CYP1B1 유전자 발현 조절 작용 연구 및 CYP1B1-CALUX 시험법 확립

Cytochrome P4501B1 (CYP1B1)은 주로 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD)과 같은 다환상 방향족 탄화수소에 의해 유도되는데 이러한 유도 작용은 여러 가지 화합물에 의해 조절을 받는다. 본 실험에서는 사람 유방암 세포주인 MCF-7에서 여러 화학 물질이 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 사람의 CYP1B1의 5´ flanking DNA를 luciferase reporter 유전자를 포함한 vector에 clone하여 Hepa-I 세포와 MCF-7 세포에 transfection 한 뒤, 여러 가지 화합물을 처리하여 발현되는 luciferase 활성을 측정하였다. CYP1B1 효소는 PAHs 대사에 관여하며, estradiol을 발암성 대사체인 4-hydroxy estradiol로 전환시킨다. Luciferase 활성은 1 nM TCDD에 의해 약 20배 정도 증가하며, 이러한 반응은 농도 의존적이다. Hepa-Ⅰ 세포에서 17β-estradiol은 TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성을 감소시켰으며, 이러한 감소 효과는 ER의 부분 길항제인 tamoxifen과의 병용 처치로 부분적으로 회복되었다. 17β-estradiol 대사체인 16α-estriol도 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 억제하였다. 저산소 상태 유도 물질인 cobalt chloride (CoCl2)와 picolinic acid (PA)는 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 억제하였다. 히스톤의 아세틸화와 탈 아세틸화는 유전자 발현에 중요하다. Hepa-Ⅰ 세포에 phCYP1B1-Luc을 transfection한 후, 히스톤 탈 아세틸화 효소 저해제인 Tricostatin A, IN2001과 SAHA를 유도제와 같이 처치하였을 때, CYP1B1의 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 실험에 사용한 모든 히스톤 탈 아세틸화 효소 저해제들은 단독처치 시 대조군에 비해 luciferase 활성이 증가하였고, TCDD에 의해 유도된 CYP1B1의 유전자 활성도 증가시켰다. 산업 사회에서 사람들은 유기체의 불완전 연소로 생기는 환경 오염물질인 PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbons)에 쉽게 노출이 된다. PAHs는 AhR (aryl hydrocarbon receptor)의 강력한 효능제이다. 세포에서 cytochrome P4501B1 (CYP1B1)의 유도는 AhR 활성에 대한 파라미터로 사용된다. 또한 PAHs는 cytochrome P450에 의하여 활성화된다고 알려져 있다. 본 논문에서는 사람 유방암 세포주인 MCF-7에서 13 종의 PAHs와 환경시료가 CYP1B1에 미치는 영향을 알아보았다. PAHs에 의해 유도된 CYP1B1-luciferase reporter gene 활성과 CYP1B1 mRNA의 발현을 측정하였다. Benzo(k)fluoranthene과 dibenzo(a,h)anthracene은 농도 의존적으로 CYP1B1의 유전자 발현과 mRNA의 발현을 증가시켰다. MCF-7 세포에서 acenaphthene, anthracene, benzo(b)fluoranthene, fluorene, fluoranthene, naphthalene, pyrene, phenanthrene and carbazole은 약한 반응을 보였다. RT-PCR analysis에서도 PAHs는 CYP1B1의 mRNA 발현을 크게 증가시켰다. Genistein, daidzein, chrysin, naringenin and morin과 같은 flavonoids에 대해서도 연구하였다. 이러한 flavonoids는 저농도에서는 B(k)F에 의해 유도된 luciferase 활성을 저해하지만, 고농도에서는 오히려 luciferase 활성을 증가시켰다.;Cytochrome P4501B1 (CYP1B1) is known to be inducible by xenobiotic compounds such as policyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and dioxins such as 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD). And these induction of CYP1B1 is also regulated by many categories of chemicals. In order to investigate the effects of several chemicals on CYP1B1 gene expression in Hepa-Ⅰ and MCF-7 cells, 5' flanking DNA of human CYP1B1 was cloned into pGL3 basic vector containing luciferase gene, and then transfected into these cells. After treatment of chemicals, the luciferase activity was measured. CYP1B1 enzyme metabolize PAHs and estradiol. CYP1B1 metabolize estradiol to 4-hydroxyestradiol that is considered as carcinogenic metabolite. Luciferase activity was induced about 20 folds over that control by 1 nM TCDD (2,3,7,8-tetrachloro-p- dioxin) and these inductions were dose-dependent. 17β-estradiol significantly inhibited TCDD stimulated luciferase activity dose dependently and this inhibition was partially recorvered by concomitant treatment with tamoxifen. And also, 17β-estradiol metabolite, 16α-estriol resulted in inhibitory effect on CYP1B1 gene expression. To study the effects of hypoxic condition on the TCDD induced CYP1B1 gene expression, cobalt chloride and picolinic acid were administrated before the treatment of TCDD. All these reagent decreased the luciferase activity induced by TCDD. Acetylation and deacetylation of histone are important for gene expression. We observed the effect of HDACs inhibitors on CYP1B1 gene expression in Hepa-I cells were transfected with phCYP1B1-Luc transiently. All HDAC inhibitors that used, increased CYP1B1 transcription alone and TCDD induced CYP1B1 transcription. Recent industrialized society, human has been widely been exposed to widespread environmental contaminants such as PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbon) that are originated from the incomplete combustion of hydrocarbons. PAHs are known to be ligands of the AhR (aryl hydrocarbon receptor). Induction of cytochrome P4501B1 (CYP1B1) in cell culture is widely used as a biomarker for PAHs. Therefore we have studied the effect of PAHs in the human breast cancer cells MCF-7 to evaluate bioactivity of PAHs. We have used the United State of America EPA selected 13 different PAHs, PAHs mixtures and extracts from environmental samples to evaluate the bioassay system. We examined effects of PAHs on the CYP1B1-luciferase reporter gene and CYP1B1 mRNA level. Benzo(k)fluoranthene and dibenzo(a,h)anthracene showed strong response to CYP1B1 promoter activity stimulation, and also CYP1B1 mRNAs increase in MCF-7 cells in a concentration-dependent manner. Acenaphthene, anthracene, benzo(b)fluoranthene, fluorene, fluoranthene, naphthalene, pyrene, phenanthrene and carbazole were weak responders in MCF-7 cells. RT-PCR analysis indicated that PAHs significantly up-regulate the level of CYP1B1 mRNA. Some flavonoids such as genistein, daidzein, chrysin, naringenin and morin were also investigated. These flavonoids decreased B(k)F induced luciferase activity at low concentration. But, these flavonoids exhibited stimulatory effect at high concentration.목차 List of tables and schemes = ⅲ List of figures = ⅳ 논문 개요 = ⅵ I. 서론 = 1 Ⅱ. 실험 재료 및 방법 = 7 A. 실험 재료 및 기구 = 7 B. 실험 방법 = 13 1. 세포 배양 = 13 2. 약물처치 = 13 3. Plasmids = 13 4. Transfection = 15 5. Luciferase 활성 측정 = 15 6. 단백질 정량 = 16 7. mRNA 측정 = 16 Ⅲ. 결과 = 23 A. 여러 가지 히스톤 탈 아세틸화 저해제가 CYP450 1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 23 1. TSA = 23 2. IN2001 = 23 3. SAHA = 26 B. Estrogen류가 TCDD에 의한 CYP450 1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 26 1. 17β-Estradiol = 26 2. 16α-Estriol = 26 C. 저산소(Hypoxia) 상태 유도 물질이 CYP450 1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 31 1. Cobalt chloride가 TCDD에 의해 유도되는 luciferase 활성에 미치는 영향 = 31 2. Picolinic acid가 TCDD에 의해 유도되는 luciferase 활성에 미치는 영향 = 31 D. TCDD에 의한 Hepa-Ⅰ-ph1B1-Luc 세포의 유전자 발현 조절 = 34 1. TCDD 투여 농도에 따른 luciferase 활성 변화 = 34 2. Flavonoids가 TCDD에 의한 luciferase 활성에 미치는 영향 = 34 E. PAHs가 CYP450 1B1 유전자 발현 및 mRNA에 미치는 영향 = 37 1. MCF-7 세포에서 TCDD가 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 37 2. MCF-7 세포에서 PAHs가 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 37 3. MCF-7 세포에서 PAHs가 CYP1B1 mRNA에 미치는 영향 = 37 F. Flavonoids가 CYP450 1B1 유전자 발현 및 mRNA에 미치는 영향 = 42 1. MCF-7 세포에서 B(k)F가 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 42 2. Flavonoids가 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 42 3. Flavonoids가 CYP1B1 mRNA에 미치는 영향 = 46 G. Flavonoids가 B(k)F에 의한 CYP450 1B1 유전자 발현 및 mRNA에 미치는 영향 = 51 1. Flavonoids가 B(k)F에 의한 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 51 2. Flavonoids가 B(k)F에 의한 CYP1B1 mRNA에 미치는 영향 = 58 H. 환경시료가 CYP450 1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 65 1. PCB가 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 65 2.토양시료가 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향 = 65 Ⅳ. 고찰 = 70 Ⅴ. 결론 = 76 참고 문헌 = 81 Abstract = 8

The Influence of Changes in Mobile Phone Use by Purposes on Psychosocial Maladjustment among Early Adolescents

본 연구는 초등학교 4학년부터 중학교 2학년까지 휴대전화 용도별로 이용빈도의 변화양상을 파악하고, 평균적인 변화패턴이 중학교 2학년에서의 휴대전화 의존도, 주의산만, 신체증상, 사회적 위축 및 우울 등의 심리사회적 부적응에 미치는 영향력을 검증하였다. 이를 위해 한국청소년정책연구원에서 실시한 한국아동·청소년패널 조사 중 초4 패널의 5개년 자료에 잠재성장모형을 적용하였다. 연구결과는 첫째, 휴대전화로 가족소통을 위한 이용은 초4에서 높은 수준으로 시작하여 학년이 올라감에 따라 완만하게 감소하는 것으로 나타났고, 친구소통을 위한 목적에서 휴대전화 사용은 초4부터 중2까지 증가하였으며, 오락용은 초4부터 초6까지 급속한 증가를 보여주다가 중2까지 안정적인 패턴을 유지하였다. 둘째, 가족소통의 용도로 휴대전화 사용이 시간 흐름에 따라 빠르게 감소할수록 중2에서 휴대전화 의존도, 주의산만, 신체증상, 사회적 위축 및 우울 수준이 높게 나타났다. 친구와 소통하는 용도로 휴대전화 사용이 점차 증가할수록 중2의 주의산만, 신체증상, 사회적 위축 및 우울 수준이 낮게 나타났다. 이에 반해, 오락용으로 휴대전화 사용이 학년이 높아짐에 따라 증가할수록 중2에서 휴대전화 의존도, 주의산만 및 신체증상이 더욱 강화되었다. 본 연구의 결과는 휴대전화 이용의 변화양상이 심리사회적 부적응에 미치는 영향은 휴대전화의 이용 목적에 따라 다름을 밝힘으로써 휴대전화 사용의 긍정적, 부정적 결과를 종단적으로 확인한 데 의의를 둔다. 끝으로, 연구의 제한점과 후속 연구를 위한 제언이 제시되었다. This study aimed to investigate the trajectory of mobile phone use by purposes as well as the effects of changes in mobile phone use on psychosocial maladjustment. It was analyzed data from the sample of 4th grades to 8th grades Korean Children and Youth Panel Survey using latent growth modeling. Results showed that level of mobile phone use for contacting family members decreased across time, on the other hand the levels of mobile phone use for contacting friends and entertainment increased across time. Adolescents who had experienced more rapid decreases in mobile phone use for contacting family members over time had higher levels of mobile phone dependency, inattentive problems, somatic symptoms, social withdrawal, and depression in 8th grade. Adolescents who had experienced more rapid increases in mobile phone use for contacting friends over time had lower levels of inattentive problems, somatic symptoms, social withdrawal, and depression in 8th grade. Finally, adolescents who had experienced more rapid increases in mobile phone use for entertainment over time had higher levels of mobile phone dependency, inattentive problems, and somatic symptoms in 8th grade. Implications and directions for future research were discussed

Trends and Issues in Aggression Intervention Programs from Early Childhood to Adolescence

본 연구는 학령전 아동부터 고등학교 청소년에게 실시된 공격성 감소 프로그램에 관한 논문 176편을 대상으로 프로그램의 처치 특성 및 처치 방법적 특성에 주목하여, 그 동향을 분석함으로써 향후 연구의 방향성을 제안하는 데 목적이 있다. 주요 분석결과는 다음과 같다. 먼저 프로그램 처치 특성과 관련하여, 연구참여자는 여학생보다 남학생이 많았고, 초등학생이 가장 많았으며, 대부분 어린이집, 유치원, 학교 등 일반집단으로부터 표집되었다. 유아 대상의 프로그램은 공격성의 예방과 치료 목적에서 유사한 비율로 실시되었으며, 아동과 청소년은 일반집단보다 공격성 수준이 높은 집단에게 프로그램을 실시한 연구가 더 많았다. 연령이 낮을수록 프로그램의 회기는 길지만 회기당 소요시간은 짧고, 프로그램 처치의 간격 또한 짧은 것으로 나타났다. 다음으로 프로그램 처치 방법적 특성을 살펴보면, 공격성 감소를 위한 프로그램은 다양한 이론적 접근과 매체를 활용하고 있으며 처치 프로그램의 내용은 다차원적 요소들로 구성되었다. 유아를 대상으로 관찰법을 활용하는 연구가 있었고, 아동과 청소년은 모두 설문조사방식을 활용하였으며, 프로그램은 대부분 외현적 공격성의 감소에 치중하여 실시되고 있었다. 이러한 연구결과를 통해 연구참여자의 확대 및 균형있는 연구방법의 요구 등 향후 프로그램의 연구과제가 제안되었다.The objectives of this study were to provide a review of research and to address future issues in the area of aggression intervention programs. Particularly, the study focused on reviewing interventional characteristics and treatment methodological factors in research. The comprehensive review includes 176 studies, published between 2000 and 2012, of aggression intervention programs during early childhood and adolescence. The findings from this study are as follows. First, in regard to participants, boys and elementary school children from general populations such as kindergarten and school were much more. In addition to total sessions and time per session were different according to age. Second, in regard to treatment methods, aggression intervention programs used various theoretical approaching, supplementary tools, and treatment contents. Also, observation for preschoolers and survey for children and adolescents were more used. Most programs focused on decreasing overt aggression. Issues related to Korean aggression intervention programs and implications for future research were discussed