In vitro modell a csapfejlődésben szerepet játszó faktorok tanulmányozására = In vitro model to study retinal cone photoreceptor differentiation

Az emlősök többségének retinájában kétféle csapot találunk, az egyik a kék- (S-csap), míg a másik a zöld, vagy a vörös fényre érzékeny (M/L-csap). E két csaptípus nem egymástól függetlenül fejlődik. Mindegyik csap először S-opszint expresszál, többségük azonban később átáll az M/L-pigment termelésére. Keveset tudunk arról, mely faktorok vehetnek részt a pigment váltás szabályozásában. A pályázatban bemutattunk egy új, in vitro organotipikus retinatenyésztésen alapuló módszert, amely több fajon is lehetővé teszi a transzdifferenciáció tanulmányozását. Az általunk használt kontrol médiumban az M/L-csapok minden esetben kifejlődtek, a kiültetés idejétől függetlenül. Az M/L-csapok elköteleződése a 4. nap (P4) előtt végbemegy, különbséget tápjaink között csak korábbi kiültetések esetén találtunk. Szérum hozzáadása egyedül képes volt biztosítani a differenciációhoz szükséges összes faktort megfelelő koncentrációban P1-P4 retinák esetében. Szérummentes közegben a pajzsmirigyhormon egyedül elégséges patkány M/L-csapjainak kifejlődéséhez, de csak megfelelő mennyiségű E-vitamin hozzáadása mellett biztosítja a fejlődést szíriai aranyhörcsögben. Eredményeink bizonyítják, hogy a technika használható a csapfejlődésre ható szolubilis faktorok szerepének tanulmányozására. Bizonyítottuk, hogy a pajzsmirigyhormon minden vizsgált fajban szükséges az M/L-csapok elköteleződéséhez, de eredményeink szerint más faktoroknak is fontos szerepe lehet, legalábbis a fajok egy részében. | The retina of most mammalian species contains two types of cones, one sensitive to shorter- (S-), and another to the middle- or long wavelengths (M/L-cones). These populations do not develop independently. All cones first express S-opsin only, but most of them switch to M/L-opsin production. Despite intensive studies, little is known about the factors influencing pigment switch. Hereby, we report a new model, in vitro organotypic retinal culture, to study these factors in tree species of mammals. All retinas fully differentiate in vitro, in control medium, independently of the time of explantation. Commitment for M/L-opsin expression is completed by P4: only in retinas explanted before, did we detect any difference in development. Serum supplementation alone, was sufficient to induce M/L-cone differentiation in cultures explanted prior to P4, indicating that it contains all the factors necessary. In serum free conditions, thyroid hormone was enough to induce transdifferentiation in the rat, whereas in the Syrian hamster, vitamin-E was also needed. These results prove that retinal culturing is a reliable tool to study the effect of soluble factors in retinal differentiation. In all species studied, thyroid hormone seems to be necessary for M/L-cone development, but other factors like vitamin-E could also play additional roles, indicating that development may be controlled by different mechanisms in different species

The Retinal TNAP

Accumulating evidence from recent literature underline the important roles of tissue non specific alkaline phosphatase (TNAP) in diverse functions as well as diseases of the nervous system. Exploration of TNAP in well characterized neural circuits such as the retina, might significantly advance our understanding regarding neural TNAP’s roles. This chapter reviews the scarce literature as well as our findings on retinal TNAP. We found that retinal TNAP activity was preserved and followed diverse patterns throughout vertebrate evolution. We have consistently observed TNAP activity (1) in retinal vessels, (2) in photoreceptors and (3) in the majority of the studied species in the outer (OPL) and inner plexiform layers (IPL), where synaptic transmission occurs. Importantly, in some species the IPL exhibits several TNAP positive strata. These strata exactly corresponded those seen after quadruple immunohistochemistry with four canonical IPL markers (tyrosine hydroxylase, choline acetyltransferase, calretinin, protein kinase C α). Diabetes results in diminishing retinal TNAP activity before changes in canonical markers

A fotoreceptor-fejlődés sejt- és molekuláris biológiája = Cell and molecular biology of photoreceptor development

Az opszinváltás szabályozása fajonként eltérő, tiroxin és TRbéta2 nélkülözhetetlen a zöld csapfejlődéshez. A receptormegoszlás időbeli és térbeli mintázatával igazoltuk a tiroxint mediáló TRbéta2 szerepét. Tenyésztő módszerünkkel a fotoreceptor-differenciálódás szérummentes környezetben is végbemegy, a világon először definitív médiumban vizsgálható. Más faktorok (A- és E-vitamin, BDNF) is hatnak a pigment-expresszióra. Szelektív neurotrophin antagonisták az opszin és a TrkB receptor kapcsoltságára utalnak. Az erythropoietin retinális expressziója HIF1-α szabályozás alatt áll és időben változik a fejlődés korai szakaszában. Szemnyitás után a retinában lecsökken a transzdukciós molekulák szintje, kivéve a fotoreceptorokat. A sejttestben szintetizálódnak, közös lipid rafton kerülnek a kültagba és játszanak szerepet a fejlődésben. Az STK38L gén homozigóta mutációja befolyásolja a fotoreceptor-fejlődést. Sejthalál és proliferáció egyaránt jelen van. Hibrid sejtek jelennek meg pálcika-, kisebb mértékben S-opszin termeléssel. A differenciált, mutáns sejtek a degenerációs gén hatására megőrzik osztódóképességüket. A melatonin éjszaka termelődik, éjjeli világítás a hormontermelés gátlásával patológiás folyamatokat (emlő és colorectalis carcinoma) okozhat. A pineális szerv emlősben elvesztette fotoreceptor működését és szimpatikus rostokon a retinából kap információt. Mivel a pineális melatoninképzést rövidhullámú fény gátolja, éjjeli műszakban hosszúhullámú megvilágítást kell használni. | Regulation of opsin-switch varies across species. Thyroxin and TRß2 receptor is essential for green cone development. Spatial and temporal receptor distribution proved the role of TRß2 mediating thyroxin. Photoreceptor differentiation is completed in our culture method in serum-free medium, allowing its examination in a definitive paradigm. Other factors such as Vitamins A and E, BDNF) also influence visual pigment expression. Selective neurotrophin antagonists reveal the close connection of opsin and Trkß. Retinal expression of erythropoietin is under the regulation of HIF1-α, and changes during development. Transduction molecule levels decrease after eye opening, except for photoreceptors. They are synthesized in the cell body, located and transported in the outer segment on common lipid rafts and play a developmental role. Homozygotic mutation of STK38L influences photoreceptor development. Cell death and proliferation are equally present. Hybrid photoreceptors appear that express rod and, to a lesser extent, S-opsin. The degenerated, hybrid mutants retain their capacity to divide. Melatonin is produced at night. Nocturnal light exposition inhibiting hormone production may generate pathological processes (e.g.: carcinomas). The pineal organ in mammals has lost its photoreceptor function and receives information from the retina via sympathetic fibers. Since short wave light inhibits melatonin production, long-wave illumination is recommended during night-shift

Fényérzékeny molekulák és fotoreceptorok a gerincesek retinájában és tobozmirigyében = Photosensitive molecules and photoreceptors in the vertebrate retina and pineal gland

Míg az emlősök legtöbbjében, amelyekben legalább kétféle színérzékenységű fotoreceptor található, kimutatható a transzdifferenciáció, vagyis a rövidhullám-érzékeny (kék) csapok korai megjelenése, és ezek egy részében a középhullám-érzékeny (zöld) pigment későbbi expressziója. Az eredeti kék pigment eltűnése eredményezi a definitív zöld csapokat, míg azok, amelyekben a zöld pigment egyáltalán nem jelenik meg, adják a kék csap-populációt. Elvetettük a hipotézist, hogy a monokromatikus fajokan is a kék-pigment expresszióján keresztül vezet az út. Felnőttben is előfordulnak két pigmentet tartalmazó csapok. A transzdifferenciáció (csap-fejlődés) nem áll meg újszülött korban, hanem folytatódik felnőttben is. Ezek idegi őssejtek, amelyek a retina regenerációjában játszhatnak szerepet (anti-PCNA). A csapok differenciálódásában közrejátszó tényezők közül a BDNF, az NT-3 és a TrkB szerepet játszanak a kék-zöld átalakulásban. Tenyésztés és immuncitokémia bizonyítja, hogy a kék csapok fejlődéséhez elegendő a megfelelő feltételek fennállása. A zöld csapok megjelenéséhez azonban az említett tényezők is szükségesek. A nem-vizuális fotoreceptorok feladata a diurnális ritmus beállítása. A bennük lévő cryptochromok kék-érzékenyek. Az ékszakai megvilágítás patológiás hatásait (emlőrák, colorectalis tumorok, stb.) a pineális melatonin gátlása okozza. Ezek redukálhatók kék fény-mentes megvilágítással, azaz megfelelő színszűrők használatával. | In mammals that possess two color-specific photoreceptors, transdifferentiation is present. That means the early appearance of short wave (blue) cones and the later expression of middle wave (green) pigment in some of them. The disappearance of the original blue pigment results in the development of definitive green cones. Those in which no green pigment appears at all will make the blue cone population. The hypothesis that in monochromatic species green cones come about through the transitory appearance of blue pigment has been rejected. Dual cones expressing two visual pigments occur also in adults. Obviously, the transdifferentiation does not come to an end in the early postnatal period, rather it goes on in the adulthood. These might be neuronal stem cells playing a role in the regeneration of the retina (anti-PCNA). Of the factors having a role in the cone differentiation, BDNF, NT-3 and TrkB seem to be effective in the blue-green transition. Immunocytochemistry and tissue culture prove that proper culture technique is enough for the development of blue cones, however the above factors are indispensable for the green cones. Non-visual photoreceptors play a role in the entrainment of the diurnal clock. Their cryptochromes proved to be blue-sensitive. The pathologic effects of night work are attributed to the inhibition of pineal melatonin. The adverse reactions might be reduced with blue light-free illumination, with proper color filters

Distribution of caveolin isoforms in the lemur retina

The distribution of caveolin isoforms was previously evaluated in the retinas of different species, but has not yet been described in the primate retina. In this study, the distribution of caveolins was assessed via immunochemistry using isoform-specific antibodies in the retina of the black-and-white ruffed lemur. Here, we report the presence of a variety of caveolin isoforms in many layers of the lemur retina. As normal human retinas were not available for research and the retinas of primates are fairly similar to those of humans, the lemur retina can be utilized as a model for caveolin distribution in normal humans

Muscle Fiber Viability, a Novel Method for the Fast Detection of Ischemic Muscle Injury in Rats

Acute lower extremity ischemia is a limb- and life-threatening clinical problem. Rapid detection of the degree of injury is crucial, however at present there are no exact diagnostic tests available to achieve this purpose. Our goal was to examine a novel technique - which has the potential to accurately assess the degree of ischemic muscle injury within a short period of time - in a clinically relevant rodent model. Male Wistar rats were exposed to 4, 6, 8 and 9 hours of bilateral lower limb ischemia induced by the occlusion of the infrarenal aorta. Additional animals underwent 8 and 9 hours of ischemia followed by 2 hours of reperfusion to examine the effects of revascularization. Muscle samples were collected from the left anterior tibial muscle for viability assessment. The degree of muscle damage (muscle fiber viability) was assessed by morphometric evaluation of NADH-tetrazolium reductase reaction on frozen sections. Right hind limbs were perfusion-fixed with paraformaldehyde and glutaraldehyde for light and electron microscopic examinations. Muscle fiber viability decreased progressively over the time of ischemia, with significant differences found between the consecutive times. High correlation was detected between the length of ischemia and the values of muscle fiber viability. After reperfusion, viability showed significant reduction in the 8-hour-ischemia and 2-hour-reperfusion group compared to the 8-hour-ischemia-only group, and decreased further after 9 hours of ischemia and 2 hours of reperfusion. Light- and electron microscopic findings correlated strongly with the values of muscle fiber viability: lesser viability values represented higher degree of ultrastructural injury while similar viability results corresponded to similar morphological injury. Muscle fiber viability was capable of accurately determining the degree of muscle injury in our rat model. Our method might therefore be useful in clinical settings in the diagnostics of acute ischemic muscle injury

Immunocytochemical analysis of misplaced rhodopsin-positive cells in the developing rodent retina.

During the first postnatal weeks of the developing rodent retina, rhodopsin can be detected in a number of neuron-like cells in the inner retina. In the present study, we aim to characterize the morphology, number and staining characteristics of this peculiar population. Misplaced rhodopsin-positive cells (MRCs) were analyzed on retinas of four rodent species, labeled with various rhodopsin-specific antibodies. To investigate their possible relation with non-photoreceptor cells, sections were double-stained against distinct retinal cell types and proteins of the phototransduction cascade. The possibility of synapse formation and apoptosis were also investigated. In all species studied, misplaced cells comprised a few percent of all rhodopsin-positive elements. This ratio declined from the end of the second week and MRCs disappeared nearly completely from the retina by P24. MRCs resembled resident neurons of the inner retina, while outer segment-like processes were seen only rarely. MRCs expressed no other photopigment types and showed no colocalization with any of the bipolar, horizontal, amacrine and ganglion cell markers used. While all MRCs colabeled for arrestin and recoverin, other proteins of the phototransduction cascade were only detectable in a minority of the population. Only a few MRCs were shown to form synaptic-like endings. Our results showed that, during development, some rhodopsin- expressing cells are displaced to the inner retinal layers. Although most MRCs lack morphological features of photoreceptors, they contain some but not all, elements of the phototransduction cascade, indicating that they are most probably misplaced rods that failed to complete differentiation and integrate into the photoreceptor mosaic