Digestive aspartic proteases from sábalo (Prochilodus lineatus): Characterization and application for collagen extraction

Acid proteases from sábalo stomach mucosa were recovered using salting-out procedure. This single step produced an enzyme extract purified 1.8-fold over the crude extract with a recovery of 45.1% of its initial proteolytic activity. Sábalo proteases exhibited the highest activity at 45 °C-pH 2.0, showed pH stability between 2.0 and 5.0 and retained more than 70% of its activity after incubation at pH 7.0 for 2 h. Fish extract was unstable at temperatures greater than 45 °C. Its activity was inhibited by pepstatin A but not by PMSF, while EDTA and SDS showed partial inhibitory effects. Presence of CaCl 2 and MgCl 2 increased the proteolytic activity, while increasing concentrations of NaCl strongly decreased it. In addition, compared to the acid extraction method, the use of sábalo enzymatic extract increased 1.7 times the yield of collagen extraction.Fil: Acevedo Gomez, Antonella Valeria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Gomez, Gabriela Noemi. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Chamorro, Ester Ramona. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Bustillo, Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Leiva, Laura Cristina Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; Argentin

Caracterización fisicoquímica de colágenos obtenidos de piel de Palometa y Surubí

El colágeno es la proteína estructural predominante en animales, componente principaldel tejido conectivo, huesos y piel, entre otros. Actualmente es ampliamente utilizadoen campos biomédicos. Comúnmente se lo obtiene de fuente bovina y porcina, sinembargo los colágenos porcinos son inaceptables para algunas religiones y los deorigen bovino pueden contaminarse con enfermedades priónicas. A partir de estaslimitaciones, ha surgido el interés de obtener esta proteína de recursos alternativos. Eneste trabajo se obtuvo colágeno a partir de piel de Pygocentrus nattereri (n.v.palometa) y de Pseudoplatystoma corrucans (n.v. surubi), especies abundantes en lacuenca acuícola del NEA. El objetivo fue evaluar la temperatura desnaturalizacióntérmica aceptando que su transformación en gelatina está relacionada con la variaciónde la viscosidad. Se completó el estudio con análisis por SDS-PAGE yespectrofotometría UV-visible de ambos colágenos obtenidos.Se lo obtuvo mediante tratamiento con álcali, seguido de extracción ácida (acético(5%, pH 3,6, 24 h) y precipitación salina, finalmente se lo dializó y liofilizó. Ladesnaturalización del colágeno se evaluó en un viscosímetro de Ostwald. Solucionesde colágeno (0,5% P/V en ácido acético 0,5 M) se incubaron a distintas temperaturas(25º a 45º) durante 30 min y luego se midió el tiempo de escurrimiento. Se calculó laviscosidad específica a cada temperatura y con ella la viscosidad fraccional (FT). Apartir de la representación gráfica se estimó la temperatura de desnaturalización (Td,temperatura en la cual la desnaturalización se produce en un 50%, FT = 0,5).El proceso extractivo arrojó un rendimiento de 1,71 g y 1,85 g de colágeno / 100 g depiel de palometa y surubí respectivamente. Los colágenos obtenidos mostraroncomportamiento similar bajo los estudios realizados. Por SDS-PAGE se obtuvo unperfil de bandas compatibles con las que presenta el colágeno tipo I (bandas alfa y beta). Elespectro UV-visible mostró un máximo a 238 nm (palometa) y 239 nm (surubí),diferenciándose en la región 240-290 nm donde las Abspal son mayores que Abssur,indicando composición aminoacidica diferencial entre sendos colágenos. Las Tdpal yTdsur obtenidas fueron de 35 ºC y 34ºC respectivamente, siendo similares a la Td delcolágeno porcino (37°C) y muy cercana a la de colágeno piel de peces de agua dulce,mientras que colágenos de peces marinos tienen Td menores a 30ºC.Los resultados de este trabajo arrojan información preliminar de interés, mostrando supotencial aplicación como biomaterial. Debido a la proximidad en las Td con colágenode mamífero, los colágenos aislados podrían emplearse como una alternativa atractivaal colágeno de mamífero para aplicaciones biomédicas y farmacéuticas.Fil: Medina, Daiana Mailen. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Acevedo Gomez, Antonella Valeria. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Pellegrini, Luciana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario; ArgentinaFil: Leiva, Laura Cristina Ana. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaXXII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química InorgánicaLa PlataArgentinaUniversidad Nacional de la Plata. Facultad de IngenieríaAsociación Argentina de Investigaciones Fisicoquímica

Caracterización de pepsina de sábalo (Prochilodus lineatus): Evaluación de su potencial aplicación industrial

En la actualidad, se fabrican más de 500 productos industriales utilizando enzimas. Se las emplean de forma rutinaria en múltiples áreas: alimentos, piensos, detergentes, curtido, textiles, lavandería, productos farmacéuticos, cosméticos y química. Las proteasas representan uno de los tres grupos más grandes de enzimas utilizadas en la industria y se proyecta que su mercado global alcanzará US$ 2.210 millones en 2021. La pepsina es una proteasa aspártica y la principal enzima digestiva en el estómago de los animales. Se segrega como pepsinógeno (PG) en las células principales de las glándulas oxínticas ubicadas en el epitelio de la pared estomacal. Es utilizada ampliamente en la industria alimenticia como agente coagulante en la fabricación de quesos, elaboración de batidos e hidrolizados proteicos, cereales precocidos y bebidas saborizantes. También, se la aplica en las curtiembres para eliminar el vello y tejido residual del cuero, en la recuperación de plata de películas fotográficas, para la hidrólisis de IgG (obtención de fragmentos F(ab´)2) y como agente terapéutico en la regulación de la digestión, entre otros usos. Las pepsinas comercializadas y utilizadas en la industria son de origen porcino, vacuno y microbiano, sin embargo, las enzimas aisladas de las vísceras de peces se pueden utilizar para un gran número de aplicaciones en tecnológicas, aprovechando su comportamiento diferencial respecto a las fuentes mencionadas. En 2016 el consumo global de pescado ascendió a los 151 millones de toneladas. La producción mundial pesquera está conformada por los productos de captura (57%) y la acuicultura (47%). En Argentina la producción acuícola destinada al consumo humano ha mostrado un crecimiento lento, aunque sostenido, durante los últimos 20 años. Actualmente, el Nordeste Argentino cuenta con especies nativas cultivadas en menor o mayor alcance de producción, como el pacú, bagre, sábalo y el dorado. El sábalo (Prochilodus lineatus) representa el 50-90% de la biomasa total de peces en la cuenca del río Paraná (1000 kg/ha), constituye el 75-85% de las capturas de las pesquerías artesanales y en 2016 su exportación alcanzó las 7.190,86 toneladas. Dependiendo del tratamiento industrial que reciba, entre el 20 al 60% del peso del pescado capturado y comercializado se transforma en residuo. Entre las partes desechadas se encuentran las vísceras, la piel, escamas, huesos. Una estrategia interesante para la reducción de estos residuos es utilizarlos como fuente de subproductos comercializables. La mayoría de los subproductos derivados de la pesca y su industrialización se utilizan en la producción de aceite de pescado y harina de pescado. Sin embargo, estos podrían utilizarse para generar productos de mayor valor agregado. Estudios recientes han identificado una serie de compuestos de interés comercial presentes en los residuos y subproductos de las pescaderías. Los minerales, lípidos, aminoácidos, polisacáridos, proteínas y enzimas de animales acuáticos tienen características únicas y, sorprendentemente, su mayor concentración se encuentra a menudo en partes de los organismos que comúnmente se descartan. Por esta razón, el objetivo del presente trabajo de tesis fue valorizar la pesca y la piscicultura del sábalo en la región a través de la recuperación de proteasas digestivas, de alta aplicabilidad industrial, a partir de vísceras de desecho.En este trabajo de tesis se obtuvo con éxito un extracto crudo (EC) de mucosa gástrica de sábalo (Prochilodus lineatus) en medio ácido, con actividad proteolítica sobre solución ácida de hemoglobina como sustrato. El extracto crudo (EC) se sometió a un proceso de baja complejidad como es la precipitación salina, rindiendo un extracto enzimático (EE) con una actividad específica que duplica en valor la del EC. Se caracterizaron bioquímicamente los extractos (EC y EE) y se evaluó la actividad catalítica de los mismos sobre diferentes sustratos, atendiendo la posibilidad de un potencial uso industrial, comparándolos con pepsina porcina (PP).Al estudiar el efecto del pH sobre la actividad proteolítica se observó que los extractos EC y EE de sábalo presentaron máxima actividad catalítica a pH 2, lo cual concuerda con lo reportado para extractos gástricos con actividad pepsina de otros peces. Si bien los valores óptimos de pH para EC y EE coincidieron con los de la pepsina porcina (PP) comercial, se observó una diferencia significativa en la actividad proteolítica a valores de pH próximos al óptimo. Los extractos de sábalo mantuvieron una máxima actividad enzimática en un rango de pH de 2 a 4, conservando más del 80% de la actividad proteolítica máxima, mientras que la pepsina porcina exhibió su mayor actividad entre los pHs 1 y 2 para luego disminuir a valores por debajo del 40%. Esta particularidad también se ha reportado en pepsinas provenientes de peces de otras especies. Este comportamiento diferencial resulta relevante al momento de la utilización de estas enzimas en procesos industriales que requieren de pepsinas activas a pH no tan ácidos, como es la obtención de colágeno, que se efectúa a un pH próximo a 3.Se evaluó de la influencia de la temperatura sobre la actividad y se observó que la temperatura óptima de los extractos, la cual fue de 45°C. Este resultado está en concordancia con los óptimos determinados para los extractos de lenguado y rodaballo. El rango óptimo de temperatura para las pepsinas de peces se encuentra entre los 30 y 55ºC, las enzimas de cada organismo tienen características térmicas únicas, con la particularidad de que los que habitan en aguas frías poseen temperaturas óptimas menores que aquellos que habitan en aguas cálidas. Este comportamiento diferencial frente a la temperatura es lo que promueve el atractivo industrial de las enzimas de organismos acuáticos, convirtiéndolas en deseables para procesos que requieran bajas temperaturas, especialmente en la industria alimenticia. Las desventajas del uso de enzimas termoestables en procesos alimenticios a altas temperaturas incluyen un alto costo de energía, destrucción de sabores y nutrientes lábiles al calor, alteración en la integridad física del producto y un aumento relativo en reacciones secundarias indeseables.En este trabajo de tesis se determinó el efecto de elevadas concentraciones de NaCl sobre la actividad proteolítica para establecer la factibilidad de emplearlas como aditivos para acelerar la fermentación en productos con alto contenido de sales (e.g. salsa de pescado). Al evaluar la actividad de los extractos gástricos de sábalo y la pepsina porcina en un rango 0-30% NaCl, se observó que la actividad de las muestras decrecía de modo inversamente proporcional al aumento de la concentración de la sal, llegando a un mínimo de 9% y 15% de la actividad inicial, respectivamente. La disminución de la actividad podría deberse a la desnaturalización de las enzimas causada por el efecto de "salting out" provocado por el aumento de la concentración de NaCl. Los resultados obtenidos en esta tesis descartan la posibilidad de utilizar los extractos gástricos de sábalo como aditivos en procesos que involucren elevados contenidos de sal. Se estudió la influencia de iones divalentes en la actividad proteolítica de EC, EE y PP. Pues, la presencia de iones metálicos en el sitio activo puede ser crucial para la actividad de una enzima, aunque, en el caso de la pepsina esta dependencia no ha sido demostrada. La relación entre la activación de cationes metálicos sobre pepsinas provenientes de peces ha sido estudiada principalmente para los cationes Ca+2, Cu+2, Mg+2 y Co+2 con resultados dispares dependiendo de la especie de la cual provenga la enzima, éstos pueden estimular levemente la actividad o intensificarla La presencia de los cationes divalentes Ca+2 y Mg+2 (1 y 5 mM) tuvieron un leve sobre la actividad de los extractos de sábalo y la pepsina porcina, logrando incrementar aproximadamente el 10% la actividad proteolítica. Así, se constató un símil comportamiento entre las pepsinas de peces y la porcina en presencia de iones metálicos. Se observa la activación, aunque leve, de la actividad enzimática en presencia cationes, la cual incrementa conforme lo hace la concentración de los mismos en el medio de reacción.El uso de inhibidores específicos sobre extractos enzimáticos obtenidos de tejidos proporciona datos valiosos sobre la naturaleza da las enzimas se encuentran actuando en los mismo. En este trabajo se evaluaron los efectos de la Pepstatina A, el EDTA y el PMSF. La pepstatina A, un pentapéptido aislado del cultivo de Streptomyces spp, es un inhibidor específico de proteasas aspárticas que inhibe la actividad de la pepsina, la catepsina D y la renina. Al incubar 10µM pepstatina A con las muestras, se observó la inhibición del 96, 97 y 100% de la actividad enzimática de EC, EE y PP, respectivamente. Este comportamiento coincide con lo observado para otras pepsinas y proteasas de peces, las cuales en presencia de pepstatina A disminuyen su actividad proteolítica en proporciones iguales o mayores al 97% (respecto a la actividad control).El EDTA (agente quelante de iones metálicos) y el PMSF (nhibidor de serino proteasas) no tienen efectos inhibitorios en la actividad proteolítica de las pepsinas aisladas de peces. Al estudiar el efecto de estos inhibidores sobre los extractos enzimáticos de sábalo se encontró que el PMSF (1mM) no afectó la actividad proteolítica, en cambio el EDTA (2mM) disminuyó la actividad de los EC y EE en el orden de 24 y 22%, respectivamente.Teniendo en cuenta los resultados hasta aquí analizados, es posible que las proteasas activas de los extractos de sábalo sean del tipo ?pepsin-like?, ya que son efectivamente inhibidas por la pepstatina, y que la actividad de estas sea incrementada por la presencia de cationes divalentes, como lo indican los datos de actividad enzimática obtenidos en presencia de Ca+2, Mg+2 y EDTA.En este trabajo también se determinó la influencia del SDS (dodecilsulfato de sodio, un detergente iónico ampliamente utilizado en la industria y los laboratorios) en la actividad enzimática de los extractos y la pepsina porcina. Se ensayó el efecto del SDS a 0.05-0.10% (P/V) y se observó un efecto inhibitorio parcial sobre los extractos de sábalo y la pepsina porcina. La actividad del extracto crudo y el enzimático disminuyeron hasta el 60,3 y el 56,4 % después de incubarse con 0,1% de SDS. La reducción de la actividad en presencia de SDS ha sido descripta para varias enzimas y se lo atribuye a la alteración de sus estructuras como consecuencia de la interacción con el SDS. El pH y la temperatura son dos factores físicos que pueden alterar la estabilidad de una enzima, por ello sus efectos sobre EC y EE se estudiaron en este trabajo de tesis.Luego de incubar los extractos de sábalo a diferentes pH (2h), éstos presentaron una actividad residual ≥90% de su máximo pHs comprendidos entre 1 -5, y demostraron ser moderadamente estables en condiciones neutras y levemente alcalinas. Al ser pre-incubados a pH 7 y 8 los extractos retuvieron más del 70% y 25% de su actividad inicial, mientras que la pepsina porcina resultó inactivada a pH mayores a 7. Este comportamiento se condice con lo esperado pues el sábalo es un pez de aguas cálidas. Las diferencias entre la estabilidad de los extractos y la pepsina porcina a pH neutros y levemente alcalinos puede ser una ventaja para aquellos procesos que requieran llevarse a cabo a pH no-extremadamente ácidosLas pepsinas provenientes de organismos acuáticos se caracterizan por ser estables a temperaturas por debajo de los 40-55°C, mientras que la pepsina porcina es estable hasta los 60°C. Algunos autores sostienen que las diferencias se encuentran en el número potencial de enlaces disulfuro, la hidrofobicidad promedio y la cantidad de enlaces de hidrógeno intramoleculares afectan la termoestabilidad de las enzimas de diferentes especies. En concordancia, se observó que los extractos de sábalo fueron estables hasta los 37°C, mientras que la pepsina porcina lo fue hasta los 60°C. Esta diferencia de estabilidades a temperaturas moderadas (37-60°C) representan una ventaja energética en los procesos para inactivar las enzimas sin comprometer la integridad de los productos y disminuyendo los costos de servicios auxiliares. Al estudiar la estabilidad de los extractos de sábalo y la pepsina porcina durante 8h, se pudo observar que todas las muestras conservaron su máxima actividad catalítica a las temperaturas de 4 y 37°C. Sin embargo, a 60ºC la estabilidad térmica de la pepsina porcina fue notoriamente mayor a la observada para los extractos de sábalo, después de las 2h de incubación los extractos perdieron más del 85% de su actividad proteolítica.Esto refuerza la perspectiva señalada en el punto anterior, posicionando estos extractos como una alternativa para efectuar procesos de hidrólisis a temperaturas moderadas y con posibilidad de detenerlos con shocks térmicos a temperaturas relativamente bajas, entre 60 y 70°C. En los procesos industriales gran parte de las operaciones de calefacción se efectúan utilizando vapor. Los datos provenientes de la industria indican que el promedio del uso de energía proveniente del vapor industrial podría llegar a alcanzar entre el 35 y el 40 % de uso energético de las instalaciones. Por lo tanto, es muy importante optimizar procesos que minimicen las operaciones de calefacción, minimizando los costos operativos y de producción.Para evaluar la actividad catalítica del EC y EE sobre diferentes sustratos, atendiendo la posibilidad de un potencial uso industrial, se ensayaron: recuperación de placas radiográficas, actividad coagulante de la leche, hidrólisis de colágeno, hidrólisis de inmunoglobulinas y obtención de colágeno de la piel de sábalo.Las placas radiográficas son hojas de poliéster recubiertas por una matriz de gelatina impregnada con haluro de plata y que contiene una concentración de Ag en el rango del 14-17%. En consecuencia, es posible llevar a cabo procesos de recuperación de plata metálica basados en métodos enzimáticos utilizando proteasas que degraden la matriz que contiene la plata metálica, permitiendo también la recuperación de la placa de poliéster. Hasta el momento, en la bibliografía publicada, las proteasas utilizadas son del tipo alcalinas y obtenidas principalmente de bacterias y hongos y se ha encontrado sólo una publicación que emplea extractos alcalinos provenientes de las vísceras de pez Labeo rohita. En este trabajo, al emplear proteasas ácidas con actividad pepsina, del sábalo y pepsina porcina comercial se encontró que el extracto enzimático logró hidrolizar completamente la capa que cubre la placa radiográfica, la cual contiene gelatina, luego de 46h a 40°C. Sin embargo, tanto la pepsina porcina como el extracto crudo ácido no lograron la degradación total del recubrimiento de gelatina en las condiciones evaluadas. Los tratamientos con proteasas alcalinas de bacterias y hongos han logrado recuperar la plata con tratamientos de tiempos más cortos a temperaturas levemente superiores e iguales. Esto demuestra que las proteasas alcalinas son más eficientes que las proteasas ácidas para efectuar la hidrólisis de la gelatina, sin embargo, es factible el emplear el extracto enzimático de sábalo para la recuperación de la placa de polietileno y la plata presentes en las de placas fotográficas. La nobleza que presenta esta alternativa es la baja tecnificación del proceso, ser amigable con el medio ambiente pues no genera residuos tan contaminantes como los procesos tradicionales de recuperación y que es una metodología de recuperación basado en utilizar proteasas obtenidas de residuos.En la producción de queso la coagulación de la leche se puede inducir por acción enzimática, además del cuajo de ternero (extracto 1:9 de pepsina: quimosina), se pueden utilizar enzimas de fuentes animales, vegetales, microbianas o de microorganismos genéticamente modificados. Para que una enzima sea susceptible a ser utilizada en la elaboración de quesos no sólo debe ser capaz de inducir la coagulación (hidrolizando el enlace Phe105-Met106 de la k-caseína), sino que también debe provocar una baja proteólisis inespecífica, para evitar la reducción del rendimiento y la aparición de defectos en sabor y textura del producto final. Si bien la pepsina porcina presenta actividad coagulante de leche y su actividad proteolítica inespecífica hidroliza los enlaces con los residuos de Phe, Tyr, Leu o Val, favoreciendo la formación de péptidos indeseables, las pepsinas aisladas de peces han sido investigada extensamente como una posible enzima para la producción de quesos. Al evaluar la capacidad coagulante de los extractos de sábalo (EC y EE) y la pepsina porcina se observó que los mismo poseían una fuerza del cuajo (RS) 6,7 ± 0,13; 8,0 ± 0,02 y 625,1 ± 9,8, respectivamente. En base a estos resultados, los extractos de sábalo no serían agentes coagulantes aptos para la producción de quesos, dado su baja eficiencia para la coagulación de la leche. Los hidrolizados de colágeno son de naturaleza bioactiva, exhiben numerosas propiedades y características atractivas para su uso en la industria farmacéutica, alimentaria y cosmética, En general la pepsina presenta una menor capacidad de hidrólisis del colágeno frente a otras proteasas, por lo que no resulta eficiente para generar péptidos bioactivos, sin embargo, los hidrolizados que se obtiene con ella poseen capacidades emulsionantes y gelificantes. Puntualmente, pepsinas de peces no han sido ensayadas previamente sobre esta propiedad. En este trabajo de tesis se realizó un ensayo similar, comprobándose la capacidad por parte del EC y EE de sábalo de degradar las cadenas del colágeno tipo I de ratón. Estos resultados abren un nuevo panorama de posibles usos para las pepsinas de peces en la producción de hidrolizados de colágeno.La pepsina es la única enzima capaz de escindir completamente la IgG para dar F(ab?)2 y, por lo tanto, la mayoría de los productos terapéuticos basados en anticuerpos consisten en estos fragmentos preparados por digestión con pepsina porcina. No se han encontrado en la bibliografía trabajos referentes al uso de proteasas de peces para la obtención de fragmentos F(ab?)2 a partir de IgG purificada o suero de alguna especie. En el presente trabajo de tesis, se constató que la acción de los extractos de sábalo sobre un pool de IgG de suero equino produjo una degradación parcial de las inmunoglobulinas, aun exponiendo la reacción durante un lapso de 48 h. Se refleja una cinética de hidrólisis lenta comparada con la acción de otras pepsinas. Esto puede atribuirse a la mayor actividad y concentración de las enzimas utilizadas, el pH final de la mezcla de reacción (∿3,5-4), también podría deberse a la poca afinidad del extracto de sábalo por este sustrato de origen equino. En este sentido los resultados obtenidos permiten explorar nuevas experiencias para verificar si el extracto pepsinico de sábalo tiene mayor actividad sobre IgG provenientes de otras especies, para la producción de fragmentos F(ab?)2.En los últimos 15 años se han publicado varios artículos referentes a la extracción y el estudio del colágeno obtenido de peces, no sólo empleando como material de partida la piel, sino también las escamas y las vejigas natatorias. Tradicionalmente, el colágeno se extrae utilizando una solución ácida (principalmente ácido acético 0,5M) sin adición de enzimas. Sin embargo, se ha observado que el colágeno presente en subproductos de peces (piel, cartílagos, etc) no se disuelve en solución de ácido acético. Por ello se desarrolló un proceso de extracción enzimática para maximizar su rendimiento y a tal fin se han empleado diversas enzimas (tripsina, pepsina y colagenasa). En este trabajo de tesis se evaluó la piel de sábalo como fuente de colágeno en simultáneo con el estudio de la capacidad de sus extractos enzimáticos para solubilizarlo durante la extracción. El análisis de la composición de la piel reveló que la misma presenta el 52,5% de humedad; 5,5% de ceniza, 12,82% de proteína y 28,12% de grasa (en base húmeda) y 3,5mg de hidroxiprolina por gramo de piel. A partir del contenido de hidroxiprolina, se estimó el contenido de colágeno. Este aminoácido es un producto postraduccional de la hidroxilación de la prolina. Debido a su distribución restringida y única en el colágeno de tejido conectivo, se puede estimar el contenido de colágeno midiendo el contenido de Hyp, considerándose que el 12.5% del colágeno es Hyp. Conforme a los resultados obtenidos, 100 gramos de piel de sábalo contienen ~ 350 mg de Hyp, por ende, 2,8 g de colágeno. Esta proteína con función estructural representa el 21,8 % de las proteínas totales de la piel de sábalo.La obtención del colágeno de la piel de sábalo se efectuó a partir de las siguientes extracciones: ácida -como control- (ASC), ácida con agregado de pepsina porcina (PSC)y ácida con agregado de extracto crudo (ECSC) y extracto enzimático (EESC). La adición de extracto crudo (ECSC) y extracto enzimático (EESC) de sábalo incrementó la extracción de colágeno sólo con ácido, 1,2 y 1,7 veces, respectivamente. La enzima, también ejerció el mismo efecto, comparable en magnitud al ejercido por EC. Resultados similares fueron publicados por otros autores al adicionar pepsina porcina y EC de peces con actividad pepsina al proceso de obtención de colágeno de piel de peces, evidenciando que su acción enzimática incrementa la extracción.La piel y los huesos de los peces contienen colágeno tipo I como colágeno principal. El colágeno tipo I de la piel de peces puede presentar, también, componentes de alto peso molecular, como las cadenas β (dímeros de la cadena α) y γ. La movilidad electroforética de las muestras del colágeno del extraído de

Recovery of acid proteases from fishery discards with aqueous micellar two-phase systems and their use for X-ray film recycling

The continuous expansion of fish production results in increasing amounts of discards, i.e. viscera, skin and frame, whose inappropriate disposal causes environmental damage. Conversion of this waste into value-added products is one of the best alternatives to reduce the pollution problem. The feasibility of using aqueous micellar two-phase systems (AMTPS), formed by biodegradable Genapol X-080 (GX-080) and sodium citrate, to recover valued acid proteases from surubí (Pseudoplatystoma sp) fishery discards was evaluated for the first time. The effects of biomass load, pH and surfactant concentration on the extraction were analyzed using a two-level full factorial design. GX-080 concentration and biomass load were the most significant factors (p < 0.05). AMTPS formed by GX-080 4% w/w showed a successful performance for the recovering of 69% of AP from the crude extract in the surfactant-rich phase with a purification factor of 1.83. Regard to the storage stability, this extract conserved at least 89% of its proteolytic activity for 76 days at 0 °C. It also showed a notable hydrolyzing activity of the gelatin-silver coating of used X-ray films, thus opening new perspectives on the use of acid proteases for recycling purposes.Fil: Acevedo Gomez, Antonella Valeria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Bustillo, Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Nerli, Bibiana Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario; Argentin

Pacu viscera extract obtained by aqueous two-phase system: potential application in recycling waste

Pacú (Piaractus mesopotamicus) production represents 40% of northeast fish yield. It is of interest to valorize the current disposal of fish processing through the use of viscera waste, source of enzymes such as trypsin. Aqueous two-phase systems (ATPS) have been successfully used for separation and purification of macromolecules because exhibit multiple advantages: good resolution, high yield, low cost and proteins retain their biological activity. The goal of this work was to analyze the partition of pacú pyloric caeca extract in aqueous two-phase PEG-citrate systems. Preparation of crude alkaline extract was made by mechanical and sonic digestion of pyloric caeca. A two-phase system formed by polyethyleneglycol (PEG) 3350 - citrate, pH 8.4, was used and the partition of alkaline proteins of the extract was assayed. Trypsin activity was determined with the substrate a-Nbenzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) and protein content was estimated by the Warburg and Christian method. Partition coefficients (Kp) were calculated by the ratio of enzyme trypsin activity or total protein between phases. The experiments revealed that partition coefficient of trypsin was greater than unity (KpTrip: 2,2), while partition coefficient of total proteins was smaller than one (KpTP: 0,33). This result indicates a tendency for trypsin-like enzymes to concentrate in the top phase (PEG-enriched phase), while proteins were partitioned to the salt-enriched phase (bottom phase). Thus, a high separating capability was verified in the assayed system. On the other hand, X ray plates were treated with the top phase achieving a complete removed of the gelatine layer which covers it, with no interference of PEG. These studies demonstrate the applicability of a simple procedure to obtain a phase enriched with enzymes from pacú viscera extracts and their use in recycling of radiographic plates.Fil: Gomez, Gabriela Noemi. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste; ArgentinaFil: Acevedo Gomez, Antonella Valeria. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Modelado e Innovación Tecnológica; ArgentinaFil: Nerli, Bibiana Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario; ArgentinaFil: Leiva, Laura Cristina Ana. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; ArgentinaXX Annual Meeting of the Argentinean Biology Society (SAB) . VII Meeting of the Uruguayan Society of Biosciences (SUB). Second Biology Meeting Of The River PlateBuenos AiresArgentinaSociedad Argentina de BiologíaSociedad Uruguaya de Biociencia

Cribado de los factores que afectan la recuperación de pepsina de surubí utilizando sistemas micelares de dos fases acuosas

Los desechos (vísceras) del procesamiento de pescado pueden emplearse para producir subproductos comercialmente valiosos tales como proteasas e hidrolasas con múltiples aplicaciones en las industrias alimenticias, manufactureras y farmacéuticas. Dentro de ellas, la pepsina es la principal enzima digestiva en el estómago de los animales, se sintetiza y secreta en el epitelio de la pared estomacal bajo su forma inactiva llamada pepsinógeno (PG)[1]. Aplicaciones como la extracción de colágeno emplean enzimas con un bajo grado de purificación y paraobtenerlas podrían utilizarse métodos de recuperación primaria. Las operaciones unitarias más utilizadas en bioprocesos para este fin son la precipitación salina y las extracciones con solventes orgánicos que resultan inconvenientes debido al impacto ambiental que ocasionan, siendo deseable reemplazarlos por métodos de recuperación amigables, sencillos, económicos y sustentables[2]. Los sistemas micelares de dos fases acuosas (SMDFAs) pueden emplearse como herramientas extractivas en reemplazo de solventes orgánicos permitiendo la preservación de biomoléculas lábiles, especialmente manteniendo la estructura tridimensional de las proteínas,evitando su desnaturalización y consecuente inactivación. La extracción líquido-líquido con SMDFAs constituye una estrategia atractiva que integra la clarificación, concentración y purificación de la molécula blanco en una sola operación[3]. El objetivo de este trabajo fue evaluar los factores que influyen significativamente en la recuperación del pepsinógeno de un extracto gástrico de surubí (Pseudoplatistoma corruscans), mediante el uso de sistemas bifásicos micelares acuosos como metodología potencial para su recuperación primaria. Las vísceras de ejemplares de surubífueron suministradas por miembros del SIVEP (Servicio de Inspección Veterinaria de Pescado) de la provincia de Corrientes y almacenadas a -20°C hasta su utilización. El extracto crudo (EE) rico en pepsinógeno se preparó por disgregación mecánica del estómago de surubí empleando buffer fosfato 50mM pH 7 (1:5 g/mL), se centrifugó, se sometió a una precipitación -60% (NH4)2SO4-, el precipitado se redisolvió, dializó, liofilizó y se conservó a -20°C hasta su utilización. Con un diseño factorial completo 2k se evaluaron los factores que influyen en la recuperación del PG usando SMDFAs constituidos por el surfactante no iónico Genapol 080 (GX-080) y buffer citrato de sodio 50mM trabajando una temperatura de separación de fases de 32°C. Se estudiaron las variables: masa de EE, pH y concentración de GX-080. Las respuestas evaluadas fueron el Rendimiento(RA/M%) y factor de purificación (PFA/M), en las fases de equilibro pobre (A) y rica en micelas (M) de los sistemas estudiados.. Se utilizó el software Design Expert® para diseñar el experimento y analizar sus resultados. En la tabla 1 se presenta la matriz del diseño con las condiciones de cada experimento y las respuestas obtenidas, hallándose resaltadas aquellas que permitieron los mayores indicadores de recuperación de la enzima (RM, %). El ANOVA para el modelo factorial seleccionado arrojó un valor F de 42,68 lo que indica que el mismo es significativo y el R2 predicho (0,8788) es coherente con el R2 ajustado (0, 9470).Para este modelo resultaron significativos (p<0,05): GX-080(%), EE(mg) y la interacción entre estos factores, no así el pH. El contenido de GX-080 tiene un efecto positivo sobre RM , mientras que las de EE y la interacción influyen negativamente. El PG se recupera preferentemente en la fase rica en micelas y para mejorar la extracción se debería aumentar la concentración de GX-080 y/o sembrar menor cantidad de EE en el sistema. Esta metodología resulta prometedora como método de recuperación primaria del PG de surubí.Fil: Acevedo Gomez, Antonella Valeria. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Leiva, Laura Cristina Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Bustillo, Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; Argentina. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; ArgentinaFil: Nerli, Bibiana Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario; ArgentinaXI Congreso Argentino de Química AnalíticaCorrientesArgentinaAsociación Argentina de Químicos AnalíticosUniversidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensur

Aqueous micellar two phase systems as novel tools to recover pepsin like surubí proteases: effect of surfactants on enzyme activity

Surubí is farmed in the northeast of Argentina. It is of interest to valorize the current disposal of fish processing through the use of viscera waste, source of enzymes such as Pepsin. These enzymes have been recovered mainly using conventional methods (e.g.salting out, chromatography), however the use of liquid-liquid extraction using surfactants have not been fully explored. Aqueous micellar two-phase systems (AMTPS) are an extractive method based on the ability of some surfactants to form two immiscible aqueous phases, a rich and a poor micelle phases to recover the product of interest. Thus, the objective of this work was to firstly evaluate the stability of surubí crude extracts under different concentrations of Genapol (GX080) and Tergitol (Tg7) to estimate the feasibility of their use as potential micellar extractants of surubí pepsin. Enzymatic extracts (ERPi) were recovered from stomachs homogenates using salting-out procedure and pepsin activity was estimated by acid hemoglobin method. ERPi were first incubated with various concentrations of surfactants (1, 3 and 5% GX080/Tg7) in 100mM NaCit pH 5 for different times (0, 1, 2 and 3h) and then enzymatic activity was measured. Data represent the mean ± standard deviation (SD) of at least three replications. Statistical significance was tested by one-way ANOVA and Tukey (HSD) (p<0.05) Results showed that any surfactant concentration tested affected ERPi enzymatic activity moderately and this effect was dose dependent. ERPi retained 92, 65 and 60% of its initial activity when were incubated with 1, 3 and 5% of Tg7. After incubating with GX080 (1, 3 and 5%), the ERPi exhibited 80, 70 and 60% of its initial activity, respectively. The time variable in these assays had not significant influence on enzymatic activity decrease. Pepsin, a hydrophilic protein, is expected to be preferentially distributed into the aqueous phase of AMTPS.Considering that the surfactant concentration at this phase is always below 1%, the obtained results suggest that AMTPS formed with either GX080 or Tg7 could be viable tools in the primary recovery of pepsin-like proteases from fishing waste.Fil: Acevedo Gomez, Antonella Valeria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Escobar, Guilermo. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; ArgentinaFil: Gomez, Gabriela Noemi. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Leiva, Laura Cristina Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Bustillo, Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Nerli, Bibiana Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario; ArgentinaReunión Anual de Sociedades de BiocienciaMar del PlataArgentinaSociedad Argentina de Farmacologia ExperimentalSociedad Argentina de Investigación ClínicaSociedad Argentina de BiologíaSociedad Argentina de ProtozoologíaAsociación Argentina de NanomedicinasAsociación Argentina de Ciencia y Tecnología de Animales de Laboratori

Potential use of fish collagen matrix to evaluate tubulogenesis in vitro

Formation or sprouting of new blood vessels (angiogenesis) is a complex process that involves the extracellular matrix (ECM) and endothelial cells (EC). A common in vitro angiogenesis assay consists of culturing EC on or inside distinct ECM components such as collagen. Recently, collagen from aquatic sources has gained attention in tissue engineering applications. Thus, in this work the potential of fish collagen from Pygocentrus nattereri (CP) to induce tubular structures in tEnd.1 (RRID: CVCL_6272) cell line was evaluated. Firstly, collagen from discarded fish skin was extracted by acid solubilization, concentrated by salt precipitation, dialyzed against 100 mM acid acetic and preserve at 8°C. The hydroxyproline analysis revealed a collagen concentration of 6,9 mg/mL (73,8 % of total protein content) and the electrophoretic pattern (SDS-PAGE under non-reducing conditions) showed that extracted CP was type I. To evaluate CP use in angiogenesis assay, 100 ⎧L of a 0.5 mg/mL solution (culture medium-pH 7) was added to each well of 96-well plate and incubated for 30 min at 37°C. Endothelial cells (30.000 cells/well DMEM-5%FBS) were seeded on collagen-coated wells and incubated for 24h at 37°C-5%-CO2. Controls were performed using untreated wells. Tube formation was monitored by an inverted phase contrast microscope and images were taken with a digital camera. Using ImageJ software, number of capillary structures was analysed. EC cultured in collagen matrixes organized rapidly into an irregular network, which was formed by many tubular structures radiating out from cell aggregates. These results suggest the potential use of fish collagen in cell culture.Fil: Medina, Daiana Mailen. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Acevedo Gomez, Antonella Valeria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; Argentina. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; ArgentinaFil: Leiva, Laura Cristina Ana. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; ArgentinaFil: Pellegrini Malpiedi, Luciana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario; ArgentinaFil: Bustillo, Soledad. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Departamento de Bioquímica. Laboratorio de Investigación en Proteínas; ArgentinaIX Simposio Latinoamericano de Tecnología de Cultivos CelularesSanta FeArgentinaUniversidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Centro Biotecnológico del Litora

Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition)

In 2008, we published the first set of guidelines for standardizing research in autophagy. Since then, this topic has received increasing attention, and many scientists have entered the field. Our knowledge base and relevant new technologies have also been expanding. Thus, it is important to formulate on a regular basis updated guidelines for monitoring autophagy in different organisms. Despite numerous reviews, there continues to be confusion regarding acceptable methods to evaluate autophagy, especially in multicellular eukaryotes. Here, we present a set of guidelines for investigators to select and interpret methods to examine autophagy and related processes, and for reviewers to provide realistic and reasonable critiques of reports that are focused on these processes. These guidelines are not meant to be a dogmatic set of rules, because the appropriateness of any assay largely depends on the question being asked and the system being used. Moreover, no individual assay is perfect for every situation, calling for the use of multiple techniques to properly monitor autophagy in each experimental setting. Finally, several core components of the autophagy machinery have been implicated in distinct autophagic processes (canonical and noncanonical autophagy), implying that genetic approaches to block autophagy should rely on targeting two or more autophagy-related genes that ideally participate in distinct steps of the pathway. Along similar lines, because multiple proteins involved in autophagy also regulate other cellular pathways including apoptosis, not all of them can be used as a specific marker for bona fide autophagic responses. Here, we critically discuss current methods of assessing autophagy and the information they can, or cannot, provide. Our ultimate goal is to encourage intellectual and technical innovation in the field