pBR322-Red Mediated Gene Knockin,Sites and Expression in E.coli Chromosome

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coliW 3110染色体lacZ,lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株:CWL2、CWL4和CWL6。荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达。为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1。证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中。结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达。Genes lacZ,lacY and lacA in the lac opron of E.coli chromosome were respectively substituted with gene luc by using plasmid pBR322-Red,selection-counterselection system kan/sacB and various strategies of Red homologous recombination including Red mediated linearized double-stranded DNA homologous recombination and Red mediated recombineering with overlapping single stranded DNA oligonucleotides.Then,a series of new strains,CWL2,CWL4 and CWL6,were constructed and we found that they can express protein Luc efficiently.To further study the expression of exogenous genes at the site of lacZ,we have constructed a strain named CWD1 by knockin the cholera toxin B subunit(ctxb) gene at the lacZ site,then we found that CWD1 can express protein CTB efficiently and CTB was secreted out of the cell.So we assured that the sites of structure genes in the lac operon of Escherichia coli chromosome were suitable for expressing foreign genes.军队“十五”医药卫生科学基金资助(编号:01MA089)~

关注手性药物:从“反应停事件”说起

自从20世纪60年代发生"反应停"事件以来,药物手性的研究在新药研发领域引起了极大关注。手性异构体在生物体中可能表现出截然不同的药理、药物动力学、代谢和毒理活性等。近年来结合手性光谱的手性高效液相色谱(HPLC)技术在手性药物的分析、测定和分离等方面得到广泛应用,这对于手性药物对映体含量的检测和质量控制至关重要。国家自然科学基金(21571070,21273175,51772289)国家基础科学人才培养基金(J1310024)广东省自然科学基金(2018A030313193)广州市科学研究计划重点项目专题(201804020019

中国物理海洋学研究70年：发展历程、学术成就概览

本文概略评述新中国成立70年来物理海洋学各分支研究领域的发展历程和若干学术成就。中国物理海洋学研究起步于海浪、潮汐、近海环流与水团,以及以风暴潮为主的海洋气象灾害的研究。随着国力的增强,研究领域不断拓展,涌现了大量具有广泛影响力的研究成果,其中包括:提出了被国际广泛采用的"普遍风浪谱"和"涌浪谱",发展了第三代海浪数值模式;提出了"准调和分析方法"和"潮汐潮流永久预报"等潮汐潮流的分析和预报方法;发现并命名了"棉兰老潜流",揭示了东海黑潮的多核结构及其多尺度变异机理等,系统描述了太平洋西边界流系;提出了印度尼西亚贯穿流的南海分支(或称南海贯穿流);不断完善了中国近海陆架环流系统,在南海环流、黑潮及其分支、台湾暖流、闽浙沿岸流、黄海冷水团环流、黄海暖流、渤海环流,以及陆架波方面均取得了深刻的认识;从大气桥和海洋桥两个方面对太平洋–印度洋–大西洋洋际相互作用进行了系统的总结;发展了浅海水团的研究方法,基本摸清了中国近海水团的分布和消长特征与机制,在大洋和极地水团分布及运动研究方面也做出了重要贡献;阐明了南海中尺度涡的宏观特征和生成机制,揭示了中尺度涡的三维结构,定量评估了其全球物质与能量输运能力;基本摸清了中国近海海洋锋的空间分布和季节变化特征,提出了地形、正压不稳定和斜压不稳定等锋面动力学机制;构建了"南海内波潜标观测网",实现了对内波生成–演变–消亡全过程机理的系统认识;发展了湍流的剪切不稳定理论,提出了海流"边缘不稳定"的概念,开发了海洋湍流模式,提出了湍流混合参数化的新方法等;在海洋内部混合机制和能量来源方面取得了新的认识,并阐述了混合对海洋深层环流、营养物质输运等过程的影响;研发了全球浪–潮–流耦合模式,推出一系列海洋与气候模式;发展了可同化主要海洋观测数据的海洋数据同化系统和用于ENSO预报的耦合同化系统;建立了达到国际水准的非地转(水槽/水池)和地转(旋转平台)物理模型实验平台;发展了ENSO预报的误差分析方法,建立了海洋和气候系统年代际变化的理论体系,揭示了中深层海洋对全球气候变化的响应;初步建成了中国近海海洋观测网;持续开展南北极调查研究;建立了台风、风暴潮、巨浪和海啸的业务化预报系统,为中国气象减灾提供保障;突破了国外的海洋技术封锁,研发了万米水深的深水水听器和海洋光学特性系列测量仪器;建立了溢油、危险化学品漂移扩散等预测模型,为伴随海洋资源开发所带来的风险事故的应急处理和预警预报提供科学支撑。文中引用的大量学术成果文献(每位第一作者优选不超过3篇)显示,经过70年的发展,中国物理海洋学研究培养了一支实力雄厚的科研队伍,这是最宝贵的成果。这支队伍必将成为中国物理海洋学研究攀登新高峰的主力军

长碳链二元酸酯的合成及其物化性能

以杂多酸为催化剂、不同链长的二元酸为原料,合成了系列长碳链二元酸二元酯,考察了影响合成反应的因素及碳链长度对合成酯物化性能的影响.结果表明,在回流温度160℃、醇/酸摩尔比3:1、催化剂用量为总质量1%、反应时间120 min、带水剂用量为总质量10%的条件下,酯化率达98%以上.合成的酯具有良好的物化性能,其倾点最低为-74℃,闪点最高为258℃,粘度指数最大为187,优于现有商业化酯类润滑油基础油,达到现有航空润滑油基础油的标准.随着碳链增长,合成酯粘度增大,增加醇碳链长度对粘度的影响大于增加酸碳链长度的影响

Reconstruction of plasmid DNA with Red-mediated homologous recombination combined with restriction digestion

目的:用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变。方法:用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322Red)宿主菌,利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至N基因长约2100bp的DNA序列,并用kilN序列中含有的单一酶切位点XhoⅠ对混合质粒进行酶切,取酶切产物转化W3110感受态细胞,菌落PCR方法筛选重组阳性克隆。结果:在没有任何筛选标记的情况下,用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆。结论:该方法操作简单、精确,能够避免引入新突变,为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法。Objective:To precisely delete a 2 100 bp DNA sequence in pBR322-Red plasmid using Red mediated single-stranded oligonucleotides in vivo homologous recombination combined with restriction digestion strategy.Methods:A single-stranded oligonucleotides DNA target cassette was introduced into W3110(pBR322-Red) host strain by electroporation,a 2 100 bp DNA fragment from kil to N gene that contains a unique XhoI site in pBR322-Red plasmid was deleted by Red mediated in vivo homologous recombination. The recombinant plasmid DNA was screened from the plasmid DNA mixture with XhoⅠ restriction endonuclease digestion,and retransformed into W3110 competent cells. The positive clones were further (identified) by colony PCR assay.Results: One positive clone out of ten clones was successfully identified without any selectable marker. Conclusion:This new method of DNA sequence deletion mutation is simple and accurate. It could avoid new mutation in PCR process of traditional DNA manipulation method.军队“十五”医药卫生科学基金(01MA089

长碳链二元酸酯的合成及其物化性能

以杂多酸为催化剂、不同链长的二元酸为原料,合成了系列长碳链二元酸二元酯,考察了影响合成反应的因素及碳链长度对合成酯物化性能的影响.结果表明,在回流温度160℃、醇/酸摩尔比3:1、催化剂用量为总质量1%、反应时间120 min、带水剂用量为总质量10%的条件下,酯化率达98%以上.合成的酯具有良好的物化性能,其倾点最低为-74℃,闪点最高为258℃,粘度指数最大为187,优于现有商业化酯类润滑油基础油,达到现有航空润滑油基础油的标准.随着碳链增长,合成酯粘度增大,增加醇碳链长度对粘度的影响大于增加酸碳链长度的影响

Gene Knockout and Knockin on the Escherichia coli lac Operon Loci Using pBR322-Red System

pBR32 2 - Red是一种新型重组工程系统 ,它携带了λ 噬菌体Red重组酶基因和一系列调控元件。对pBR32 2 Red最优重组条件进行探索后应用该质粒提供的体内同源重组功能 ,在菌株W3110体内 ,对染色体上的lac操纵子进行了基因修饰 ,包括 :①运用kan- sacB选择反选择方法和重叠引物方法敲除了阻遏基因lacI,②运用kan -sacB选择反选择方法和线性双链DNA介导的DNA重组方法将报告基因lacZ敲入lacA和lacY的位置 ,并且首次测定了报告基因lacZ在这三个结构基因位置的组成性表达情况。结果表明运用不同的重组策略 ,pBR32 2- Red系统都能方便有效地对大肠杆菌W3110染色体进行基因敲除和敲入修饰。pBR322-Red is a newly constructed recombineering plasmid, which contains a part of the pBR322 vector,a series of regulatory elements of λ-prophage and Red recombination genes. In the beginning, we studied the best working conditions of pBR322-Red,and then modified lac operon in E. coli W3110 chromosome using the plasmid as follow: Firstly, we knockout the lacI gene using Red-mediated recombineering with overlapping single stranded DNA oligonucleotides. Secondly, we substituded the lacA and lacY genes with lacZ, a report gene, by Red-mediated linearized double strands DNA homologous recombination. Finally, we detected the expression of lacZ on these loci for the first time. The results suggested that pBR322-Red system is suitable for modifying W3110 chromosome with various recombination strategies.军队“十五”医药卫生科学基金资助 (No .0 1MA0 89)~

The Construction of a New Mobile Recombineering System of pYM-Red

重组工程是近几年发展的新型遗传工程技术. 以PCR扩增的线性低拷贝质粒pACYC184为载体,用Gap-repair方法从大肠杆菌DY330染色体上直接体内亚克隆了包括Red重组酶基因在内的长约6.7 kb的基因序列,构建了pYM-Red重组质粒. 在宿主菌W3110体内进行了染色体上galk基因的敲除,验证了Red重组酶的生物功能,并确定了影响pYM-Red重组效率的诱导时间和线性DNA 片段用量. 在42℃诱导10 min和线性DNA打靶分子浓度为300 ng时,pYM-Red的重组效率可达到大约每4 000个电转存活细胞中有1个重组阳性克隆,分别比pKD46和pBR322-Red系统高5~6倍.Recombineering is a new developed genetic engineering technology in the past few years. A new recombineering system named pYM-Red was constructed by gap-repair, that is a technology called in vivo cloning. Linear PCR fragments that amplified from low copy plasmid pACYC184 were used as gene targeting vector. The length of subcloned DNA sequence including Red gene and a series regulatory sequences are about 6.7 kb. The biology function of Red gene in pYM-Red was tested by gene replacement (galkkan) of W3110 chromosome. Factors that effect recombination efficiency were precisely confirmed. When induced 10 min at 42℃ and using 300 ng linear DNA fragment as targeting molecules, the efficiency of pYM-Red mediated recombination can reach one positive recombination clone per four thousands electroporation survived cells, it is 5~6 folds higher than pBR322-Red and pKD46 recombination system.军队“十五”医药卫生科学基金( 01MA 089).~

Comparison of metabolome extraction strategies from Paralia sulate

代谢组学技术已被广泛应用于环境科学、生物医学、营养学等众多研究领域。以海洋环境指示物种具槽帕拉藻（Paralia sulate）为研究对象,采用两种细胞破碎方式和三种溶剂系统对均一生物样本的代谢物进行提取,结合核磁共振（Nuclear magnetic resonance,NMR）波谱分析和主成分分析（Principal components analysis,PCA）,对不同的代谢物提取系统进行了评估。结果表明：甲醇/水（1∶1）与匀浆相结合的方法具有高提取产率、高重现性、易操作和速度快等特性,是适合具槽帕拉藻代谢物提取的方法,可为后续代谢途径的研究提供参考