Solvent effects on the NMR shieldings of stacked DNA base pairs

Stacking effects are among the most important effects in DNA. We have recently studied their influence in fragments of DNA through the analysis of NMR magnetic shieldings, firstly in vacuo. As a continuation of this line of research we show here the influence of solvent effects on the shieldings through the application of both explicit and implicit models. We found that the explicit solvent model is more appropriate for consideration due to the results matching better in general with experiments, as well as providing clear knowledge of the electronic origin of the value of the shieldings. Our study is grounded on a recently developed theoretical model of our own, by which we are able to learn about the magnetic effects of given fragments of DNA molecules on selected base pairs. We use the shieldings of the atoms of a central base pair (guanine-cytosine) of a selected fragment of DNA molecules as descriptors of physical effects, like π-stacking and solvent effects. They can be taken separately and altogether. The effect of π-stacking is introduced through the addition of some pairs above and below of the central base pair, and now, the solvent effect is considered including a network of water molecules that consist of two solvation layers, which were fixed in the calculations performed in all fragments. We show that the solvent effects enhance the stacking effects on the magnetic shieldings of atoms that belong to the external N-H bonds. The net effect is of deshielding on both atoms. There is also a deshielding effect on the carbon atoms that belong to C 00000000 00000000 00000000 00000000 11111111 00000000 11111111 00000000 00000000 00000000 O bonds, for which the oxygen atom has an explicit hydrogen bond (HB) with a solvent water molecule. Solvent effects are found to be no higher than a few percent of the total value of the shieldings (between 1% and 5%) for most atoms, although there are few for which such an effect can be higher. There is one nitrogen atom, the acceptor of the HB between guanine and cytosine, that is more highly shielded (around 15 ppm or 10%) when the explicit solvent is considered. In a similar manner, the most external nitrogen atom of cytosine and the hydrogen atom that is bonded to it are highly deshielded (around 10 ppm for nitrogen and around 3 ppm for hydrogen).Fil: Martínez, Fernando Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica; ArgentinaFil: Adler, Natalia Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Cavasotto, Claudio Norberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica; Argentina. Universidad Austral; ArgentinaFil: Aucar, Gustavo Adolfo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica; Argentina. Universidad Nacional del Nordeste; Argentin

Temporal changes in the expression of the translocator protein TSPO and the steroidogenic enzyme 5a-reductase in the dorsal spinal cord of animals with neuropathic pain: effects of progesterone administration

Neuropathic pain is a frequent complication of spinal cord injury (SCI), still refractory to conventional treatment. The presence and biological activity of steroidogenic regulatory proteins and enzymes in the spinal cord suggests that neurosteroids locally generated could modulate pain messages. In this study we explored temporal changes in the spinal expression of the 18kDa translocator protein TSPO, the steroidogenic acute regulatory protein (StAr) and the steroidogenic enzyme 5-reductase (5α-RI/II) in an experimental model of central chronic pain. Male Sprague-Dawley rats were subjected to a SCI and sacrificed at different time points (1, 14 or 28 days). The development of mechanical and cold allodynia was assessed. Injured animals showed an early increase in the mRNA levels of TSPO and 5α-RII, whereas in the chronic phase a significant decrease in the expression of 5α-RI and 5α-RII was observed, coinciding with the presence of allodynic behaviors. Furthermore, since we have shown that progesterone (PG) administration may offer a promising perspective in pain modulation, we also evaluated the expression of steroidogenic proteins and enzymes in injured animals receiving daily injections of the steroid. PG-treated did not develop allodynia and showed a marked increase in the mRNA levels of TSPO, StAR, 5α-RI and 5α-RII 28 days after injury. Our results suggest that in the acute phase after SCI, the increased expression of TSPO and 5α-RII may represent a protective endogenous response against tissue injury, which is not maintained in the chronic allodynic phase. PG may favor local steroidogenesis and the production of its reduced metabolites, which could contribute to the antiallodynic effects observed after PG treatment. Fil: Coronel, Maria Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Sánchez Granel, María Luz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Raggio, María Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Adler, Natalia Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: de Nicola, Alejandro Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Labombarda, Maria Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica Humana; ArgentinaFil: Gonzalez, Susana Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica Humana; Argentin

Insights into the product release mechanism of dengue virus NS3 helicase

The non-structural protein 3 helicase (NS3h) is a multifunctional protein that is critical in RNA replication and other stages in the flavivirus life cycle. NS3h uses energy from ATP hydrolysis to translocate along single stranded nucleic acid and to unwind double stranded RNA. Here we present a detailed mechanistic analysis of the product release stage in the catalytic cycle of the dengue virus (DENV) NS3h. This study is based on a combined experimental and computational approach of product-inhibition studies and free energy calculations. Our results support a model in which the catalytic cycle of ATP hydrolysis proceeds through an ordered sequential mechanism that includes a ternary complex intermediate (NS3h-Pi-ADP), which evolves releasing the first product, phosphate (Pi), and subsequently ADP. Our results indicate that in the product release stage of the DENV NS3h a novel open-loop conformation plays an important role that may be conserved in NS3 proteins of other flaviviruses as well.Fil: Adler, Natalia Sol. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Cababie, Leila Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Sarto, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Cavasotto, Claudio Norberto. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Gebhard, Leopoldo German. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Estrin, Dario Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; ArgentinaFil: Gamarnik, Andrea Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Arrar, Mehrnoosh. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Calculo. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Calculo; ArgentinaFil: Kaufman, Sergio Benjamín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; Argentin

The ULK1-FBXW5-SEC23B nexus controls autophagy

In response to nutrient deprivation, the cell mobilizes an extensive amount of membrane to form and grow the autophagosome, allowing the progression of autophagy. By providing membranes and stimulating LC3 lipidation, COPII (Coat Protein Complex II) promotes autophagosome biogenesis. Here, we show that the F-box protein FBXW5 targets SEC23B, a component of COPII, for proteasomal degradation and that this event limits the autophagic flux in the presence of nutrients. In response to starvation, ULK1 phosphorylates SEC23B on Serine 186, preventing the interaction of SEC23B with FBXW5 and, therefore, inhibiting SEC23B degradation. Phosphorylated and stabilized SEC23B associates with SEC24A and SEC24B, but not SEC24C and SEC24D, and they re-localize to the ER-Golgi intermediate compartment, promoting autophagic flux. We propose that, in the presence of nutrients, FBXW5 limits COPII-mediated autophagosome biogenesis. Inhibition of this event by ULK1 ensures efficient execution of the autophagic cascade in response to nutrient starvation.Fil: Jeong, Yeon-Tae. Nyu School Of Medicine;Fil: Simoneschi, Daniele. Nyu School Of Medicine;Fil: Keegan, Sarah. Nyu School Of Medicine;Fil: Melville, David. University of California at Berkeley; Estados UnidosFil: Adler, Natalia Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Saraf, Anita. Universidad Austral; ArgentinaFil: Florens, Laurence. Stowers Institute For Medical Research;Fil: Washburn, Michael P.. Stowers Institute For Medical Research;Fil: Cavasotto, Claudio Norberto. University Of Kansas Medical Center;Fil: Fenyö, David. Stowers Institute For Medical Research;Fil: Cuervo, Ana-Maria. Universidad Austral; ArgentinaFil: Rossi, Mario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Pagano, Michele. Nyu School Of Medicine

Búsqueda de hits antivirales mediante el diseño racional de fármacos asistido por computadora

El grupo de Química Medicinal del CIBION tiene como objetivo principal llevar a cabo el diseño y la síntesis de pequeñas moléculas bioactivas. Como punto inicial del proceso de descubrimiento de nuevos fármacos, realizamos la búsqueda de moléculas candidatas mediante screening virtual y el diseño de novo. Los compuestos seleccionados son sintetizados y evaluados frente a blancos específicos. Una vez que identificamos las moléculas líderes, llevamos a cabo modificaciones estructurales con el objeto de optimizar la potencia farmacológica mediante docking, SAR, QSAR y FEP. Actualmente, estamos buscando inhibidores contra el virus del dengue (DENV) [1], zika (ZIKV) y chikungunya (CHIKV), diarrea viral bovina (BVDV) [2]. Por otro lado, se están iniciando nuevos estudios enfocados en la encapsulación de compuestos activos, a fin de mejorar las propiedades fisicoquímicas y/o la biodisponibilidad de los candidatos. En particular, se han realizado pruebas de encapsulación de derivados de 2-fenilquinazolinas sustituídas en posición 4, los cuales presentaron con actividad antiviral contra BVDV del orden de 1 µM, con (2-Hydroxipropil)-β-ciclodextrina, obteniendo notorias mejoras en la solubilidad de los compuestos (agua MilliQ). Con respecto a DENV, se están iniciando los estudios de encapsulación utilizando quitosano funcionalizado, a fin de mejorar la biodisponibilidad de castanospermina, empleada como sustrato modelo.Fil: Fernandez, Gabriela Araceli. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Leal, Emilse Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Battini, Leandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Fidalgo, Daniela Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Adler, Natalia Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Enderle, Ana Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Rosas, Rocio Ayelen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Gallo, Facundo Nahuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Bollini, Mariela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaII Jornada de Jóvenes BionanocientíficxsArgentinaCentro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares ErijmanInstituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini

De novo design approaches targeting an envelope protein pocket to identify small molecules against dengue virus

Dengue fever is a mosquito-borne viral disease that has become a major public health concern worldwide. This disease presents with a wide range of clinical manifestations, from a mild cold-like illness to the more serious hemorrhagic dengue fever and dengue shock syndrome. Currently, neither an approved drug nor an effective vaccine for the treatment are available to fight the disease. The envelope protein (E) is a major component of the virion surface. This protein plays a key role during the viral entry process, constituting an attractive target for the development of antiviral drugs. The crystal structure of the E protein reveals the existence of a hydrophobic pocket occupied by the detergent n-octyl-β-d-glucoside (β-OG). This pocket lies at the hinge region between domains I and II and is important for the low pH-triggered conformational rearrangement required for the fusion of the virion with the host's cell. Aiming at the design of novel molecules which bind to E and act as virus entry inhibitors, we undertook a de novo design approach by “growing” molecules inside the hydrophobic site (β-OG). From more than 240000 small-molecules generated, the 2,4 pyrimidine scaffold was selected as the best candidate, from which one synthesized compound displayed micromolar activity. Molecular dynamics-based optimization was performed on this hit, and thirty derivatives were designed in silico, synthesized and evaluated on their capacity to inhibit dengue virus entry into the host cell. Four compounds were found to be potent antiviral compounds in the low-micromolar range. The assessment of drug-like physicochemical and in vitro pharmacokinetic properties revealed that compounds 3e and 3h presented acceptable solubility values and were stable in mouse plasma, simulated gastric fluid, simulated intestinal fluid, and phosphate buffered saline solution.Fil: Leal, Emilse Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Adler, Natalia Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentina. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Fernandez, Gabriela Araceli. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Gebhard, Leopoldo German. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Battini, Leandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Aucar, María Gabriela. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Videla, Mariela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Monge, Maria Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Hernández de los Ríos, Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Acosta Dávila, John. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Morell, María L.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Cordo, Sandra Myriam. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: García, Cybele C.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Gamarnik, Andrea Vanesa. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Cavasotto, Claudio Norberto. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; Argentina. Universidad Austral; ArgentinaFil: Bollini, Mariela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentin

Mechanistic study and computer-aided drug design against dengue virus

El dengue es la enfermedad viral transmitida por artrópodos de mayor incidencia a nivel mundial, alcanzando valores aproximados de 390 millones de casos al año. Actualmente, no existen vacunas ni terapias antivirales efectivas para el tratamiento de la infección, por lo que la necesidad del desarrollo de las mismas resulta imperiosa. De esta forma, el objetivo del presente trabajo fue identificar pequeñas moléculas que puedan presentar actividad antiviral contra el virus del dengue mediante el diseño racional guiado por computadora, eligiéndose como blancos terapéuticos a la glicoproteína de envoltura (E) y el dominio helicasa de la proteína no estructural número 3 (NS3h). La glicoproteína E es una proteína de fusión de clase II que se encuentra formando dímeros sobre la superficie de la partícula viral. Esta proteína resulta esencial para el proceso de unión a receptor de la célula huésped y fusión de membranas para internalización de la partícula viral y liberación del material genético, resultando un blanco atractivo para el desarrollo de antivirales. Su estructura cristalina revela la existencia de un bolsillo hidrofóbico ocupado por el detergente n-octil-β-glucósido (β-OG), región que actúa a modo de bisagra entre los dominios I y II de la proteína y tiene un rol fundamental en los cambios conformacionales que tienen lugar durante el proceso fusión. De esta forma, fue propuesto que moléculas pequeñas capaces de unirse al sitio β-OG podrían inhibir la entrada del virus a la célula. Así, se procedió a la generación de moléculas candidatas a través de la estrategia de diseño de novo seguida de optimización de compuestos líderes guiada por computadora, haciendo uso de simulaciones de dinámica molecular clásica. Los compuestos seleccionados fueron sintetizados y posteriormente evaluados en su capacidad de inhibir la entrada del virus a la célula por los grupos de las Dras. Cybele García y Andrea Gamarnik. Se obtuvieron finalmente cuatro compuestos con actividad anti-DENV2 submicromolar. NS3 es una proteína multifuncional indispensable para el proceso de replicación viral, implicada en los procesos de replicación genómica, encapsidación, evasión de la respuesta inmune y procesamiento de la poliproteína viral. Posee dos dominios funcionales que se encuentran unidos por un linker flexible: en la región N-terminal presenta actividad serín proteasa que actúa en el clivaje de la poliproteína viral, mientras que la región C terminal cuenta con actividad helicasa, nucleósido 5’-trifosfatasa (NTPasa), RNA trifos-fatasa y de RNA annealing. Se ha demostrado que mutaciones en el dominio helicasa que conducen a la pérdida de actividad afectan directamente la supervivencia viral, convirtiéndola también en un blanco atractivo para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, los inhibidores competitivos que se unen a los sitios activos de este tipo de enzimas suelen presentar problemas de especificidad. De esta forma, se plante ́o como objetivo generar moléculas pequeñas capaces de inhibir alostéricamente la actividad de NS3h. En una primera instancia se procedió al estudio mecanístico de la enzima, a fin de conocer mejor su funcionamiento y detectar posibles sitios de unión a ligando que permitieran la modulación alostérica de la actividad. Se estudió puntualmente el mecanismo de salida de productos de hidrólisis de ATP del sitio catalítico. Para esto se emplearon dos enfoques independientes: por un lado, se realizó un estudio de la cinética de estado estacionario de hidrólisis de ATP en presencia de productos, llevada a cabo por el grupo del Dr. Sergio Kaufman, y, por otro, cálculos computacionales de perfiles de energía libre asociados a la salida de fosfato (Pi) y ADP, empleando simulaciones de dinámica molecular guiada. Los resultados obtenidos fueron consistentes con un mecanismo de salida ordenado donde el Pi es el primero en ser liberado, seguido por ADP y, por su parte, los perfiles de energía libre generados sugirieron además un rol fundamental de una conformación abierta novedosa de la proteína en la salida de productos. Luego, mediante el uso de programas de búsqueda de hot spots se encontró un bolsillo que disminuía su volumen al pasar de la forma cerrada a la abierta de la proteína. Se postuló entonces que la unión de una molécula pequeña en ese sitio impediría que el mismo se compacte e influiría sobre la dinámica del cambio conformacional proteico, afectando el mecanismo de salida de productos e inhibiendo la actividad ATPasa de la enzima. De esta forma, se llevó a cabo un screening virtual en el sitio propuesto, empleando cuatro programas de docking distintos y combinando los resultados obtenidos mediante técnicas consenso. Se realizaron a continuación simulaciones de dinámica clásica sobre los compuestos que presentaron mejores valores de puntaje consenso y los compuestos más promisorios fueron adquiridos para evaluar su capacidad inhibitoria de la actividad ATPasa de NS3h in vitro. Contrario a lo esperado, ningún compuesto seleccionado mostró inhibición de la actividad pero en dos casos se observó un aumento de la misma. Se postuló entonces la posibilidad de que la unión de estas moléculas al dominio 3 pudiera tener un impacto negativo sobre la estabilidad de la conformación cerrada, sustentada por un aumento de la movilidad proteica observado en las simulaciones realizadas. Será necesario llevar adelante nuevos experimentos para validar esta hipótesis pero, en caso de confirmarse, podría aportar información valiosa sobre el funcionamiento de la enzima a la hora del diseño racional de inhibidores alostéricos.Dengue fever is a mosquito-borne viral disease that has become a major public health concern worldwide, reaching approximate values of 390 million cases of infection per year. Currently, neither an approved drug nor an effective vaccine are available to fight the disease, so multiple efforts are being made by both industry and academia to develop anti dengue virus agents. Thus, the main goal of this thesis is to identify small molecules that could act as antiviral agents against dengue virus through computer-aided rational drug design. The chosen molecular targets to this end were the envelope protein (E) and the helicase domain of the non structural protein 3 (NS3h). The envelope glycoprotein E is a class II fusion protein that exists as dimers on the sur- face of mature virions. This protein plays a key role during the viral entry process, since it binds to host cell receptors and induces membranes fusion to allow internalization of the viral particle, constituting an attractive target for the development of antiviral drugs. The crystal structure of the E protein reveals the existence of a hydrophobic pocket occupied by the detergent n-octyl-β-d-glucoside (β-OG). This pocket lies at the hinge region between domains I and II and is important for the low pH-triggered conformational rearrangement required for the fusion of the virion with the host’s cell. Therefore, it was proposed that small molecules capable of binding to the β-OG pocket might inhibit virus entry. Candidate molecules that would bind this pocket were then generated employing a de novo design approach followed by computer-aided leader optimization through molecular dynamics simulations. The selected compounds were synthesized and subsequently evaluated for their ability to inhibit dengue virus entry into the host cell by Drs. Cybele Garcia and Andrea Gamarnik’s groups. Four compounds were found to be potent antiviral compounds in the low-micromolar range. NS3 is a multifunctional viral protein that is critical in the dengue virus life cycle, specifically implicated in viral replication, encapsidation, host immune evasion, and processing of the polyprotein precursor. The N-terminal region of NS3 is characterized as a serine protease, whereas the C-terminal region is classified as an RNA helicase, which also has NTPase, RTPase and RNA annealing activities. Mutations in the helicase domain that lead to loss of activity correlated directly with lack of virus replication, making NS3h also an attractive target for antiviral research. Helicases are nevertheless challenging drug targets because potent inhibitors are often not specific. Thus, we focused in identifying molecules that could act as allosteric NS3h inhibitors. As a first step, a mechanistic study of the enzime was performed to better understand its functioning and detect possible ligand-binding sites that would allow allosteric modulation of its activity. In particular, the product release mechanism of the catalytic cycle of ATP hydrolysis was analyzed. This study was based on a combined experimental and computational approach of product-inhibition studies, carried out by Dr. Sergio Kaufman’s group, and free energy calculations through steered molecular dynamics simulations. The results obtained support a model in which the catalytic cycle of ATP hydrolysis proceeds through an ordered sequential mechanism that includes a ternary complex intermediate (NS3h-Pi-ADP), which evolves releasing the first product, phosphate (Pi), and subsequently ADP. The results also indicate that in the product release stage a novel open-loop conformation of NS3h plays an important role. Then, employing hot spots prediction programs, a new pocket was found that reduces its volume when changing from the closed conformation of the protein to the open form. Thus, it was proposed that the union of a small molecule to this site would interfere with its volume reduction and affect NS3h conformational change dynamics, disrupting product release mechanism and inhibiting ATPase activity. Therefore, a virtual screening campaign was performed in this pocket employing four different docking softwares and combining the results through consensus techniques. Classical molecular dynamics simulations were then performed to the top molecules and the most promising compounds were acquired to evaluate their capacity to inhibit in vitro NS3h ATPase activity. Contrary to expectations, no selected compound showed inhibition of enzymatic activity but in two cases an increase was observed. It was then postulated that the binding of these molecules to domain 3 could have a negative impact on the stability of the closed conformation, supported by an increase in protein mobility observed in the simulations performed. It will be necessary to carry out new experiments to validate this hypothesis but, if confirmed, it could provide valuable information on the functioning of the enzyme when it comes to the rational design of allosteric inhibitors.Fil: Adler, Natalia Sol. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Computational chemistry in drug lead discovery and design

The main contributions of our group during the last 15 years developing and using biomolecular simulation tools in drug lead discovery and design, in close collaboration with experimental researchers, are presented. Special emphasis has been given to methodological improvements in the following areas: (1) target homology modeling incorporating knowledge about known ligands to accurately characterize the binding site; (2) designing alternative strategies to account for protein flexibility in high-throughput docking; (3) development of stochastic- and normal-mode-based methods to de novo design structurally diverse protein conformers; (4) development and validation of quantum mechanical semi-empirical linear-scaling calculations to correctly estimate ligand binding free energy. Several successful cases of computer-aided drug discovery are also presented, especially our recent work on viral targets.Fil: Cavasotto, Claudio Norberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck; ArgentinaFil: Aucar, María Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck; ArgentinaFil: Adler, Natalia Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck; Argentin

dockECR: Open consensus docking and ranking protocol for virtual screening of small molecules

The development of open computational pipelines to accelerate the discovery of treatments for emerging diseases allows finding novel solutions in shorter periods of time. Consensus molecular docking is one of these approaches, and its main purpose is to increase the detection of real actives within virtual screening campaigns. Here we present dockECR, an open consensus docking and ranking protocol that implements the exponential consensus ranking method to prioritize molecular candidates. The protocol uses four open source molecular docking programs: AutoDock Vina, Smina, LeDock and rDock, to rank the molecules. In addition, we introduce a scoring strategy based on the average RMSD obtained from comparing the best poses from each single program to complement the consensus ranking with information about the predicted poses. The protocol was benchmarked using 15 relevant protein targets with known actives and decoys, and applied using the main protease of the SARS-CoV-2 virus. For the application, different crystal structures of the protease, and frames obtained from molecular dynamics simulations were used to dock a library of 79 molecules derived from previously co-crystallized fragments. The ranking obtained with dockECR was used to prioritize eight candidates, which were evaluated in terms of the interactions generated with key residues from the protease. The protocol can be implemented in any virtual screening campaign involving proteins as molecular targets.Fil: Ochoa, Rodrigo. Universidad de Antioquia; ColombiaFil: Palacio Rodriguez, Karen. Universidad de Antioquia; ColombiaFil: Clemente, Camila Mara. Universidad Nacional de Villa María; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Adler, Natalia Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentina. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; Argentin

Progesterone modulates pro-inflammatory cytokine expression profile after spinal cord injury: implications for neuropathic pain

Neuropathic pain is a frequent complication of spinal cord injury (SCI), still refractory to conventional treatment. Glial cell activation and cytokine production contribute to the pathology of central neuropathic syndromes. In this study we evaluated the effects of progesterone, a neuroactive steroid, on pain development and the spinal expression of IL-1β, its receptors (IL-1RI and IL-1RII) and antagonist (IL-1ra), IL-6 and TNFα, and NR1 subunit of NMDAR. Our results show that progesterone, by modulating the expression of pro-inflammatory cytokines and neuronal IL-1RI/NR1 colocalization, emerges as a promising agent to prevent chronic pain after SCI.Fil: Coronel, Maria Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Raggio, María Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Adler, Natalia Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: de Nicola, Alejandro Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica Humana; ArgentinaFil: Labombarda, Maria Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica Humana; ArgentinaFil: Gonzalez, Susana Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica Humana; Argentin