Validation of reference genes for expression analysis in the salivary gland and the intestine of Rhodnius prolixus (Hemiptera, Reduviidae) under different experimental conditions by quantitative real-time PCR

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p><it>Rhodnius prolixus </it>is a blood-feeding insect that can transmit <it>Trypanosoma cruzi </it>and <it>Trypanosoma rangeli </it>to vertebrate hosts. Recently, genomic resources for invertebrate vectors of human pathogens have increased significantly, and <it>R. prolixus </it>has been one of the main species studied among the triatomines. However, the paucity of information on many of the fundamental molecular aspects of this species limits the use of the available genomic information. The present study aimed to facilitate gene expression studies by identifying the most suitable reference genes for the normalization of mRNA expression data from qPCR.</p> <p>Results</p> <p>The expression stability of five candidate reference genes (<it>18S </it>rRNA, <it>GAPDH</it>, β-actin, α-tubulin and ribosomal protein <it>L26</it>) was evaluated by qPCR in two tissues (salivary gland and intestine) and under different physiological conditions: before and after blood feeding and after infection with <it>T. cruzi </it>or <it>T. rangeli</it>. The results were analyzed with three software programs: geNorm, NormFinder and BestKeeper. All of the evaluated candidate genes proved to be acceptable as reference genes, but some were found to be more appropriate depending on the experimental conditions. <it>18S</it>, <it>GAPDH </it>and α-tubulin showed acceptable stability for studies in all of the tissues and experimental conditions evaluated. β-actin, one of the most widely used reference genes, was confirmed to be one of the most suitable reference genes in studies with salivary glands, but it had the lowest expression stability in the intestine after insect blood feeding. <it>L26 </it>was identified as the poorest reference gene in the studies performed.</p> <p>Conclusions</p> <p>The expression stability of the genes varies in different tissue samples and under different experimental conditions. The results provided by three statistical packages emphasize the suitability of all five of the tested reference genes in both the crop and the salivary glands with a few exceptions. The results emphasise the importance of validating reference genes for qRT-PCR analysis in <it>R. prolixus </it>studies.</p

La región intergénica del gen H2A apoya las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+) de Trypanosoma rangeli

Introducción. Con base en la amplificación del ADN de los minicírculos del cinetoplasto y de los genes miniexón, Trypanosoma rangeli ha sido clasificado en las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+). Objetivo. Comparar la región intergénica de los genes H2A entre cepas KP1(+) y KP1(-) de T. rangeli, con el fin de aportar evidencias a dicha división. Materiales y métodos. Se amplificó, clonó y determinó la secuencia de la región intergénica de los genes h2a de las cepas KP1(-) Tre y 5048 y de la cepa Choachí [KP1(+)]. Dichas secuencias, junto con las reportadas para las cepas C23 [KP1(-)] y H14 [KP1(+)], fueron utilizadas para la reconstrucción de árboles filogenéticos basados en los métodos de neighbor-joining, máxima parsimonia y máxima verosimilitud, utilizando la cepa Y de Trypanosoma cruzi como grupo raíz externo. Resultados. Se evidenció heterogeneidad intraespecífica en el tamaño de la región estudiada, soportados por valores bootstrap de 85% (neighbor-joining), 66% (máxima parsimonia) y 57% (máxima verosimilitud), los resultados indican que las cepas KP1(-) se agrupan aparte, claramente diferenciadas de las cepas KP1(+), las cuales presentan una mayor heterogeneidad intraespecífica en tamaño y secuencia. Además, se encontró mayor proximidad filogenética entre T. rangeli y T. cruzi que entre T. rangeli y Trypanosoma brucei. Conclusiones. Los análisis filogenéticos basados en la región intergénica de los genes h2a de las cepas estudiadas apoyan la división de T. rangeli en las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+). Sin embargo, se requiere estudiar un mayor número de cepas para confirmar estos hallazgos