polf) plays a critical role in bypassing DNA damage. REV3L, the catalytic subunit of Polf, is also essential in mouse embryonic development and cell proliferation for reasons that remain incompletely understood. In this study, we reveal that REV3L protein interacts with heterochromatin components including repressive histone marks and localizes in pericentromeric regions through direct interaction with HP1 dimer. We demonstrate that Polf/REV3L ensures progression of replication forks through difficult-to-replicate pericentromeric heterochromatin, thereby preventing spontaneous chromosome break formation. We also find that Rev3l-deficient cells are compromised in the repair of heterochromatin-associated double-stranded breaks, eliciting deletions in late-replicating regions. Lack of REV3L leads to further consequences that may be ascribed to heterochromatin replication and repair-associated functions of Polf, with a disruption of the temporal replication program at specific loci. This is correlated with changes in epigenetic landscape and transcriptional control of developmentally regulated genes. These results reveal a new function of Polf in preventing chromosome instability during replication of heterochromatic regions