改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的:建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌(LMO)的快速方法,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法:根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标-实时PCR检测体系,应用于食品中LMO检测。结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为99 cfu/m l或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时间由原来的至少4 d缩短至1 d。对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性,其中6份LMO细菌培养阳性。结论:改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,能提高LMO的检出率和准确性,可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断

双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌

目的建立改良分子信标双重实时PCR同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时PCR改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标双重实时PCR反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fgμl,菌液灵敏度为32～64CFUml或3～6CFUPCR反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标双重实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段

改良分子信标-实时PCR快速检测志贺菌

目的:建立改良分子信标-实时PCR检测志贺菌的快速方法,应用于志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。方法:根据GenBank公布志贺菌ipaH基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR-改良分子信标检测体系,应用于对志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为93 fgμ/l,菌液灵敏度为64 cfu/m l或2 cfu/PCR反应体系,无交叉反应。此反应体系检测67株志贺菌,均出现特异的荧光信号。对细菌性食物中毒样本等共657份样品进行志贺菌检测,42份志贺菌实时PCR阳性,其中41份志贺菌细菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需2 h~1 d时间。结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于志贺菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段,对于提高肠道门诊的工作效率有重要意义

改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O_(157):H_7

目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157H7的快速方法。方法根据GenBank公布O157H7的rfbE保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5’端,建立改良分子信标实时PCR检测O157H7的反应体系,应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果共检测11种细菌,只有大肠杆菌O157H7有荧光信号,其余10种全无荧光信号,且与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为64fg,菌液灵敏度为59cfu/ml或2cfu/PCR反应体系。应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157H7均出现特异的荧光信号,无干扰。对89份食品样品进行检测,5份O157H7实时PCR阳性,其余样品为阴性,检测仅需2h。5份阳性样本,经传统方法培养,有3份检出大肠杆菌O157H7。结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于大肠杆菌O157H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段