一个包含HCVIRES的高效真核双顺反子表达载体的构建

In this paper, a new eukaryotic bi-cistronic expression vector containing Hepatitis C Virus(HCV) internal ribosome entry site (IRES) expressing two foreign genes from one mRNA was constructed. The sequence starting from the 5' untranslated region of 18nt to 32nt in HCV core coding region was cloned and then the encephalomyocarditis virus (ECMV) IRES sequence in the commercial vector pIRES was substituted to construct a new vector pCVIR. Green fluorescent protein (GFP) and Hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) coding genes were inserted up-stream and down-stream of IRES sequence. The fluorescence intensity of GFP and HBsAg were determined by flow cytometry and ELISA respectively., thus, the expression efficiency of the two vectors, pCVIR and pIRES could be compared. The experimental results showed that the vector pCVIR could translate the GFP and HBsAg genes down-stream of its HCV IRES sequence more efficiently without impairing the expression of genes up-stream of IRES sequence than the vector pIRES.It is..

戊型肝炎病毒重组颗粒性蛋白疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答研究

HEV 239是福建省医学分子病毒学研究中心实验室研制的一种戊型肝炎病毒(HEV)重组颗粒性蛋白疫苗,该文旨在研究HEV239蛋白疫苗在小鼠体内诱导产生特异性免疫应答的情况。将5μg HEV 239蛋白疫苗(239-Pro)、加铝佐剂疫苗(239-Vac)或加弗氏佐剂疫苗(239-CFA)肌肉注射免疫BALB/c鼠3次,第8周检测鼠血清抗HEV抗体及其亚类,同时用ELISPOT方法检测细胞毒性T细胞(CTL)应答。结果显示:239-Vac诱导的抗体滴度与239-CFA相当,高于无佐剂的239-Pro。239-Vac诱导的抗体中,IgG1/IgG2a比值显著高于239-CFA和239-Pro,主要为Th2型应答。除239-CFA之外,239-Vac和239-Pro也可诱导出一定的HEV抗原特异性I型Tc应答。提示:重组抗原HEV 239能诱导良好的抗体应答及一定的Tc1应答

镉和砷对褐牙鲆幼鱼线粒体的毒性效应及其作用机制

线粒体是细胞的能量代谢中心，机体大部分所需能量均由线粒体产生。除了在能量代谢中发挥重要作用之外，线粒体还参与调控细胞的增殖分化、氧化还原稳态、钙离子稳态、内分泌以及细胞凋亡等。本实验室前期研究表明，镉（Cd）和砷（As）均显著影响海洋生物（牡蛎、蛤仔、贻贝、鱼类等）的能量代谢，并且蛋白质组学分析发现Cd和As(Ⅴ)胁迫下褐牙鲆幼鱼体内20% - 33%的差异表达蛋白（DEPs）与能量代谢有关。众所周知，能量代谢对维持生物生长和生存至关重要，是增殖分化、免疫应激、渗透压调节和生殖发育等生命活动的重要基础。研究表明，线粒体极易受到细胞内外环境影响，在机体应对外界或内部胁迫过程中发挥重要作用，可能是Cd和As生物毒性作用的靶点之一。然而，目前关于Cd和As对海洋生物线粒体毒性效应及其作用机制的研究依然缺乏。因此，本论文选取渤海典型重金属污染物Cd和As(Ⅴ)为暴露物，以渤海重要渔业物种褐牙鲆幼鱼为研究对象，以鳃和肝脏线粒体为研究靶点，整合代谢组学、蛋白质组学及传统生态毒理学研究方法，旨在从亚细胞水平和分子水平上系统地探究环境相关浓度（5 μg/L和50 μg/L）的Cd和As(Ⅴ)对褐牙鲆幼鱼线粒体的毒性效应，并构建线粒体响应通路图，为渤海Cd和As污染的生物监测和风险评估提供理论依据。研究结果如下： 1. Cd对褐牙鲆幼鱼线粒体的毒性效应及其作用机制 Cd暴露14天后，通过线粒体超微形态观察、线粒体膜电位检测及代谢组学和蛋白质组学分析表征Cd对褐牙鲆幼鱼线粒体的毒性效应。在亚细胞水平上，透射电镜观察发现5 μg/L和50 μg/L Cd均诱导鳃线粒体损伤，主要表现为线粒体膜破裂或脱落等；且鳃线粒体密度随暴露浓度增加而显著增加（P < 0.01），而线粒体面积指数显著降低（P < 0.01），即Cd胁迫不仅导致鳃线粒体损伤，还诱导鳃线粒体数量增多且形态变小。为探究Cd暴露对鳃线粒体功能的影响，首先检测了维持线粒体活性及功能的关键因素——线粒体膜电位，发现5 μg/L和50 μg/L Cd以浓度依赖性方式显著降低（P < 0.05）鳃线粒体膜电位。之后，在分子水平上进行了代谢组学和亚细胞蛋白质组学分析。代谢组学结果表明，Cd诱导鳃中能量代谢相关代谢物（ATP、AMP和磷酸肌酸等）发生显著变化。基于iTRAQ的线粒体蛋白质组学分析显示，Cd诱导鳃线粒体产生128个DEPs，在5 μg/L和50 μg/L Cd暴露组分别共有74个和118个DEPs。其中，大部分DEPs呈上调表达趋势，且主要涉及三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化等能量代谢过程。进一步分析Cd对鳃线粒体的毒性作用机制发现，褐牙鲆幼鱼主要通过增强鳃线粒体TCA循环和氧化磷酸化促进ATP的产生以满足Cd胁迫条件下的能量需求，并通过上调线粒体形态与输入相关蛋白（线粒体接触位点和嵴组织系统复合物、线粒体内膜转位酶等）增强鳃线粒体的蛋白输入和结构稳定性缓解Cd毒性造成的线粒体损伤。在应激与凋亡方面，上调的鳃线粒体活性氧簇调节剂1和蛋白NipSnap同系物2造成ROS过量累积并引发Ca2+超载，而电压依赖性阴离子选择通道蛋白、肽基脯氨酰异构酶F、ADP/ATP转位酶2以及Bcl2相关的细胞死亡激动剂等凋亡相关蛋白的差异表达诱导线粒体通透性转换孔的开放和凋亡诱导因子1的释放，最终诱发细胞凋亡。此外，Cd暴露条件下褐牙鲆幼鱼鳃线粒体的响应还涉及胆固醇代谢等。 Cd暴露也造成褐牙鲆幼鱼肝脏线粒体膜结构损伤，并诱导线粒体密度和线粒体表面积增加即线粒体数量增多（P < 0.05），同时伴随出现大量脂滴，表明Cd不仅损伤肝脏线粒体的结构完整性而且会导致其代谢功能障碍。同时，显著降低的线粒体膜电位（P < 0.01）也预示Cd干扰肝脏线粒体的正常功能。分子水平上，与鳃代谢组学结果相似，在肝脏代谢图谱中鉴定到能量代谢相关的差异代谢物。不同地是，无氧呼吸产物乳酸在肝脏中显著增加，且部分能量代谢相关的差异代谢物（如ATP、AMP和磷酸胆碱等）在5 μg/L和50 μg/L Cd暴露组中呈相反的变化趋势，表明Cd暴露条件下褐牙鲆幼鱼鳃和肝脏能量代谢响应模式不同。蛋白质组学结果表明，Cd诱导肝脏线粒体产生28个与能量代谢、应激与凋亡等过程相关的DEPs。其中，5 μg/L Cd暴露组有14个，50 μg/L Cd暴露组有19个。Cd诱导产生的肝脏线粒体DEPs数量比鳃线粒体少，且大多呈下调表达趋势。进一步分析Cd对褐牙鲆幼鱼肝脏线粒体的毒性作用机制发现，Cd诱导肝脏无氧呼吸增强，抑制线粒体蛋白输入，并通过干扰TCA循环和抑制氧化磷酸化电子传递等影响肝脏线粒体的能量产生。此外，下调的蛋白质磷酸酶1K和钙摄取蛋白1参与调控肝脏线粒体通透性转换孔和Ca2+摄取，而促凋亡蛋白（第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂同系物）和抗凋亡蛋白（ATP依赖的RNA解旋酶和ATP依赖性锌金属蛋白酶等）的差异表达表明Cd干扰了褐牙鲆幼鱼肝脏中线粒体依赖性的细胞凋亡途径。 2. As(Ⅴ)对褐牙鲆幼鱼线粒体的毒性效应及其作用机制 As(Ⅴ)暴露14天后，透射电镜观察发现5 μg/L和50 μg/LAs(Ⅴ)均诱导褐牙鲆幼鱼鳃线粒体损伤，主要表现为嵴松散、断裂或脱落等；且鳃线粒体密度随暴露浓度增加而显著增加（P < 0.01），而鳃线粒体面积指数呈降低趋势，表明As(Ⅴ)诱导鳃线粒体数量增加但形态变小。之后，通过测定线粒体膜电位结合代谢组学和蛋白质组学分析表征As(Ⅴ)对鳃线粒体功能的影响。结果表明，与对照组相比，As(Ⅴ)暴露组鳃线粒体膜电位显著降低（P < 0.05）。此外，在As(Ⅴ)暴露组鳃代谢图谱中鉴定到ATP、AMP、乳酸和葡萄糖等涉及无氧呼吸和能量代谢的差异代谢物。蛋白质组学结果表明，As(Ⅴ)诱导鳃线粒体产生83个与线粒体形态与输入、能量代谢和应激与凋亡等过程相关的DEPs。其中，5 μg/L As(Ⅴ)暴露组有60个，50 μg/L As(Ⅴ)暴露组有68个，且大部分DEPs呈上调表达趋势。进一步分析As(Ⅴ)对褐牙鲆幼鱼鳃线粒体的毒性作用机制发现，在线粒体形态与输入方面，As(Ⅴ)暴露诱导线粒体接触位点和嵴组织系统复合物、无机焦磷酸酶2等差异表达并造成鳃线粒体损伤和线粒体蛋白输入增强。在能量代谢方面，褐牙鲆幼鱼通过增强无氧呼吸、TCA循环及氧化磷酸化电子传递等过程增加了鳃线粒体能量产生以满足As(Ⅴ)胁迫条件下的能量需求。在应激与凋亡方面，电压依赖性阴离子选择通道蛋白、ADP/ATP转位酶和磷酸载体蛋白等的差异表达增强了线粒体膜通透性，而Bcl2相关的细胞死亡激动剂、ATP依赖的RNA解旋酶和丝氨酸蛋白酶等凋亡调控蛋白的差异表达表明As(Ⅴ)抑制了鳃组织中线粒体依赖性的细胞凋亡途径。 As(Ⅴ)暴露诱导褐牙鲆幼鱼肝脏线粒体嵴损伤和线粒体密度呈浓度依赖性方式增加（P < 0.01），线粒体面积指数也呈增加趋势，但仅5 μg/L As(Ⅴ)暴露组与对照组具有显著性差异（P < 0.01），即5 μg/L As(Ⅴ)诱导肝脏线粒体数量增加而50 μg/L As(Ⅴ)诱导肝脏线粒体数量增加且形态变小。此外，5 μg/L和50 μg/L As(Ⅴ)暴露组肝脏线粒体膜电位显著降低（P < 0.05）。代谢组学结果表明，仅在50 μg/L As(Ⅴ)暴露组发现能量代谢相关的差异代谢物（ATP、AMP、乳酸和葡萄糖等），表明50 μg/L As(Ⅴ)与5 μg/L As(Ⅴ)相比对肝脏无氧呼吸等能量代谢过程具有更强的干扰作用。蛋白质组学分析表明，As(Ⅴ)诱导肝脏线粒体产生40个与能量代谢和应激与凋亡等过程相关的线粒体DEPs。其中，5 μg/L As(Ⅴ)暴露组有5个，50 μg/L As(Ⅴ)暴露组有35个。进一步分析As(Ⅴ)对肝脏线粒体的毒性作用机制发现，褐牙鲆幼鱼通过促进肝脏无氧呼吸并增强TCA循环和氧化磷酸化缓解As(Ⅴ)胁迫条件下ATP的过度消耗。在应激与凋亡方面，As(Ⅴ)通过上调ADP/ATP转位酶3、补体成分1Q子结合蛋白和早老素相关的菱形样蛋白等增强线粒体膜通透性并干扰了肝脏中线粒体依赖性的细胞凋亡；另一方面，肝脏线粒体通过上调甲硫氨酸-R-亚砜还原酶B2和硫氧还蛋白等维持ROS稳态以降低As(Ⅴ)毒性造成的线粒体损伤。此外，As(Ⅴ)对褐牙鲆幼鱼肝脏线粒体的毒性机制还涉及蛋白质翻译和修饰以及维生素D合成等。 3. Cd和As(Ⅴ)对褐牙鲆幼鱼线粒体的毒性作用机制比较 Cd和As(Ⅴ)对褐牙鲆幼鱼线粒体的毒性机制存在较大差异，但均诱导线粒体数量增加、线粒体损伤以及线粒体膜电位降低。同时，Cd和As(Ⅴ)均诱导褐牙鲆幼鱼增强鳃线粒体TCA循环和氧化磷酸化过程。此外，Cd诱导褐牙鲆幼鱼显著上调鳃线粒体的形态稳定性和蛋白输入，并促进线粒体依赖性的细胞凋亡；而As(Ⅴ)诱导褐牙鲆幼鱼显著下调鳃线粒体形态稳定性但增强线粒体蛋白输入，促进无氧呼吸，并抑制线粒体依赖性的细胞凋亡。Cd和As(Ⅴ)均诱导褐牙鲆幼鱼肝脏无氧代谢增强，并干扰了线粒体依赖性的细胞凋亡途径。Cd抑制肝脏线粒体蛋白输入和氧化磷酸化，并干扰TCA循环；而As(Ⅴ)诱导褐牙鲆幼鱼增强肝脏线粒体TCA循环和ROS稳态，并造成ATP产生量降低

Study on adaptability of physiological ecology of Quercus liaotungensis seedlings under soil drought

用盆栽方法人工模拟土壤干旱条件,研究辽东栎天然萌生幼苗对土壤干旱的生理生态反应。结果表明:随土壤含水量的减少,辽东栎幼苗的耗水量明显下降,耗水高峰期提前,在重度干旱下耗水峰形由单峰变为双峰。在干旱胁迫前期辽东栎叶水势变化较平缓,后期则急剧下降,尤其在严重干旱下,水势变化趋势呈&ldquo;M&rdquo;形,叶片含水量较稳定,对土壤水分含量变化不敏感。在中度干旱下辽东栎叶片的持水力有所增加。辽东栎属低蒸腾速率树种,平均仅为2.98&mu;g&middot;cm-2&middot;s-1。不同生长季节蒸腾速率日进程不同,8月份的蒸腾速率日进程在适宜水分下是双峰曲线,在中度干旱下是单峰曲线,重度干旱下蒸腾速率一直维持在较低水平,呈波状起伏;9月份的蒸腾速率下降近50%,仍有明显的单峰(适宜水分下)和双峰(中度干旱下)。对蒸腾速率与环境因子的简单相关分析表明:在适宜水分和中度干旱下,光照强度对辽东栎幼苗蒸腾速率影响最大,在重度干旱下,大气温度对辽东栎的蒸腾速率影响较大。随土壤含水量减少,辽东栎幼苗的蒸腾速率在中度干旱时上升,重度干旱时急剧下降,光合速率、瞬时水分利用效率、羧化效率均下降;地上部生长受抑,根冠比加大,WUE1下降,而WUE2在中度干旱下升高,在重度干旱下下降..

Physiological mechanism of Sophoraviciifolia to adapt to soil drought

用盆栽的方法人工控制土壤干旱条件,研究白刺花天然实生幼苗适应土壤干旱的生理学机制。结果表明:随土壤含水量的减少,白刺花叶水势在胁迫前期下降缓慢,随胁迫时间的延长,水势大幅度下降。白刺花通过在叶片内积累大量渗透保护性物质可溶性糖和K+,增加细胞的保水力,维持细胞生长所需膨压。白刺花游离脯氨酸含量变化与水分关系不大,可溶性蛋白质含量随土壤含水量减少而下降,可能是水分胁迫下受伤害的表现。随土壤水分含量的减少,白刺花SOD的活性明显升高,POD活性不高但随胁迫时间延长其活性较稳定,CAT活性下降但幅度不大,且CAT活性变化趋势与POD活性相反,说明三个保护酶能够相互配合协同作用,降低膜脂过氧化程度,减少水分胁迫造成的伤害,提高质膜稳定性,维持细胞膜的完整性,表现出很强的抗旱适应性

Effect of soil water stress on water metabolism and osmotic adjustment substance of native tree species of Loess Plateau

以黄土高原4个乡土树种的幼苗为试验材料,采用盆栽方式模拟土壤干旱环境,研究土壤干旱对不同树种水分代谢与渗透调节物质的影响。结果表明,大叶细裂槭、虎榛子叶水势、叶片含水量下降迅速,叶片离体保水能力降幅明显;白刺花、辽东栎则表现为叶水势、叶片含水量缓慢下降,组织相对含水量在中度胁迫下略有上升。白刺花在不同水分处理条件下离体叶片保水力明显高于其它树种。4个树种可溶性糖含量随土壤干旱程度加剧明显增加,可溶性蛋白质含量在树种之间变化较为复杂,无明显规律性。K+离子含量和游离脯氨酸含量在中度水分胁迫下均有不同程度升高。白刺花在土壤干旱进程中,可溶性蛋白质含量、K+离子含量和游离脯氨酸含量均明显高于其它树种。综合水分代谢和渗透调节物质来看,水分胁迫条件下,白刺花以保持高水势、减少组织水分散失和增加渗透调节物质来提高细胞原生质浓度,增强其抗旱性

Effect of soil drought on seedling growth and dry matter allocation of four native tree species on Loess Plateau

研究了不同土壤水分条件对黄土高原 4个乡土树种幼苗生长及干物质分配的影响。结果表明,中度干旱(50% ~55% &theta;f)下虎榛子(OstryopsisdavidianaDecne. )和白刺花 (SophoraviciifolinHance)的生物量比适宜水分下(70% ~75% &theta;f)增加 20. 23%和 3. 93%,而大叶细裂槭(AcerstenolobumRehd. var. megalophyllumFangetWu)和辽东栎(QuercusliaotungensisKoidz. )生物量分别降低 13. 59%和 35. 25%;重度干旱(40% ~45% &theta;f)对幼苗生长均有明显抑制作用。白刺花地上部与地下部的生长受水分胁迫影响较小,较其他树种具有更强的耐旱性;干旱对辽东栎地上部生长的影响较地下部大,重度干旱下其生长明显受抑制。随干旱程度加剧幼苗的根冠比增大,在重度干旱下大叶细裂槭根冠比达 2以上。虎榛子整体生长速度较慢,对干旱的适应可能更多表现在生理上的耐旱