Obtención y caracterización de una nueva estructura coclear con capacidad adyuvante derivada del proteoliposoma de Vibrio cholerae O1

Los adyuvantes son componentes esenciales de las formulaciones vacunales. Sin embargo, pocos han sido licenciados para su uso en humanos y solo la subunidad B de la toxina de cólera ha sido aprobada por vía mucosal. El objetivo de este trabajo es obtener una nueva estructura coclear a partir del proteoliposoma Vibrio cholerae O1 y demostrar que su aplicación mucosal tiene efecto adyuvante sobre los antígenos que componen dicho proteoliposoma y el polisacárido Vi de Salmonella Typhi. De esta forma, se identificaron fosfolípidos y proteínas en un extracto de membrana externa derivado de V. cholerae O1 que, junto al lipopolisacárido, forman vesículas que se denominaron como proteoliposoma de V. cholerae O1 (PLc). El PLc se enfrentó al catión divalente calcio a través de un proceso de diálisis rotacional continua y se obtuvo una nueva microestructura multilaminar y tubular con características semejantes a una estructura coclear que se denominó como Adyuvante Finlay Cocleato 2 (AFCo2).Durante este proceso no se afectó la identidad e inmunogenicidad de los principales antígenos que se identificaron en el PLc. Al contrario, la evaluación de la respuesta inmune en ratones Balb/c que se inmunizaron por vía intranasal (IN), reveló que el AFCo2 fue mas inmunogénico a nivel mucosal que el PLc. Finalmente, se demostró el efecto adyuvante del AFCo2 sobre el polisacárido Vi de S. Typhi cuando se mezclaron y coadministraron por vía IN a ratones Balb/c. En general estos resultados demuestran que el AFCo2 puede ser obtenido a partir del PLc y ser utilizado como un adyuvante de aplicación mucosal

Obtención y caracterización de una nueva estructura coclear con capacidad adyuvante derivada del proteoliposoma de Vibrio cholerae O1

Los adyuvantes son componentes esenciales de las formulaciones vacunales. Sin embargo, pocos han sido licenciados para su uso en humanos y solo la subunidad B de la toxina de cólera ha sido aprobada por vía mucosal. El objetivo de este trabajo es obtener una nueva estructura coclear a partir del proteoliposoma Vibrio cholerae O1 y demostrar que su aplicación mucosal tiene efecto adyuvante sobre los antígenos que componen dicho proteoliposoma y el polisacárido Vi de Salmonella Typhi. De esta forma, se identificaron fosfolípidos y proteínas en un extracto de membrana externa derivado de V. cholerae O1 que, junto al lipopolisacárido, forman vesículas que se denominaron como proteoliposoma de V. cholerae O1 (PLc). El PLc se enfrentó al catión divalente calcio a través de un proceso de diálisis rotacional continua y se obtuvo una nueva microestructura multilaminar y tubular con características semejantes a una estructura coclear que se denominó como Adyuvante Finlay Cocleato 2 (AFCo2).Durante este proceso no se afectó la identidad e inmunogenicidad de los principales antígenos que se identificaron en el PLc. Al contrario, la evaluación de la respuesta inmune en ratones Balb/c que se inmunizaron por vía intranasal (IN), reveló que el AFCo2 fue mas inmunogénico a nivel mucosal que el PLc. Finalmente, se demostró el efecto adyuvante del AFCo2 sobre el polisacárido Vi de S. Typhi cuando se mezclaron y coadministraron por vía IN a ratones Balb/c. En general estos resultados demuestran que el AFCo2 puede ser obtenido a partir del PLc y ser utilizado como un adyuvante de aplicación mucosal

Obtaining and characterization of monoclonal antibodies against capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae serotype 1, 5, 6B, 14 and 19F

Five monoclonal antibodies named 2B5B10, 2E4D11, 1D12E10, 1D1D11 and 177/10/27/11 were produced against capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae serotypes 1, 5, 6B, 14 and 19F respectively. They all were obtained by hybridoma technology and produced by in vivo procedures. Were purified by Protein A-based Affinity Chromatography and the yield of all processes was around the 2.9 and 3.7 mg per mL of ascitic fluid; and with a high purity (over 90% in all cases). All MAbs only reacted against their homologue polysaccharide showing no cross reactivity against other serogroups. The affinity constants (Kaff) measured by non-competitive ELISA were 3.08 x 1011 M-1 for 2B5B10, 1.53 x 1012 M-1 for 2E4D11, 8.68 x 1010 M-1 for 1D12E10, 1.42 x 1013 M-1 for 1D1D11 and 7.2 109 M-1 for 177/10/27/11. The potential application of these MAbs for identity tests was demonstrated by their abilities of no cross-react with the other purified PS presents in QuimiVio, through indirect ELIS

Influencia del medio de cultivo sobre la cinética de crecimiento y expresión de la proteína recombinante Rv2626c de Mycobacterium tuberculosis H37Rv expresada en Streptomyces lividans TK24

Streptomyces lividans, ha ganado gran atención en los últimos tiempos, como vector de expresión y producción de proteínas de Mycobacterium tuberculosis de interés biomédico, como alternativa a su obtención tradicional en E. coli. La proteína Rv2626c, Proteína de Respuesta Hipóxica 1, es codificada por el gen Rv2626c (hrp1) de M. tuberculosis, perteneciente al regulón de la fase de latencia DosR. Esta proteína se sobre-expresa en la fase de latencia de la tuberculosis bajo condiciones de estrés como hipoxia y bajos niveles, de óxido nítrico. Se ha demostrado la inmunogenicidad y capacidad de esta proteína, de inducir citocinas características del patrón Th-1, tales como el interferón gamma. Por ello, nuestro grupo logró la obtención de Rv2626c por la tecnología del ADN recombinante usando como cepa hospedera Streptomyces lividans TK24. Con el objetivo de aumentar el nivel de expresión de la proteína recombinante, rRv2626c en este trabajo se ensayaron diferentes medios de cultivo, evaluando el crecimiento de la cepa transformada en condiciones de zaranda. Se determinó la cinética de crecimiento en el medio definido, formulado industrialmente en el Centro Nacional de Biopreparados: caldo Triptona Soya (TSB-BioCen) y en medio de cultivo equivalente preparado en el laboratorio. Para establecer la cinética de crecimiento, se utilizó el cálculo del peso seco y la determinación de la concentración de proteínas totales por la técnica de ácido bicinconinico (BCA) a diferentes tiempos del cultivo. Posteriormente, se identificó la proteína clonada mediante SDS-PAGE y Western Blotting, así como los niveles de expresión mediante análisis densitométrico. Los resultados indican que se alcanzaron los máximos niveles de densidad celular a las 36 h de cultivo y los más altos niveles de expresión proteica total y específica entre las 42 y 54 h. Con el medio químicamente definido TSB-Biocen preformulado en lugar del preparado en el laboratorio partiendo de los componentes, se logró reducir el tiempo óptimo para la expresión-secreción de la proteína rv2626c de 96 a 54 h. Los mejores resultados en la promoción de la expresión de la proteína recombinante se lograron con el medio definido TSB-BioCen, a las 48 h con 8,5% de rendimiento específico, superando en más de 10 veces los niveles de crecimiento celular obtenidos con el medio elaborado en el laboratorio y más de dos veces los niveles de secreción de la proteína recombinante

Estandarización de un ensayo inmunoenzimático para la cuantificación de anticuerpos IgG contra el antígeno de superficie recombinante del virus de la Hepatitis B inducidos en conejos New Zealand

La infección por el virus de la Hepatitis B está extendida por todo el mundo. Actualmente, miles de personas mueren a causa de este virus, por lo que es una necesidad desarrollar vacunas que protejan contra este patógeno. Existen vacunas basadas en el antígeno recombinante de superficie del virus de la Hepatitis B donde la eficacia protectora de la vacunación contra el virus está directamente relacionada con la inducción de anticuerpos contra el antígeno de superficie. Por tal razón, es muy importante de contar con una técnica sensible, específica y precisa que sea capaz de detectar niveles de anticuerpos en sueros. En este trabajo se representan los resultados del proceso de estandarización de un ELISA indirecto de cuantificación que se desarrolló con sueros de conejos New Zealand inmunizados con la vacuna comercial Heberpenta-L y una vacuna experimental combinada. En los cuales se determinó la concentración óptima de recubrimiento, el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración, generada con un estándar interno, presentó un buen ajuste lineal y un intervalo entre las diluciones 1/200 a 1/12800. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (≤10%, ≤20% respectivamente). El ensayo presentó una especificidad óptima y se determinó el valor de corte que fue de 18,086 UA/mL. Estos resultados avalan el empleo de esta técnica en los laboratorios del Instituto Finlay de vacunas para la evaluación preclínica de nuevos candidatos vacunales combinados que protejan contra la Hepatitis B