Selective thrombosis in tumor vessels induced by fusion proteins RGD-tTF and (RGD)3-tTF

选择性栓塞肿瘤组织血管从而诱发肿瘤组织的缺血性坏死是一种很有前景的抗肿瘤策略。利用导向载体构建载体-tTF融合蛋白，将截断的组织因子tTF选择性靶向于肿瘤组织血管膜表面，可以诱发肿瘤组织血管栓塞，阻断肿瘤营养物质和氧气的供给，引发肿瘤缺血性坏死，发挥抗肿瘤作用。为了验证融合蛋白RGD-tTF选择性诱发肿瘤组织血管栓塞的活性和改进tTF融合蛋白中配体RGD与肿瘤组织血管内皮细胞标志物——整合素受体αvβ3的亲和力。我们利用PCR技术分别构建RGD、(RGD)3与tTF的融合基因，克隆基因至原核表达载体pET22b(＋)，通过优化其表达条件，实现目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达，用...Selective thrombosis in tumor vessels and induction of subsequent tumor infarction is a promising anti-tumor strategy. tTF(truncated tissue factor) is only the extracellular domain of tissue factor. When tTF is targeted to the tumor vasculature by the ligand of tTF fusion protein and contacts with the cell membrane closely, it could induce thrombosis in tumor vasculature and cut off nutrition and ...学位：理学硕士院系专业：生命科学学院生物学系_生物化学与分子生物学学号：20032613

Gene Expression and Activities Analysis of a New Fusion Protein (RGD)3/tTF

为了发展一种新型的融合蛋白(RGD)3/tTF用于肿瘤血管的选择性栓塞治疗,利用PCR技术重组(RGD)3/tTF融合基因,克隆于pET22b(+)载体,表达于E.coliBL21(DE3)。用镍柱纯化融合蛋白。凝血实验与FⅩ活化实验检测融合蛋白tTF组分的活性。间接ELISA分析(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力。pET22b(+)/(RGD)3/tTF重组质粒成功获得并表达于E.coliBL21(DE3)。纯化蛋白(RGD)3/tTF能有效诱发血液凝固,活化FⅩ。(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力比RGD/tTF提高了32%。新型融合蛋白(RGD)3/tTF已在E.coli系统成功表达,表达蛋白保持tTF的活性并显示比RGD/tTF更高的与αvβ3的结合能力。 【英文摘要】 To develop a new fusion protein (RGD)3/tTF for the therapy of the selective thrombosis of tumor blood vessels. The fused gene (RGD)3/tTF was reconstructed by PCR, was cloned into vector pET22 b(+),and expressed in E.coli BL21(DE_3). The fusion protein was purified through Nickel-affinity chromatography column. The tTF activity of the fusion protein was detected by clotting assay and FⅩ activation assay. The specific binding of (RGD)3/tTF to α_vβ_3 was analyzed by indirect ELISA. The recombinant plasmid pET2...福建省自然科学基金(No.C0410004);; 厦门大学科技创新基金资助(No.XDKJCX20053026)。~

用于肿瘤血管靶向治疗的RGD/tTF融合蛋白的表达及活性鉴定

目的:制备用于肿瘤血管靶向治疗的重组RGD/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术构建RGD与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱纯化。凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性,间接ELISA分析RGD活性。结果:获得序列正确的RGD/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FⅩ、引起血液凝固的功能,且能与αvβ3特异性结合。结论:成功构建RGD/tTF/pET22b(+)重组子,RGD/tTF融合蛋白具有TF活性且与αvβ3特异性结合,为进一步研究其体内特异性诱发肿瘤组织血管栓塞功能创造了条件

人源化抗人肺癌单域抗体基因的构建、表达及活性分析

目的:构建人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3VH基因,在大肠杆菌中表达,对其蛋白活性进行分析。方法:采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化,通过重叠PCR获得hu3D3VH的基因。构建pET22(b+)/hu3D3VH表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。表达产物通过Ni亲和层析柱纯化。采用间接ELISA和竞争抑制ELISA法进行活性分析。结果:通过重叠PCR获得序列正确的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,目的蛋白的纯度达95%以上。hu3D3VH具有与亲本抗体相同的抗原反应性,并能抑制mAb3D3与L342细胞的结合。结论:获得的人源化单域抗体hu3D3VH,保留了与mAb3D3相同的反应性和特异性,为进一步临床应用奠定了基础

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b(+)/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础