해양 방선균 Streptomyces bacillaris MBTC38 유래 대사물질의 항균활성 및 작용기전 연구

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 농업생명과학대학 농생명공학부, 2021.8. 오기봉.Actinobacteria are attractive phylum to produce various secondary metabolites with promising biological activities. Especially, marine-derived actinobacteria have been expected to produce metabolites with novel structure and mechanisms due to their unique circumstances. The present thesis evaluates biological activities of natural products from marine Streptomyces and investigates action mechanism of those compounds. The first part deals with estimation of antibacterial activities of four lactoquinomycins and identification of their mode of action. Lactoquinomycin A (LQM-A) (compound 1) and its derivatives (2–4) showed potent antibacterial activities against Gram-positive bacteria. Especially, LQM-A exhibited the most significant inhibitory activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), with a low incidence of resistance. An in vivo dual-reporter assay designed to distinguish between compounds that inhibit translation and those that induce DNA damage was employed to assess the mode of action of LQM-A. Consequently, LQM-A-induced DNA damage via DNA intercalation, which was verified by reduced fluorescence based on the ethidium bromide displacement assay. Moreover, LQM-A dramatically reduced expression of grlA and grlB encoding topoisomerase Ⅳ in MRSA. These data suggest that LQM-A exhibited promising antibacterial activity based on the intercalation into double-stranded DNA and transcriptional inhibition of essential genes. The second part of this research describes structure elucidation of alkaloid-type compounds and confirmation of significant inhibitory activity against isocitrate lyase (ICL). ICL, a key enzyme of glyoxylate cycle, plays an important role in the infection and pathogenesis of microorganisms. Based on the spectroscopic data, two compounds were identified and named as bacillimide (5) and bacillapyrrole (6). Absolute configuration (3R, 6S, 7S) of novel compound, bacillimide was determined through NOESY and ECD measurements with benzoyl bacillimide. The bacillimide and bacillapyrrole exhibited significant (IC50 = 44.24 μM) and moderate (IC50 = 190.45 μM) ICL inhibitory activity, respectively. The kinetics assay showed bacillimide behaved as a mixed type inhibitor. The growth phenotype assay using icl-deletion mutant showed that bacillimide inhibited the growth of Candida albicans under C2 carbon utilizing condition. Moreover, bacillimide resulted in dramatically reduced expression of icl gene encoding ICL.Actinobacteria는 우수한 생리 활성을 가지는 2차 대사물질을 생산하는 매력적인 미생물이다. 해양 환경은 낮은 산소농도, 적은 양의 빛 그리고 높은 압력 등과 같은 독특한 환경적 요소들을 가지고 있다. 이 때문에 해양 유래의 actinobacteria는 새로운 구조와 작용 기전을 가지는 대사물질들의 생산 주체로서 주목받고 있다. 본 연구는 해양 방선균 유래 천연물의 생리활성을 평가하고 그에 대한 작용 기전을 탐색하는 내용을 담고 있다. 첫번째 파트는 분리된 4개의 lactoquinomycin 계열 물질들의 항 세균 효과를 탐색하고 그 작용 기전을 탐색하는 연구를 다루고 있다. Lactoquinomycin A (LQM-A, 물질 1)와 3개의 유사체 (물질 2-4)는 그람 양성 세균에 대해서 우수한 저해능을 보이는 것으로 나타났다. 특히 LQM-A는 대표적인 항생제 저항성 균주인 methicillin-resistant Staphylococcus aureus에 대해서 뛰어난 활성을 보임과 동시에 저항성 균주를 유발하지 않는 것으로 확인되었다. 구조적 유사성을 기반으로 제작된 dual-reporter 실험을 통하여 LQM-A는 번역을 저해하기 보다는 DNA에 손상을 주는 기전을 갖는 것으로 확인되었다. 이는 ethidium bromide displacement 실험을 통하여 LQM-A가 DNA 이중가닥에 끼임으로서 DNA 손상이 유발하는 것으로 나타났다. 또한 LQM-A는 DNA에 끼어들면서 황색 포도상 구균의 필수 유전자인 grlA와 grlB의 발현을 상당히 억제하는 함으로써 항세균 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 두번째 파트는 Candida albicans가 숙주에 감염 시 또는 병원성을 띄는데 있어 필수 효소인 isocitrate lyase (ICL)에 저해 활성을 갖는 물질을 규명하고 저해 활성을 확인하는 연구를 담고 있다. 분광학적 정보를 토대로 분리된 두 물질에 대한 구조를 동정하였고 bacillimide (물질 5)와 bacillapyrrole (물질 6)로 명명하였다. 신규 물질인 bacillimide의 절대 구조 (3R, 6S, 7S)는 NOESY와 ECD 분석을 이용하여 결정하였다. 두 물질은 모두 ICL 효소에 대해서 저해능을 보이는 것으로 확인되었다. 그 중 bacillimide는 ICL 저해제로 알려진 3-nitropropionate에 비해서 활성은 낮지만 매우 뛰어난 활성을 보였으며 Dixon plot을 이용하여 저해 방식을 살펴본 결과 혼합형의 형태를 보이는 것으로 나타났다 (IC50 = 44.24 μM). ICL 발현을 담당하는 유전자(icl)가 삭제된 또는 보완된 돌연변이를 이용한 생장 실험을 통하여 bacillimide는 ICL을 저해함으로써 탄소 2개로 이루어진 영양소의 섭취를 어렵게 하는 것으로 나타났다. 이는 icl의 전사를 억제함으로써 이루어진다는 것을 역전사 중합효소반응을 통해 입증하였다.Part Ι. Antibacterial Activity and Mode of Action of Lactoquinomycin A from Streptomyces bacillaris MBTC38 1 Introduction 2 Antibiotics and resistant microorganisms 2 Natural products and actinobacteria 3 Polyketides and lactoquinomycin A 5 Material and Methods 8 General experimental procedures 8 Taxonomic identification of the lactoquinomycin-producing microorganism 8 Cultivation, extraction, and isolation of compounds 9 Antibacterial activity assays 11 Multi-step resistance development assay 12 Time-kill kinetics assay 13 Membrane permeabilization assay 13 Detection of the mode of action with the dual-reporter system 14 Ethidium bromide (EtBr) displacement assay 15 DNA mobility shift assay 16 Real-time quantitative PCR and reverse transcription (RT) PCR assays 16 Checkerboard assay 21 Results 22 Taxanomy of strain MBTC38 22 Isolation and structural elucidation of compounds 1-4 26 Antibacterial activities of compounds 1-4 36 Multi-step resistance development and time-kill kinetics 39 Mode of action of LQM-A 42 DNA intercalation effects of LQM-A 46 Transcriptional inhibition of LQM-A on essential genes of S. aureus 52 Synergetic effect of LQM-A with ampicillin 58 Discussion 62 Part Ⅱ. Isocitrate Lyase Inhibitory Activity of Bacillimide and Bacillapyrrole from Streptomyces bacillaris MBTC38 65 Introduction 66 Isocitrate lyase and its potential of antifungal agents 66 Alkaloids and their biological activities 66 Material and Methods 68 General experimental procedures 68 Cultivation, extraction, and isolation of compounds 68 Benzoylation of compound 5 69 Electronic circular dichroism (ECD) calculation 69 Preparation of recombinant isocitrate lyase of C. albicans 70 ICL inhibitory activity assay 71 Kinetics analysis 71 In vitro growth assay 72 Grow phenotype and icl expression analysis 72 Results 76 Isolation and structural elucidation of compound 5-6 76 Absolute configuration of bacillimide 86 ICL inhibitory activity of isolated compounds 94 Inhibition of C2 substrate utilization 98 Effects of bacillimide on growth phenotype and icl expression 100 Discussion 104 Reference 107 Supplementary Materials 115 Abstract in Korean 156 Publications 158 Acknowledgement 160박

組織公正性의 個人實利모델과 集團價値모델의 比較에 관한 硏究

1995-06조직에 있어서 公正性에 대한 연구들은 크게 두가지 차원에서 이루어져왔다. 하나는 結果를 산출하는데 사용된 節次에 초점을 맞춘 節次公正性(Procedural Justice;PJ로 약칭)이며, 다른 하나는 결과 자체에 초점을 맞춘 分配公正性(Distributive Justice;DJ로 약칭)이다. 이러한 공정성개념들은 組織에 대한 여러 가지 態度들에 영향을 미치는 것으로 밝혀 公正性에 대한 사람들의 인식은 조직의 효과적인 기능과 개인들의 만족을 위한 필수조건으로 보여질 수 있다