目的:制备用于肿瘤血管靶向治疗的重组RGD/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术构建RGD与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱纯化。凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性,间接ELISA分析RGD活性。结果:获得序列正确的RGD/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FⅩ、引起血液凝固的功能,且能与αvβ3特异性结合。结论:成功构建RGD/tTF/pET22b(+)重组子,RGD/tTF融合蛋白具有TF活性且与αvβ3特异性结合,为进一步研究其体内特异性诱发肿瘤组织血管栓塞功能创造了条件

吴娜

庄国洪

李文珠

杨桂旺

王阶平

颜江华

Xiamen University Institutional Repository

·肿瘤免疫学·用于肿瘤血管靶向治疗的 RGD / tTF融合蛋白的表达及活性鉴定①杨桂旺 　庄国洪② 　王阶平 　李文珠 　吴 　娜 　颜江华 ②　 (福建省厦门大学生命科学学院 ,厦门 361005)　　中国图书分类号 　R392111　　文献标识码 　A　　文章编号 　10002484X( 2006) 0420327204[摘 　要 ]　目的 :制备用于肿瘤血管靶向治疗的重组 RGD / tTF融合蛋白 ,并鉴定其生物学活性。方法 :利用 PCR技术构建 RGD与 tTF的融合基因 ,克隆至表达载体 pET22 b ( + ) ,在 E. coli BL21 (DE3)中表达 ,镍亲和层析柱纯化。凝血实验和 FⅩ活化实验鉴定融合蛋白中 tTF的活性 ,间接 EL ISA分析 RGD活性。结果 :获得序列正确的 RGD / tTF /pET22 b ( + )重组子 ,融合蛋白在 E. coli BL21 (DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化 FⅩ、引起血液凝固的功能 ,且能与αvβ3 特异性结合。结论 :成功构建 RGD / tTF /pET22 b ( + )重组子 , RGD / tTF融合蛋白具有 TF活性且与αvβ3 特异性结合 ,为进一步研究其体内特异性诱发肿瘤组织血管栓塞功能创造了条件。[关键词 ]　tTF; RGD;融合蛋白 ;血管栓塞Expression and character iza tion of fusion prote in RGD / tTF for targeting therapyof cancerYAN G Gui2W ang, ZHUAN G Guo2Hong, WAN G J ie2P ing, L I W en2Zhu, WU N a, YAN J iang2Hua. School of L ife Sci2ence, X iam en U niversity, X iam en 361005, Ch ina[ Abstract] 　O bjective: To exp ress and purify a new fusion p rotein (RGD / tTF) for targeting therapy of cancer, and analyze itsactivities. M ethods: The fused gene RGD / tTF was constructed by PCR, and then was inserted into vector pET22 b ( + ) , exp ressed inE. coli BL21 (DE3). The fusion p rotein was purified through N ickel2affinity chromatography column. The tTF activity of the fusion p ro2tein was analyzed by clotting assay and FⅩ activation assay. The specific binding of RGD / tTF toαvβ3 was analyzed by indirectEL ISA. Results: The recombinant p lasm id pET22 b ( + ) /RGD / tTF with correct sequence was obtained. The fusion p rotein was ex2p ressed with high yield in E. coli BL21 (DE3). The purified fusion p rotein could activiate FⅩ and cause blood coagulation, and bindtoαvβ3 specifically. Conclusion: The recombinant p lasm id pET22 b ( + ) /RGD / tTF was constructed. The fusion p rotein retained TF ac2tivity and binding specificity toαvβ3 , lays the foundation for studying the function of inducing thrombosis in tumor vasculature in vivo.[ Key words] 　tTF; RGD; Fusion p rotein; Thrombosis　　组织因子 ( TF)是一种相对分子质量大小约为47 000的跨膜糖蛋白 ,由 295个氨基酸组成 ,其中有32个是分泌的信号肽 ,成熟的 263个氨基酸分为 3个区域 :胞外区 ( 1～219)、跨膜区 ( 220～242)和胞质区 ( 243～263) [ 1 ]。TF分布于血管内皮外侧 ,既是 FⅦ (凝血因子 Ⅶ)的细胞表面受体 ,又是 FⅦ或 FⅦa (激活的因子 Ⅶa)的辅因子 ,因此 , TF是凝血级联反应的始发因子 [ 2 ]。正常情况下内皮细胞屏障将循环血液与 TF隔开 , TF仅在血管内皮损伤并暴露于血管腔时 ,才与 FⅦ或 FⅦa形成复合物 ,进而水解活化 FⅩ (凝血因子 Ⅹ)或 FⅨ (凝血因子 Ⅸ) ,引起外源性凝血而使局部血液凝固。研究证明仅含有 TF胞外区的截短组织因子①本课题受教育部出国留学人员启动基金资助②福建省厦门大学医学院抗癌研究中心 ,厦门 361005作者简介 :杨桂旺 (1981年 - ) ,男 ,硕士 ;通讯作者 :颜江华 (1963年 - ) ,男 ,副教授 ,硕士生导师 ,主要从事肿瘤细胞分子生物学研究 , E2mail: jhyan@ xmu. edu. cn。( tTF, truncated tissue factor) ,仍保留与 FⅦ或 FⅦa结合并激活 FⅩ和 FⅨ的活性 ,但游离的 tTF对 FⅩ的激活能力要比完整的跨膜 TF低 5个数量级 ,这是因为 TF2Ⅶa复合物在带负电荷的磷脂膜表面能更有效地结合并激活 FⅩ和 FⅨ[ 3, 4 ]。1997年 Thorpe等 [ 5 ]将抗肿瘤血管标志物的抗体和具有潜在凝血功能的 tTF相结合 ,制备抗体与 tTF的融合蛋白。动物实验证实该融合蛋白可以选择性地诱发肿瘤血管栓塞 ,进而导致肿瘤消退。这种利用 tTF融合蛋白特异性诱发肿瘤血管栓塞的方法是一种新颖的抗肿瘤方法。整合素受体αvβ3 是肿瘤血管内皮细胞膜特异性标记物 ,在新生血管内皮细胞表面呈上调状态 ,而正常组织的血管含量极少 [ 6 ]。Ruoslahti等 [ 7, 8 ]利用噬菌体表面肽库展示技术成功地筛选出能与αvβ3 专一结合的肽 RGD24C,并证实 RGD24C是一个良好的肿瘤血管靶向载体。本研究以 RGD24C作为靶向载体 ,通过基因工程技术构建新型的特异性诱发肿瘤组织血管栓塞的融合蛋白 RGD / tTF。·723·杨桂旺等　用于肿瘤血管靶向治疗的 RGD / tTF融合蛋白的表达及活性鉴定　第 4期1　材料与方法111　材料11111　菌株和质粒 　大肠杆菌 BL21 (DE3)由本室保藏、质粒 pET22b ( + )购自 Novagen公司、tTF /pSK( + )质粒由美国南加州大学 Ep stein教授惠赠。11112　工具酶及试剂 　工具酶购自 NEB 公司 ,DNA纯化试剂盒为 OMEGA公司产品 , DNA序列分析由上海博亚公司完成。鼠抗 6 ×H is mAb和 HRP标记的羊抗鼠 IgG购自上海生工公司 , S2222为上海申海生化科技公司生产 ,αvβ3、FⅦ和 FⅩ购自Sigma。11113　引物 　由上海生工合成。根据 tTF cDNA序列设计扩增 tTF的引物 P1 (上游引物 ) : TCTGGCAC2TACAAATACTGTGGC和 P2 (下游引物 ) : TTCTCT2GAATTCCCCTTTCTCC。根据文献 [ 9 ]设计含有RGD 24C的引物 P3: CATACCATGGGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCATGGCCCTGGTGCCTCGTGGTTCTGGCACTACAAATAC (其中划线部分为 RGD24C序列 ,波浪线部分为 tTF 5′端序列 )。根据 RGD /tTF序列设计扩增 RGD / tTF的引物 P4: CATACCAT2GGGCTGCGATTGTC 和 P5: CTACCTCGAGTTCTCT2GAATTCCCCTTTCTCC,分别引入内切酶位点 Nco Ⅰ和 Xho Ⅰ。112　方法11211　融合基因 RGD / tTF的构建 　以 tTF /pSK( + )为模板 , P1和 P2为引物 ,常规 PCR扩增 tTF基因。在 PCR反应体系中加入 tTF基因产物和引物 P3 (含 RGD24C) ,退火融合得到 RGD / tTF模板(94℃预变性 4分钟 , 94℃变性 30秒、72℃退火延伸1分钟 ,循环 5次 ) ;再加入引物 P4、P5扩增 RGD /tTF融合基因并在 5′和 3′端分别引入 Nco Ⅰ和 XhoⅠ内切酶位点 ( 94℃变性 30秒、56℃退火 30秒、72℃延伸 45秒 ,循环 30次 , 72℃延伸 5分钟 )。1%琼脂糖凝胶鉴定、DNA胶纯化试剂盒回收纯化目的片段。11212　重组质粒的构建及转化 　将纯化的 RGD /tTF PCR产物及载体 pET22b ( + )分别用 Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切 ,胶分离纯化回收 , T4 DNA连接酶于 16℃连接过夜 ,连接产物转化 E. coli BL21(DE3 ) , 以氨苄青霉素抗性初筛 , 挑单克隆用pET22b ( + )通用引物及 P4、P5分别进行菌液 PCR筛选 ,阳性克隆送上海博亚公司测序。11213　融合蛋白的表达及纯化 　挑含正确重组质粒 RGD / tTF /pET22b ( + )的单菌落 37℃培养过夜 ,按 1∶100稀释至 2YT中扩大培养后 ,通过不同的诱导时间和 IPTG浓度优化其表达条件。在扩大培养至 OD600 = 014～016时加 IPTG至终浓度 011 mmol/L诱导表达 6小时。由于 pET22b ( + )表达的 RGD /tTF融合蛋白 C端带有 6 ×H is标签 ,故目的蛋白纯化方案参照 Amersham Pharmacia B iotech公司的镍柱蛋白纯化操作手册。纯化后的蛋白进行 12%SDS2PAGE分析鉴定 ,并采用 0101 mol/L PBS透析复性。11214　融合蛋白 tTF部分的活性鉴定 　①凝血实验 :参照 Haubitz等 [ 10 ]凝血实验方法并稍作修改 ,用318%的柠檬酸钠处理新鲜小鼠血液 , 4 000 r/m in离心 ,留血浆。凝血板每孔加血浆 30μl,分别加系列浓度的 RGD / tTF 和终浓度为 1215 mmol/L 的CaCl2 ,设只加 RGD / tTF和只加 CaCl2 的空白对照 ,室温下记录从加入 CaCl2 至血浆开始出现不流动的时间。②FⅩ活化实验 : H ische等 [ 11 ]发现 , TF2FⅦa复合物活化 FⅩ可以使 S2222 (多肽对硝基苯胺复合物 )分解为多肽和对硝基苯胺 ,后者在 405 nm有吸收峰 ,测吸光度可间接反映 TF水平。所以用 FⅩ活化实验进一步鉴定融合蛋白 tTF部分的活性及其水平 [ 3 ]。在 Tris缓冲液中加系列浓度的 RGD / tTF或 BSA ,加 100 nmol/L FⅦ, 37℃温育 10分钟 ,加 FⅩ至终浓度 5 nmol/L ,室温温育 10分钟 ,加入 100mmol/L EDTA 终止反应 , 加 2 nmol/L 生色底物S2222,在 3分钟之内用酶标仪测 OD405 nm。11215　RGD / tTF与αvβ3 特异性结合实验 　RGD /tTF融合蛋白 C末端带 6 ×H is标签 ,参照 Kessler等 [ 12 ]方法用间接 EL ISA分析 RGD / tTF与 αvβ3 相结合的特异性。96孔板包被αvβ3 (5μg /m l, 50μl /孔 ) 4℃过夜 , 10%羊血清封闭 ,分别加入倍比稀释的 RGD / tTF ( 6125～200μg/m l) ,相应浓度的 tTF /H is做对照 ,于 4℃过夜。加入鼠抗 6 ×H is mAb,37℃温育 1小时 ,再加入 HRP标记的羊抗鼠 IgG,37℃温育 30分钟 , TMD显色后加 1 mol/L H2 SO4 终止反应 ,测定 OD405 nm值。每步骤间用 PBST洗 5次 ,每次 3分钟。2　结果211　PCR扩增 RGD / tTF　以质粒 tTF /pSK ( + )为模板 PCR扩增获得大小为 657 bp 的 tTF,再与含RGD24C的引物 P3退火融合 ,得到 RGD / tTF模板 ,经 PCR扩增获得 RGD / tTF产物 , 1%琼脂糖凝胶电泳分析 ,在 717 bp处见单一条带 ,其大小与理论计算值相一致 ,见图 1。·823· 中国免疫学杂志 2006年第 22卷212　重组质粒的鉴定 　氨苄青霉素抗性初筛 ,菌液PCR阳性克隆送上海博亚公司测序 ,结果经核苷酸序列和蛋白编码分析获得一正确重组质粒克隆。213　融合基因 RGD / tTF在 E. coli BL21 (DE3)中的表达 　含有 RGD / tTF /pET22b ( + )的 E. coli BL21(DE3)扩大培养后 ,一系列诱导剂浓度诱导表达 ,发现终浓度达 011 mmol/L以后再增加 IPTG浓度不能明显增加目的蛋白表达量 ,见图 2。 011 mmol/LIPTG于 37℃诱导 6小时为最佳 ,更长时间不能明显增加目的蛋白量。12% SDS2PAGE分析显示在相对分子质量大小约 35 000处有一特异条带 ,与报道相一致 ,且目的蛋白主要以包含体形式存在 ,见图 3。214　RGD / tTF活性鉴定21411　凝血实验 　室温下从加入 CaCl2 到血浆开始出现不流动时的时间 ,见表 1。经柠檬酸钠处理过后的血浆在仅加 1215 mmol/L Ca2 +或 6μmol/LRGD / tTF时 30分钟内基本不凝 ;而在有与对照相同浓度的 Ca2 +存在时 , RGD / tTF能有效的促进血浆凝固 ,且随 RGD / tTF浓度的增加凝血时间缩短 ,表明 RGD / tTF具有促凝活性。21412　FⅩ活化实验 　分别测 0101、011、1和 10μmol/L融合蛋白和 BSA 在 F Ⅹ活化反应后的OD405 nm。结果融合蛋白在 1μmol/L以上时能有效活化 FⅩ而增强 405 nm处吸收峰 ,而同浓度的 BSA没反应 ,见图 4。21413　RGD / tTF与 αvβ3 特异性结合分析 　间接EL ISA检测 RGD / tTF与αvβ3 相结合的特异性。实验结果表明纯化复性后的 RGD / tTF与αvβ3 特异性结合程度与融合蛋白的剂量相关 ,但当到达饱和后结合程度基本不增加 ,而 tTF则不起反应 ,见图 5。图 1　RGD / tTF PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析F ig11　Ana lysis of PCR product by agarose gel electropho2resisNote: 11PCR p roduct of RGD / tTF (717 bp) ; 21PCR p roduct of tTF ( 657bp) ; 31DNA marker.图 2　 IPTG浓度梯度条件下融合蛋白表达的 SD S2PAGE分析F ig12　Ana lysis of expression of fusion prote in under IPTGinduction of d ifferen t concen tra tion s by SD S2PAGENote: 1261Fusion p rotein induced with IPTG 0, 0101, 0105, 011, 013 and015 mmol/L respectively.图 3　重组 RGD / tTF的 N i柱纯化产物 SD S2PAGE分析F ig13 　 Ana lysis of the product of pur if ica tion throughN ickel2aff in ity chroma tography column by SD S2PAGENote: 11Total soluble p rotein; 21Totle insoluble p rotein; 31Protein thatflowed off from the column; 4, 51Samp le washed from the columnwith B inding buffer; 6, 71Samp le washed from the column withW ash buffer; 81Samp le washed from the column with Elute buffer;91Protein marker.表 1　凝血时间Tab11　Coagula tion tim eConcentrationRGD / tTF (μmol/L) CaCl2 (mmol/L)Time(m in)0 0 > 300 1215 > 300175 1215 > 30115 1215 15153 1215 11166 1215 11156 0 > 30·923·杨桂旺等　用于肿瘤血管靶向治疗的 RGD / tTF融合蛋白的表达及活性鉴定　第 4期图 4　FⅩ活化实验图F ig14　FⅩ activa tion by RGD / tTF图 5　RGD / tTF与αvβ3 特异性结合实验F ig15　The b ind ing of RGD / tTF toαvβ33　讨论目前 ,用于诱发肿瘤组织血管栓塞靶向治疗的特异性载体不多 ,通常利用抗肿瘤血管标志物的抗体与 tTF构建融合蛋白 ,但这种方法弊端较多 ,如由于抗体的分子相对较大 ,容易造成空间位阻而影响tTF与 FⅦ和 FⅩ的结合能力 ,进而降低诱发肿瘤血管栓塞的效率。为了避免这些弊端 ,我们将特异性结合肿瘤血管内皮细胞膜标记物 ———整合素受体αvβ3 的小肽 RGD24C作为 tTF的特异性载体 ,利用基因工程技术成功获得 RGD / tTF /pET22 ( + )重组子 ,并在 E. coli BL21 (DE3)中高效表达。凝血实验中在有 Ca2 +存在时 ,融合蛋白促进血浆凝固 ; FⅩ活化实验敏感性高 ,为了避免内源性系统的干扰 ,我们采用商品化的 FⅦ和 FⅩ检测 RGD /tTF对 FⅩ的活化能力 ,结果显示融合蛋白 1μmol/L以上时能有效活化 FⅩ而增强 405 nm吸收峰 ,并且随着 RGD / tTF浓度的升高 RGD / tTF对 FⅩ的活化能力增强 ,这与报道相符 [ 13 ]。这说明复性后的融合蛋白能正确折叠 ,具有 TF相似的活化 FⅩ引起血液凝固的功能。RGD / tTF 与 αvβ3 结合实验表明 ,RGD / tTF能与 αvβ3 特异性结合 ,且结合程度与RGD / tTF浓度呈正相关。融合蛋白 RGD / tTF能特异性结合于肿瘤血管内皮细胞整合素受体αvβ3 ,且保留有 TF活化 FⅩ引起血液凝固的特性 ,为进一步研究其体内特异性诱发肿瘤组织血管栓塞的活性创造了条件。4　参考文献1　Sp icer E K, Horton R, B loem L et al. Isolation of cDNA clones codingfor human tissue factor: p rimary structure of the p rotein and cDNA[ J ]. Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84: 514825152.2　Davie E W , Fujikawa K, Kisiel W. The coagulation cascade: initia2tion, maintenance, and regulation [ J ]. B iochem istry, 1991; 30:10363210370.3　RufW , Rehem tulla A,Morrissey J H et al. Phospholip id2independentand 2dependent interactions required for tissue factor recep tor and co2factor function [ J ]. J B iol Chem, 1991; 266: 215822166.4　Krishnaswamy S, Field K A, Edgington T S et a l. Role of the mem2brane surface in the activation of human coagulation factor X [ J ]. JB iol Chem, 1992; 267: 26110226120.5　Huang X M,Molema G, King S et al. Tumor infarction in m ice by an2tibody2directed targeting of tissue factor to tumor vasculature [ J ]. Sci2ence, 1997; 275: 5472550.6　Zetter B R. On target with tumor blood vessel markers [ J ]. Nat B io2technol, 1997; 15: 124321244.7　Pasqualini R, Ruoslahti E. 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用于肿瘤血管靶向治疗的RGD/tTF融合蛋白的表达及活性鉴定

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