Il "targeting" del sindecano-1, molecola coinvolta nel processo di "vasculogenic mimicry", potenzia l' efficacia terapeutica dell' immunocitochina L19-IL2 in un modello sperimentale murino di melanoma umano.

La terapia anti-angiogenica nei tumori solidi finora non ha condotto ai benefici clinici desiderati, probabilmente a causa della complessità del processo neo-angiogenico, uno dei meccanismi che sta alla base della crescita dei tumori solidi. Un ruolo importante è svolto dalla “vasculogenic” o “vascular” mimicry (VM), un fenomeno in cui le cellule tumorali più aggressive sono in grado di formare una rete vascolare alternativa, indipendente dal processo di neo-angiogenesi che coinvolge le cellule endoteliali. In questo studio abbiamo osservato che in linee cellulari di melanoma umano con fenotipo vascolare e caratteristiche di staminalità e in tumori di melanoma umano si ha la co-espressione del sindecano-1 con marcatori di VM, come le molecole CD144 e VEGFR-2. Abbiamo dimostrato tramite esperimenti in vitro che utilizzando l’ anticorpo ricombinante umano OC-46F2, specifico per il sindecano-1, le cellule di melanoma umano perdono la loro capacità di formare strutture tubulari simil-vascolari. E’ stato inoltre osservato che in un modello sperimentale di melanoma umano indotto in topi NOD-SCID la terapia combinata, utilizzando l’ anticorpo umano ricombinante OC-46F2 e l’ immunocitochina L19-IL2, specifica per l’ isoforma EDB della fibronettina (B-FN), ha avuto come effetto la completa inibizione della crescita tumorale nel 71% dei topi trattati fino al giorno 90 dall'impianto del tumore con differenze statisticamente significative rispetto ai gruppi trattati con OC-46F2 o L19-IL2 come monoterapia. Inoltre, nei tumori espiantati da topi trattati con OC-46F2 come monoterapia o in combinazione con L19-IL2, abbiamo osservato una drastica diminuzione della densità vascolare e la perdita di strutture tubulari simil-vascolari. Questi risultati per la prima volta conferiscono al sindecano-1 un ruolo nella “vasular mimicry” del melanoma e indicano che il “targeting” del sindecano-1 combinato alla B-FN potrebbe essere una terapia molto promettente per migliorare il trattamento del melanoma metastatico umano. Anti-angiogenic therapy of solid tumors has until now failed to produce the long lasting clinical benefits desired, possibly due to the complexity of the neoangiogenic process. Indeed, a prominent role is played by “vasculogenic” or “vascular” mimicry (VM), a phenomenon in which aggressive cancer cells form an alternative microvascular circulation, independently of endothelial cell angiogenesis. In this study we observed, in melanoma patient cell lines having vasculogenic/stem-cell like phenotype and in melanoma tumors, the syndecan-1 co-expression with VM markers, such as CD144 and VEGFR-2. We show that melanoma cells lose their ability to form tubule-like structures in vitro after blocking syndecan-1 activity by the specific human recombinant antibody, OC-46F2. Moreover, in a human melanoma xenograft model, the combined therapy using OC-46F2 and L19-IL2, an immunocytokine specific for the tumor angiogenic-associated B-fibronectin isoform, led to a complete inhibition of tumor growth until day 90 from tumor implantation in 71% of treated mice, with statistically significant differences compared to groups treated with OC-46F2 or L19-IL2 as monotherapy. Furthermore, in the tumors recovered from mice treated with OC-46F2 either as monotherapy or in combination with L19-IL2, we observed a dramatic decrease of vascular density and loss of VM structures. These findings indicate for the first time a role of syndecan-1 in melanoma VM and that targeting syndecan-1, together with B-FN, could be promising in improving the treatment of metastatic melanoma

Sviluppo di una micro CT con sorgente Quasi-Monocromatica Multi-Energy per lo studio in vivo della crescita e della metastasi tumorale

Un innovativo micro scanner CT per piccolo animali – basato su di una sorgente che genera una coppia di fasci X Quasi-Monocromatici paralleli con diverse energie selezionabili – è in corso di installazione e caratterizzazione al Dipartimento di Fisica dell’Università di Bologna. Lo scopo della ricerca è quello di effettuare l’imaging radiologico in vivo del tessuto tumorale e/o dei pattern di neo-angiogenesi in una fase diagnostica precoce realizzando la separazione del tessuto patologico da quello sano per mezzo della tecnica multi-energy che consiste nell’utilizzo di due o più fasci di raggi X quasi-monocromatici in sostituzione dell’unico fascio policromatico utilizzato nella radiologia convenzionale. Lo strumento consentirà inoltre lo studio, sui topi, della crescita tumorale e della formazione delle metastasi per differenti tipologie di tumore. Per la diagnosi precoce del tumore è essenziale essere in grado di rivelare i cambiamenti tissutali precancerosi, come la neo-angiogenesi. Si tratta di un meccanismo che si verifica in una fase iniziale dello sviluppo della patologia ed è dovuto alla produzione di molecole che stimolano la creazione di nuovi vasi sanguigni per alimentare la crescita delle cellule cancerose. Come dimostrato in precedenti studi di fattibilità [1], un sistema di imaging basato su due fasci di raggi X quasi-monocromatici di differenti energie fornisce maggiore sensibilità nella rivelazione di basse concentrazioni di mezzo di contrasto iodato rispetto ai tradizionali apparati RX con fascio policromatico. La K-edge dual energy radiology è una tecnologia potenzialmente in grado di rivelare il processo di neo-angiogenesi tumorale in uno stadio precoce quando la strumentazione convenzionale non dispone di sufficiente sensibilità. Inoltre, la possibilità di selezionare le energie dei fasci quasi-monocromatici consente l’applicazione della Multi-Energy Quasi-MonochromaticRadiology: selezionando opportunamente le energie è possibile esaltare le differenze fra i coefficienti di attenuazione lineare del tessuto patologico rispetto a quello sano aumentando il contrasto della patologia. Infatti, la tecnica multi-energy consente di ricostruire il numero atomico efficace e persino la composizione chimica del tessuto irradiato. Tuttavia, per ottenere questo risultato, si dovrebbero conoscere le bande di energia in cui l’assorbimento dei raggi X da parte del tessuto tumorale eventualmente differisce significativamente da quello dei tessuti sani. Per questo motivo è stata iniziata una sistematica caratterizzazione radiologica di molti tipi di tessuti sani e neoplastici, murini e umani allo scopo di costituire un catalogo delle finestre di energia in cui sarà possibile applicare la metodica multi-energy

Skin perfusion of hands is associated with parasympathetic activity in systemic sclerosis

Changes in the activity or responsiveness of neuroendothelial mecha-nisms may trigger vascular injury with im-balance of angiogenesi

A potential diagnostic biomarker: Proteasome LMP2/b1i-differential expression in human uterus neoplasm

Uterine leiomyosarcoma (ULMS) develops more often in the muscle tissue layer of the uterine body than in the uterine cervix. The development of gynecologic tumors is often correlated with female hormone secretion; however, the development of uterine ULMS is not substantially correlated with hormonal conditions, and the risk factors are not yet known. Importantly, a diagnostic-biomarker which distinguishes malignant ULMS from benign tumor leiomyoma (LMA) is yet to be established. Accordingly, it is necessary to analyze risk factors associated with uterine ULMS, to establish a treatment method. Proteasome low-molecular mass polypeptide 2(LMP2)/b1i-deficient mice spontaneously develop uterine LMS, with a disease prevalence of ~40% by 14 months of age. We found LMP2/b1i expression to be absent in human LMS, but present in human LMA. Therefore, defective-LMP2/b1i expression may be one of the risk factors for ULMS. LMP2/b1i is a potential diagnostic-biomarker for uterine ULMS, and may be a targeted-molecule for a new therapeutic approach

Livelli sierici di fattori pro-angiogenici e angiostatici nella sclerosi sistemica

La sclerodermia o sclerosi sistemica progressiva (SSc) è una malattia cronica e progressiva del tessuto connettivo, ad eziologia multifattoriale e patogenesi autoimmune, caratterizzata da alterazioni del sistema immunitario, disfunzione endoteliale e progressivo accumulo di tessuto fibroso a carico della cute e degli organi interni. Alterazioni funzionali e strutturali dei vasi con conseguente rimodellamento della parete endoteliale sono dimostrati già nelle fasi iniziali della SSc. Tali alterazioni sembrano essere responsabili dei cambiamenti del microcircolo con successiva perdita dei capillari e comparsa di aree avascolari. Studi sui fattori pro-angiogenici ed angiostatici in corso di SSc hanno spesso riportato risultati discordanti, in particolare quelli relativi ai dosaggi sierici di VEGF, FGF-2 ed endostatina. Lo scopo dello studio e’ quello di valutare in un ampio gruppo di pazienti con SSc i livelli circolanti di fattori pro-angiogenici (VEGF, FGF-2) ed angiostatici (Endostatina, TSP-1), di marcatori circolanti di disregolazione endoteliale (sICAM-1) ed il loro potenziale ruolo nella malattia. Abbiamo studiato 41 pazienti con SSc, caratterizzati dal punto di vista clinico, sierologico e strumentale. Nel siero di tali pazienti abbiamo dosato, mediante metodica immunoenzimatica, VEGF, FGF-2, endostatina, TSP-1 ed sICAM-1 e ne abbiamo confrontato i livelli con quelli dosati in 31 soggetti sani. Nel nostro studio i pazienti con SSc presentavano livelli dei fattori pro-angiogenici VEGF ed FGF-2 sovrapponibili a quelli dei controlli. Tra i fattori angiostatici abbiamo riscontrato nel siero dei pazienti con SSc livelli significativamente aumenti di endostatina ma non di TSP-1. I pazienti con SSc presentano livelli significativamente aumentati di sICAM-1 rispetto a quelli dei soggetti di controllo. All’ interno del gruppo dei pazienti con SSc non abbiamo riscontrato differenze significative di sICAM-1, ne’ di endostatina tra la forma diffusa e limitata. Nel nostro studio i livelli sierici di sICAM-1 correlano positivamente con i valori della VES e della PCR e i livelli di endostatina con la riduzione del complemento (C4). Dei 41 pazienti studiati 24 sono stati inoltre sottoposti ad indagine ultrasonografica transtoracica per quantificare la severità della fibrosi polmonare attraverso l’identificazione di comete ultrasoniche polmonari. Nel nostro studio il numero di comete correla positivamente con i valori di DLCO ed e’ significativamente ridotto nel gruppo ACA positivo rispetto al gruppo ACA negativo. In conclusione, nei pazienti con SSc abbiamo riscontrato un’ alterazione del fattore angiostatico endostatina e una disregolazione endoteliale. Inoltre da indagini strumentali non invasive quale l’ecografia transtoracica e’ stato possibile identificare una correlazione tra le comete ultrasonografiche e parametri di interstiziopatia polmonare (DLCO)

Modificazioni morfo-strutturali placentari nel ritardo di crescita asimmetrico idiopatico

Obiettivo: valutare le alterazioni dello sviluppo e della struttura dei villi coriali di placente di gravidanze con ritardo di crescita fetale asimmetrico idiopatico (IUGR) tardivo. Pazienti e metodi: sono state esaminate 45 placente di pazienti con IUGR idiopatico con parto, per via vaginale o addominale, espletato dal gennaio 2001 al dicembre 2007 . L'esame istologico è stato condotto secondo le linee guida del Gruppo Italiano di Anatomia Patologica. La diagnosi di IUGR è stata posta sulla base dell'evidenza clinica ed ultrasonica di ridotta crescita fetale e basso peso neonatale in associazione a riduzione del liquido amniotico e a placenta “matura” all'esame USG. Risultati: l'esame istologico ha evidenziato lesioni dello sviluppo e della struttura dei villi tipici della ipoperfusione cronica placentare così definite: maturazione accelerata dei villi (ipermaturità villare), villite ischemica (equivalente a microinfarti) ed infarti. In 10 casi, insieme a tali lesioni, ne è stata identificata un'altra , definita “ipercapillarizzazione dei villi”, che si associa ad una condizione di ipossia relativa del sangue materno che circola tra i villi. Conclusioni: il ritardo di crescita intrauterino asimmetrico idiopatico può essere ricondotto ad alterazioni dell'angiogenesi e vasculogenesi che avvengono nelle fasi iniziali della gravidanza. Ciò determina una condizione di ipossia placentare con alterazioni dello sviluppo dei villi tipici della ipoperfusione cronica placentare

VARIAZIONE DI MARKERS MOLECOLARI IN PAZIENTI CON ANEURISMA CEREBRALE

Titolo della tesi: Variazione di marker molecolari in pazienti con aneurisma cerebrale Introduzione. INTRODUZIONE L¡¯aneurisma ¨¨ una patologia dell¡¯apparato vascolare che si manifesta come una dilatazione abnorme di un vaso che pu¨° colpire qualsiasi vena o arteria del corpo. In particolare un aneurisma cerebrale ¨¨ localizzato nel punto di biforcazione delle arterie cerebrali che costituiscono il poligono di Willis; la sua insorgenza pu¨° dipendere da fattori congeniti o acquisiti. La prima manifestazione clinica, nella maggior parte dei casi ¨¨ rappresentata da un¡¯emorragia, dovuta alla rottura della parete dei vasi, a livello dello spazio subaracnoideo. Studi condotti su pazienti affetti da tale patologia hanno evidenziato la presenza di fenomeni infiammatori associati a variazioni di marker biologici specifici sia in campioni tissutali che plasmatici. La componente infiammatoria ¨¨ associata a fenomeni di rimodellamento della parete vasale, in particolare a livello della tonaca media. SCOPO DEL LAVORO Lo studio, effettuato in collaborazione con la clinica di Neurochirurgia dell¡¯Ospedale ¡°Santa Chiara¡± di Pisa, prevede la valutazione del coinvolgimento di alcuni markers biologici nello sviluppo dell¡¯aneurisma cerebrale e le possibili interazioni tra i markers coinvolti. MATERIALI E METODI I volontari appartengono ai seguenti gruppi sperimentali: Controllo (n=10), Aneurisma non sanguinante (n=10) e Aneurisma sanguinante (n=16). I campioni di plasma prelevati sono stati utilizzati per la valutazione della concentrazione dei markers biologici (MMP-9, TIMP-1, IL-1¦Â, IL-18 e VEGF) attraverso l¡¯utilizzo di saggi immunoenzimatici (ELISA-sandwich). RISULTATI I livelli di MMP-9 aumentano significativamente sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (223.38 ¡À 31.6 vs 92.8 ¡À 21.7 ng/ml con p < 0.01) rispetto al controllo sia nel gruppo con aneurisma sanguinante (304.16 ¡À 48.6 vs 92.8 ¡À 21.7 ng/ml con p < 0.05). Non si ¨¨ invece osservata una significativa differenza tra i gruppi con aneurisma sanguinante e non sanguinante. I livelli plasmatici del TIMP-1 rimangono pressoch¨¦ invariati nei tre gruppi presi in esame: nel gruppo controllo si ha una media di 120.17 ng/ml (SD = 15.21), nel gruppo con aneurisma non sanguinante la media ¨¨ di 135.73 ng/ml (SD = 21.91) mentre nel gruppo con aneurisma sanguinante ¨¨ di 128.69 ng/ml (SD = 13.37). Nel rapporto MMP-9/TIMP-1 si ha un aumento significativo rispetto al gruppo controllo, sia nel gruppo dell¡¯aneurisma non sanguinante (3.27 ¡À 0.76 vs 0.96 ¡À 0.33 ng/ml con p < 0.01) che nel gruppo dell¡¯aneurisma sanguinante (3.38 ¡À 0.63 vs 0.96 ¡À 0.33 ng/ml con p < 0.05). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. I livelli di IL-1¦Â mostrano un aumento significativo di tale parametro rispetto al controllo sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (74.5 ¡À 21.27 vs 19.67 ¡À 3.78 pg/ml con p < 0.05) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (58.06 ¡À 16.5 vs 19.67 ¡À 3.78 pg/ml con p < 0.05). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante (p = 0.053). I livelli di IL-18 non evidenziano un aumento significativo rispetto al gruppo controllo, sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (215.6 ¡À 55.96 vs 104.8 ¡À 21.80 pg/ml con p = 0.065) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (305.4 ¡À 95.48 vs 104.8 ¡À 21.80 pg/ml con p = 0.075). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. Infine i livelli di VEGF hanno mostrato un aumento significativo di tale parametro sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (45.60 ¡À 6.03 vs 26.08 ¡À 4.86 pg/ml con p < 0.01) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (94.71 ¡À 36.18 vs 26.08 ¡À 4.86 pg/ml con p < 0.05) rispetto al controllo. Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. Sono state inoltre osservate delle correlazioni tra i markers indagati: L¡¯IL-1¦Â ha evidenziato una correlazione positiva significativa con l¡¯MMP-9 (p = 0.00215) e non significativa con il VEGF (p = 0.28). L¡¯IL-18 ha una correlazione positiva significativa con l¡¯MMP-9 (p = 0.0024) e con l¡¯IL-1¦Â (p = 0.0017) e non significativa con VEGF (p = 0.62). Infine il VEGF presenta una correlazione positiva significativa solo con l¡¯MMP-9 (p = 0.011). CONCLUSIONI Sulla base dei dati emersi da questo studio ¨¨ possibile affermare che tra i meccanismi maggiormente coinvolti nello sviluppo di un aneurisma vi ¨¨ l¡¯aumento di citochine proinfiammatorie e l¡¯upregulation del sistema dell¡¯MMP, si pu¨° inoltre ipotizzare l¡¯esistenza di segnali precoci la cui espressione viene downregolata con il procedere della patologia. Infine, possibili fattori coinvolti nello sviluppo dell¡¯aneurisma sono molecole ad attivit¨¤ modulatoria e proinfiammatoria indiretta come IL-18

Engineered platforms for the controlled release of biomolecules for tissue regeneration

La tesi ha come oggetto la creazione di uno scaffold di PCL/PLGA che permetta un'angiogenesi controllata nello spazio e nel tempo. Per fare ciò ci si è avvalsi di test in vitro ed in vivo. Inoltre, è stato creato un dispositivo di microfluidica per valutare gli effetti di un gradiente di fattori di crescita su cellule endoteliali per simulare ciò che accade nei normali processi di rigenerazione tissutal