Desarrollo, análisis y optimización de modelos celulares hepáticos para estudios de fármaco-toxicología y terapia celular

Given the importance of the liver in the metabolism and maintenance of the homeostasis of the organism, many studies have been conducted in the area of toxicology and, more recently, in hepatic cellular therapy. However, the main drawback is the limited availability of viable and functional hepatocytes due to the scarcity of liver tissue. The purpose of this work was based on the development and characterization of hepatic cellular models to become an alternative to hepatocytes in toxicology studies and cellular therapy. To this end, three main objectives have been investigated: 1) to adopt a procedure of hepatocyte isolation from discarded organs for transplantation which determines the optimal conditions for the isolation and culture of hepatocytes, 2) to characterize the cells from the hepatoblastome HepG2, and 3) to develop a hepatogenic differentiation protocol to induce the hepatic differentiation in adipose-derived stem cells (ADSC). In particular, the hepatogenic differentiation of stem cells opens a wide range of possibilities to facilitate the establishment of an adult differentiated cellular model useful for pharmaco-toxicological studies and for hepatic cellular therapy. The use of adult stem cells may allow the establishment of an adult cellular model with properties that others cellular models, like HepG2, do not show. However, it is necessary to optimise the isolation and cryopreservation procedures, as well as the differentiation protocols from adult stem cells and try to acquire a wide knowledge of the cellular and molecular mechanisms that control the transdifferentiation to hepatocytes.Key Words: cellular transplant, esteatosis, human hepatocytes, hepatoblastomes, stem cells.El hígado juega un papel fundamental en el metabolismo de medicamentos y en el mantenimiento de la homeostasis del organismo y, por tanto los modelos celulares hepáticos desempeñan un papel clave para estudios fármaco-toxicológicos y más recientemente en el campo de la terapia celular. Sin embargo, la limitada disponibilidad de hepatocitos viables y funcionales debido a la falta de tejido hepático es la principal limitación para utilizar estos recursos celulares. El objetivo del presente trabajo se ha basado en el desarrollo y caracterización de modelos celulares hepáticos que puedan constituir una alternativa a los hepatocitos para este tipo de aplicaciones. Para ello se han abordado tres estrategias diferentes: 1) optimización del proceso de obtención de hepatocitos a partir de hígados enteros descartados para transplante, determinando las condiciones adecuadas para el aislamiento y cultivo de hepatocitos; 2) caracterización funcional de las células del hepatoblastoma HepG2 y 3) desarrollo de un protocolo para inducir la diferenciación hepatogénica de células madre mesenquimales adultas derivadas de tejido adiposo (ADSC). Para conseguir un buen aprovechamiento de hígados descartados para transplante resulta necesario optimizar los protocolos de aislamiento y criopreservación de hepatocitos. El estudio con células madre adultas se presenta como una alternativa muy válida para la obtención de hepatocitos-like viables y funcionalmente activos útiles a corto plazo en estudios de fármaco-toxicología y en un futuro para terapia celular hepática. El uso de células madre abre un gran abanico de posibilidades facilitando el establecimiento de un modelo celular diferenciado adulto con características que otros modelos celulares, como son el hepatoma humano HepG2, no presentan. No obstante, es necesario adquirir un mayor conocimiento de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la transdiferenciación a hepatocitos.Palabras clave: trasplante celular, esteatosis, hepatocitos humanos, hepatoblastomas, células madre

Alternative sources of hepatocytes for cell therapy

Existe una necesidad urgente de buscar alternativas al trasplante de órgano entero. Diversos métodos han sido propuestos como alternativas al trasplante hepático. Entre ellos, el trasplante celular es actualmente uno de los más prometedores. Para ello, alternativamente al uso de hepatocitos adultos plenamente diferenciados, se considera el uso de «células madre» como método terapéutico muy atractivo para las enfermedades hepáticas y para el mantenimiento de la función hepática hasta la obtención de un injerto adecuado para trasplante. Esta estrategia está basada en la capacidad de las células madre de diferenciarse en varios tipos celulares en función del entorno en que se encuentren. Así, las células madre constituirían un recurso inagotable de células hepáticas para trasplante y terapia génica. La médula ósea se considera el tejido fuente de células troncales adultas más prometedor debido, en parte, a la versatilidad de las células obtenidas para reparar tejidos dañados de muy diversas estirpes. Se han descrito diferentes tipos de células madre en la médula ósea: hematopoyéticas, mesenquimales, la población lateral y las células progenitoras adultas multipotenciales. Se cree que las células de la médula ósea son la tercera fuente de reclutamiento en la regeneración hepática después de los hepatocitos y las células madre exógenas del hígado. Por este motivo se ha intentado diferenciarlas a linaje hepático para su posterior uso en la terapia celular hepática. En este trabajo se hace una revisión de los avances alcanzados en este sentido

Oxidative stress triggers cytokinesis failure in hepatocytes upon isolation

Primary hepatocytes are highly differentiated cells and proliferatively quiescent. However, the stress produced during liver digestion seems to activate cell cycle entry by proliferative/dedifferentiation programs that still remain unclear. The aim of this work was to assess whether the oxidative stress associated with hepatocyte isolation affects cell cycle and particularly cytokinesis, the final step of mitosis. Hepatocytes were isolated from C57BL/6 mice by collagenase perfusion in the absence and presence of N-acetyl cysteine (NAC). Polyploidy, cell cycle, and reactive oxygen species (ROS) were studied by flow cytometry (DNA, phospho-histone 3, and CellROX® Deep Red) and Western blotting (cyclins B1 and D1, and proliferating cell nuclear antigen). mRNA expression of cyclins A1, B1, B2, D1, and F by reverse transcription (RT)-PCR was also assessed. Glutathione levels were measured by mass spectrometry. Here we show that hepatocyte isolation enhanced cell cycle entry, increased hepatocyte binucleation, and caused marked glutathione oxidation. Addition of 5 mM NAC to the hepatocyte isolation media prevented glutathione depletion, partially blocked ROS production and cell cycle entry of hepatocytes, and avoided the blockade of mitosis progression, abrogating defective cytokinesis and diminishing the formation of binucleated hepatocytes during isolation. Therefore, addition of NAC to the isolation media decreased the generation of polyploid hepatocytes confirming that oxidative stress occurs during hepatocyte isolation and it is responsible, at least in part, for cytokinesis failure and hepatocyte binucleation