Comparison of microbial populations in anaerobic digesters treating wastewater sludge (molecular analysis of the diversity and activity)

La digestion anaérobie est un processus naturel de dégradation de la matière organique réalisé par l'action concertée de plusieurs populations microbiennes. Grâce au développement des techniques moléculaires, la connaissance de la diversité de ce monde microbien longtemps ignoré a connue une avancée significative ces dernières années. Dans cette étude, nous avons procédé à une étude moléculaire de la diversité procaryote à 30 autres digesteurs ayant des caractéristiques de fonctionnement variées. Cette première phase nous a permis d'identifier les phyla les plus couramment rencontrés. Nous avons pu mesurer l'étendue de la diversité de cet écosystème complexe et distinguer les phyla les plus diversifiés. Différents types de structures ont été observés : certains phyla sont constitués de phylotypes très fréquemment rencontrés alors que d'autres sont constitués essentiellement de phylotypes endémiques. Suite à cette première phase, nous avons sélectionné 7 digesteurs pour procéder à une exploration plus poussée de la diversité en séquençant un nombre important de clones pour les domaines Archaea et Bacteria. Nous avons ensuite utilisé une palette d'outils statistiques afin de comparer les populations rencontrées et de déterminer quel était leur degré de ressemblance/différence. Pour le domaine Archaea, 7 OTUs majeures ont été identifiées et sont en équilibre. Selon la disponibilité des substrats, certaines peuvent prendre le dessus. Les OTUs dominantes sont affiliées aux Methanosarcinales, Arc I et Methanomicrobiales. La lignée Arc I est particulièrement abondante dans certains digesteurs et est probablement en compétition avec le genre Methanosaeta. Cela implique que Arc I pourrait être un consommateur d'acétate et un acteur majeur de la méthanogenèse acétoclaste. Des expériences de mises en culture permettront d'approfondir nos connaissances sur le métabolisme de cette lignée qui sont limitées à l'heure actuelle. Par ailleurs, l'analyse statistique a révélé que les communautés bactériennes peuvent être décrites comme des modèles à 3 composantes : un tiers de phylotypes appartenant à un groupe noyau, un tiers de phylotypes partagés entre quelques digesteurs et un tiers de phylotypes endémiques. Le groupe noyau est composé de 6 OTUs affiliées aux Chloroflexi, Betaproteobacteria, Bacteroidetes et Synergistes. Parmi ces OTUs, 2 sont couramment retrouvées dans d'autres environnements alors que les 4 autres semblent être typiques d'environnements anaérobies. Ces populations couramment rencontrées dans les digesteurs anaérobies pourraient constitués des acteurs majeurs du procédé de dégradation de la matière organique. Grâce à la large base de données de séquences du gène de l'ARNr 16S, des sondes spécifiques ont été mises au point afin de cibler les groupes majoritaires et de quantifier leur activité au sein des réacteurs. Cette analyse quantitative a mis en évidence les groupes les plus actifs et notamment l'importance de la division candidate WWE1. Ces expériences d'hybridation ont également permis de mettre en évidence une diversité encore non ciblée par les différentes sondes existantes ainsi que les limites de l'utilisation des amorces 0008F et 1390R pour la réalisation des banques de clones. La comparaison des approches qualitative et quantitative a montré que certains groupes semblent être sur-représentés dans les banques de clones par rapport à leur réelle activité. Nous avons donc suivi une approche complète basée sur l'étude de l'ARNr 16S en partant d'un inventaire moléculaire jusqu'à la quantification à l'aide de sondes spécifiques. Cette comparaison des populations rencontrées dans les digesteurs anaérobies est un premier pas vers une meilleure compréhension du procédé. A terme, la clarification des relations existant entre biodiversité, conditions d'exploitation et performances devrait permettre d'atteindre une meilleure maîtrise du procédé de digestion anaérobie.Anaerobic digestion is a natural process of degradation of organic matter realised by a microbial consortium. With the development of molecular techniques, our knowledge of the diversity of this microbial ecosystem has been extended in the last years. In this study, the molecular study of prokaryotic diversity was performed on 30 digesters with various operating conditions. In this first phase, the most common phyla were identified. We were able to measure the extend of the diversity of this complex ecosystem and distinguish the most diversified phyla. Different types of structures were observed: some phyla are constituted of frequently observed phylotypes while others are mainly composed of endemic phylotypes. In a second phase, 7 digesters were selected to pursue the exploration of the diversity at a deeper level with a large number of clones sequenced for Archaea and Bacteria domain. A selection of statistic tools was used to compare the populations encountered and determine their level of similarity/difference. For Archaea domain, seven OTUs were found to be dominant and are in equilibrium. Depending on the availability and the concentration of the substrates, some OTUs of the seven may become more abundant. These dominant OTUs are affiliated with Methanosarcinales, Methanomicrobiales and Arc I phylogenetic groups. We highlighted the abundance of the lineage Arc I which is probably in competition with Methanosaeta species. This implies that Arc I could be an acetate consumer and therefore a major actor in acetoclastic methanogenesis. New cultivation experiments are being conducted to explore the metabolic ability of Arc I that are still unclear. Moreover, statistical analysis revealed that the Bacteria community can be described as a three component model: one third making up a core group of phylotypes defined as OTUs commonly found in most of the digesters, one third are phylotypes shared between a few digesters, and another third are endemic phylotypes. The core group is composed of 6 OTUs affiliated with the less diversified phyla: Chloroflexi, Betaproteobacteria, Bacteroidetes and Synergistetes. Other phyla such as Firmicutes, Alpha and Deltaproteobacteria are composed of a majority of endemic sequences. Among these OTUs 2 are commonly found in other environments while the other four seem to be specific of anaerobic environments. These populations commonly found in anaerobic digesters could be major actors of the degradation of the organic matter. Based on the large database of 16S rDNA sequences specific probes were designed to target the dominant groups and quantify their activity inside the reactors. This quantitative analysis underlined the most active groups and especially the importance of the candidate division WWE1. These hybridization experiments also revealed a diversity that is not yet targeted by the existent probes and the limits in the use of primers 0008F and 1390R for the clones libraries construction. The comparison of qualitative and quantitative approach showed that some groups seem to be over-represented in clones libraries compared to their real activity. We followed a full-cycle RNA approach from a molecular inventory to quantification with specific probes. This comparison of anaerobic digester populations is a first step toward a future understanding on microbial resource management in order to manage complex microbial system. Ultimately, the relationship between biodiversity, operating conditions and digester efficiency could be established for a better process engineering in anaerobic digestion.EVRY-Bib. électronique (912289901) / SudocSudocFranceF

Analyse de la diversité moléculaire du microbiome de trois digesteurs anaérobies traitant les boues de stations d'épuration des eaux usées domestiques

La digestion anaérobie est un processus naturel de dégradation de la matière organique réalisé par l action concertée de plusieurs populations microbiennes. Grâce au développement des techniques moléculaires et des projets de métagnéomique, notre connaissance de la diversité de ce monde microbien a été approfondie. Ainsi, de nombreuses nouvelles lignées bactériennes et archées ont été découvertes. L association de ces techniques moléculaires nous a permis d explorer et comparer la diversité des micro-organismes présents dans 3 digesteurs anaérobies des STEP Corbeil, Creil et Evry. Les analyses montrent des profils comparables pour Corbeil et Evry mais différents de ceux de Creil. Au sein du domaine Bacteria, les populations dominantes appartiendraient aux divisions des Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, et Chloroflexi. Certaines populations minoritaires dans un digesteur deviennent dominantes dans l autre (exemple des Spirochaetes à Corbeil). Concernant le domaine Archaea, la nouvelle lignée Arc I (ou WSA2) domine à Corbeil et à Evry. Celle ci n a pas été détectée à Creil où les Methanosarcinales sont dominants. La découverte d une nouvelle division candidate WWE3 par une approche metagénomique montre que les méthodes PCR-dépendantes reflètent une image infidèle de la diversité des écosystèmes.Anaerobic digestion is a natural process, where, under anaerobic conditions, a consortium of microorganisms converts organic material into methane. The development of PCR-dependant techniques and also metagenomic approaches extended our view of population diversity of this consortium and permitted the discovery of novel bacterial and archaeal lineages. In this study, we analyse and compare the prokaryotic diversity of 3 anaerobic municipal sludge digesters: Corbeil, Creil and Evry. Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences shows similar profiles for Evry and Corbeil, while Creil is different. Within the bacterial domain, four predominant phylogenetic groups are detected: Bacteroidetes, Proteobacteria, Firmicutes and Chloroflexi. However, bacterial divisions which are minorities in some digesters, may dominate in others , such as Spirochaetales in Corbeil. Within the archaeal domain, the Arc I lineage (WSA2) is predominant in Evry and Corbeil digesters while it is absent in Creil, where Methanosarcinales is the dominant group. The discovery of the novel bacterial candidate division WWE3 by a metagenomic approach confirms that our view of the microbial diversity within these complex ecosystem remains incomplete.EVRY-Bib. électronique (912289901) / SudocEVRY-BU (912282101) / SudocSudocFranceF

Microbiotes et métagénomique

Au cours des années 1990, de nouvelles techniques d’analyse ont été appliquées à l’étude des flores et des communautés microbiennes. Ces approches essentiellement analytiques ont consisté en des inventaires moléculaires massifs. Quel bilan vingt ans après ? Sur le plan des compositions microbiennes, de leur suivi et du diagnostic, les résultats sont impressionnants. Mais que font tous ces organismes, quels sont les facteurs qui favorisent ces associations et leur maintien ? Les tentatives d’inventaires de gènes qui approchent l’exhaustivité nous permettent d’approfondir certains processus physiologiques mais ne disent guère plus. Des microbiotes ont même commencé à être manipulés. Mais comme souvent dans la dialectique entre théorie et pratique, « ça marche » mais nous sommes loin d’avoir compris comment

Co-occurence of Crenarchaeota, Thermoplasmata and methanogens in anaerobic sludge digesters

International audience16S rRNA Crenarchaeota and Thermoplasmata sequences retrieved from 22 anaerobic digesters were analysed. 4.8 and 0.53 % of archaeal sequences were simultaneously affiliated to these lineages. A core of 2 operational taxonomic units (OTUs) representing 0.6 to –33.6 % of all archaeal sequences were defined for the Crenarchaeotes and identified to already known but not yet cultivable organisms in almost half of the digesters sampled. For the Thermoplasmata, apparently less abundant with 0.7 to –4.7 % of the archaeal sequences, 3 OTUs were identified. We showed here that Crenarchaeotes coexist with methanogens and are particularly abundant when Arch I lineage (also called WSA2 by Hugenholtz) is dominant in digesters. Moreover, Thermoplasmata were detected when Crenarchaeota were present. Interactions between methanogens, Crenarchaeotea and Thermoplamata were thus discussed

La diversité insoupçonnée du monde microbien

National audienceMicroorganisms represent the largest component of biodiversity in our biosphere. Traditional methods of bacterial identification depend on their culture on laboratory media and the comparison of their phenotypic characteristics. They include cellular morphology, motility, staining reactions of cell walls, ability to grow on different media and biochemical tests. These methods have many limitations and only a very small fraction of microorganisms have been cultivated. To date, molecular methods based on 16S rRNA sequences and their phylogenetic analysis are widely used for reliable identification, particularly for hard-to-culture microbial pathogens. These so-called > do not require laboratory culture of isolated organisms, and many novel non-described phyla have been detected, improving our view of bacterial diversity. Novel strategies for culturing the > are now under development, which are leading to the complete characterization of these new bacteria. More recently, meta- or ecogenomics, based on the complete sequencing of clones containing cosmids or bacterial artificial chromosomes with inserts, addresses the genetic potential of a sample irrespective of whether the microorganisms can be cultured or not. This has considerably extended our view of microbial diversity at the genomic level and the probability of finding new genes and their products suitable for the biotechnological and pharmaceutical industry.Les méthodes traditionnelles d’identification bactérienne par la détermination de quelques caractéristiques phénotypiques et l’appréciation de quelques propriétés physiologiques ont montré leurs limites, en particulier pour la détection des micro-organismes non ou difficilement cultivables. Elles ont conduit à la description d’une très faible partie de la diversité bactérienne existante et à la sous-estimation même de la richesse du monde vivant qui nous entoure. En médecine, plusieurs maladies - à l’évidence infectieuses - sont restées sans étiologie jusqu’à l’avènement des méthodes moléculaires fondées sur l’analyse phylogénétique des séquences d’ARNr 16S ou de gènes de protéines. Ces méthodes permettent, aujourd’hui, une détection et une reconnaissance fiable des pathogènes difficilement cultivables et la mise en œuvre de traitements appropriés. Le suivi des maladies infectieuses (légionelloses, choléra) dont les agents sont en état de « non-cultivabilité » dans l’environnement est également facilité. Au-delà des pathogènes, notre environnement contient des milliers de bactéries non ou difficilement cultivables, qui ont suscité le développement de nouvelles stratégies de culture et, plus récemment, de techniques dites de « méta- ou écogénomique ». Un aperçu de la diversité métabolique et du potentiel génétique tout à fait insoupçonnés de ces bactéries nous est promis dans les années à venir